專利名稱：排除假陰性的pcr 檢測(cè)方法和其中使用的引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于PCR法的微生物檢測(cè)方法。特別是，本發(fā)明涉及一種微生物檢測(cè)方法，其采用針對(duì)作為檢測(cè)對(duì)象的微生物中的特異基因而設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)并根據(jù)PCR產(chǎn)物的有無定性地判定微生物是否存在。
背景技術(shù)：
就啤酒制品等樣品而言，進(jìn)行微生物檢測(cè)在擔(dān)保品質(zhì)方面是非常重要的。作為樣品中可能存在的微生物的檢測(cè)方法，已知有幾種方法。采用PCR進(jìn)行判定為樣品中的有害微生物的檢測(cè)法之一，其作為簡(jiǎn)便、迅速而且準(zhǔn)確的方法廣泛應(yīng)用于啤酒、其他食品等樣品中的微生物檢測(cè)中。利用了 PCR的檢測(cè)方法中，為了提高檢測(cè)的靈敏度和特異性，研究了例 如濃縮樣品、使用特異性高的探針或者引物、組合多個(gè)探針或者引物、提高基因提取的效率等。具體而言，已知有通過在引起食物中毒的菌種的菌種鑒定方法中組合使用多個(gè)特異的探針來回避假陽性和假陰性的方法(文獻(xiàn)I);在軍團(tuán)菌屬的檢測(cè)方法中通過在濃縮樣品以及基因的提取方法方面下功夫而提高靶基因的提取效率、回避假陰性的方法(文獻(xiàn)2);在S. pastrianus的基于LAMP法的檢測(cè)方法中，通過使用近親菌種中沒有的特異性高的引物提聞檢測(cè)靈敏度以及精度的方法(文獻(xiàn)3)等。

發(fā)明內(nèi)容
通過PCR進(jìn)行微生物檢測(cè)時(shí)，為了確認(rèn)從微生物試樣中確實(shí)提取出基因組DNA，有時(shí)對(duì)管家基因(例如細(xì)菌的16S rDNA、酵母的26S rDNA)也進(jìn)行PCR反應(yīng)。由于管家基因與通常的基因相比拷貝數(shù)多，用提取自同一試樣的基因組DNA進(jìn)行靶基因以及管家基因的PCR時(shí)，如果從菌體提取的DNA濃度低，有時(shí)只有管家基因能被檢測(cè)出。結(jié)果，即便制品等中混入了有害微生物也會(huì)判定為陰性，致使品質(zhì)管理方面產(chǎn)生問題。因此，必須構(gòu)建該微生物混入制品等時(shí)不進(jìn)行假陰性判定而采用PCR法就能準(zhǔn)確檢測(cè)的PCR檢測(cè)系統(tǒng)。因此，期望的是將應(yīng)該檢測(cè)出的對(duì)象基因的檢測(cè)靈敏度和用于確認(rèn)從菌體中的DNA提取的管家基因的檢測(cè)靈敏度設(shè)為同等。本發(fā)明是一種微生物檢測(cè)方法，所述微生物檢測(cè)方法包括應(yīng)用用于擴(kuò)增樣品中可能存在的應(yīng)該檢測(cè)出的微生物的靶基因序列的第I引物對(duì)以及用于擴(kuò)增上述樣品中的陽性對(duì)照基因序列的第2引物對(duì)進(jìn)行PCR反應(yīng)，在上述陽性對(duì)照基因序列被擴(kuò)增而上述靶基因序列不被擴(kuò)增時(shí)判定為上述微生物不存在，在上述陽性對(duì)照基因序列被擴(kuò)增而且上述靶基因序列也被擴(kuò)增時(shí)判定為上述微生物存在；其中，上述PCR反應(yīng)中的上述靶基因的檢測(cè)靈敏度和上述陽性對(duì)照基因的檢測(cè)靈敏度是同等的。更具體而言，本發(fā)明為上述方法，其中，第I引物對(duì)中的至少I個(gè)引物中相對(duì)于靶基因序列的互補(bǔ)序列存在變異、和/或第2引物對(duì)中的至少I個(gè)引物中相對(duì)于陽性對(duì)照基因序列的互補(bǔ)序列存在變異；優(yōu)選存在核苷酸向引物的插入。特別是，本發(fā)明為上述方法，其中，樣品中可能存在的應(yīng)該檢測(cè)出的微生物為糖化酵母，靶基因?yàn)镾TA1，陽性對(duì)照基因?yàn)榻湍傅?6S rDNA。更具體而言，本發(fā)明為上述發(fā)明，其中，第I引物對(duì)為如下的一對(duì)引物包含序列號(hào)I的序列的引物以及包含序列號(hào)3的序列的引物；和/或第2引物對(duì)為如下的一對(duì)引物包含序列號(hào)4的序列的引物以及包含序列號(hào)5的序列的引物。另外，本發(fā)明為一種引物組，所述引物組包含用于擴(kuò)增樣品中可能存在的微生物的靶基因序列的第I引物對(duì)、以及用于擴(kuò)增上述樣品中的陽性對(duì)照基因序列的第2引物對(duì)；同一 PCR反應(yīng)條件下上述靶基因的檢測(cè)靈敏度和上述陽性對(duì)照基因的檢測(cè)靈敏度是同等的。更具體而言，本發(fā)明為上述上述引物組，其中，上述第I引物對(duì)中的至少I個(gè)引物中相對(duì)于靶基因序列的互補(bǔ)序列存在變異；和/或第2引物對(duì)中的至少I個(gè)引物中相對(duì)于陽性對(duì)照基因序列的互補(bǔ)序列存在變異，優(yōu)選存在核苷酸向引物的插入。 特別是，本發(fā)明也為上述發(fā)明，其中，第I引物對(duì)為如下的一對(duì)引物包含序列號(hào)I的序列的引物以及包含序列號(hào)3的序列的引物；和/或第2弓丨物對(duì)為如下的一對(duì)弓丨物包含序列號(hào)4的序列的引物以及包含序列號(hào)5的序列的引物。


圖I表示糖化酵母(S. diastaticus) (A)和釀酒酵母(S. cerevisiae) (B)中的葡糖淀粉酶基因(STAl)的構(gòu)造差異，以及對(duì)應(yīng)STAl基因擴(kuò)增用引物(F4和R6)的區(qū)域。另夕卜，圖I中表示，糖化酵母的STAl具有釀酒酵母的S2、S1和SGA的一部分融合而成的構(gòu)造。F4、F6分別表示實(shí)施例I中使用的引物STA1-F4、STA1-R6的位置。圖2表示使用與模板完全互補(bǔ)的引物擴(kuò)增陽性對(duì)照基因序列和靶基因序列時(shí)
(A)、以及使用包含與模板序列錯(cuò)配的引物擴(kuò)增對(duì)照基因序列和靶基因序列時(shí)(B)的擴(kuò)增結(jié)果。(A)、(B)中，條帶I和5表示將樣品原液供于PCR時(shí)擴(kuò)增而得的DNA片段，條帶2和6表示將樣品10倍稀釋液供于PCR時(shí)擴(kuò)增而得的DNA片段，條帶3和7表示將樣品100倍稀釋液供于PCR時(shí)擴(kuò)增而得的DNA片段，條帶4和8表示將樣品1000倍稀釋液供于PCR時(shí)擴(kuò)增而得的DNA片段。條帶I 4表示陽性對(duì)照基因26S rDNA的擴(kuò)增結(jié)果，條帶5 8表示靶基因STAl的擴(kuò)增結(jié)果。用于解決問題的方案本發(fā)明的具體的一方式為如下方法進(jìn)行包含從樣品(例如通過瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)從制品中分離的菌種的菌落)中的DNA提取、使用針對(duì)作為檢測(cè)對(duì)象的微生物特有的基因設(shè)計(jì)的引物的PCR、緊接著的PCR反應(yīng)產(chǎn)物的電泳的一連串操作，以上述PCR有無擴(kuò)增產(chǎn)物為基準(zhǔn)，定性地判定有無微生物的混入。本發(fā)明包含使用用于擴(kuò)增樣品中可能存在的應(yīng)該檢測(cè)出的微生物的靶基因序列的第I引物對(duì)、以及用于擴(kuò)增上述樣品中的陽性對(duì)照基因序列的第2引物對(duì)分別進(jìn)行PCR反應(yīng)。本發(fā)明中，上述陽性對(duì)照基因?yàn)槲⑸锘驎r(shí)，上述樣品中可能存在的應(yīng)該檢測(cè)出的微生物和保有上述陽性對(duì)照基因的微生物通常不同，但是也可以相同。另外，上述樣品中可能存在的應(yīng)該檢測(cè)出的微生物和保有上述陽性對(duì)照基因的微生物即便不同，兩微生物為近緣種時(shí)或陽性對(duì)照基因的種間保守性較高時(shí)，上述陽性對(duì)照基因的序列與應(yīng)該檢測(cè)出的微生物的對(duì)應(yīng)基因的序列有時(shí)也相同。上述樣品中的陽性對(duì)照基因序列和用于擴(kuò)增上述對(duì)象基因序列的第2引物對(duì)可以選擇已經(jīng)確認(rèn)了在一定條件下進(jìn)行PCR時(shí)有擴(kuò)增產(chǎn)物生成的序列和引物對(duì)。例如樣品為啤酒時(shí)，上述陽性對(duì)照基因優(yōu)選從用于啤酒釀造的酵母的管家基因中選擇，根據(jù)樣品的性質(zhì)，也可以使用包含細(xì)菌、曲霉在內(nèi)的菌類等的管家基因等。適合作為本發(fā)明的陽性對(duì)照基因的管家基因，包括細(xì)菌的16S rDNA、酵母的18S rDNA、26S rDNA、act I以及GAPDH，但不限定于這些。能夠根據(jù)本發(fā)明來檢測(cè)的微生物包括酵母，特別是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、Saccharomycespastrianus、貝酵母(Saccharomyces bayanus)、異常畢赤酵母(Pichia anomala)、Pichiajadinii、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces Iactis)、異常德克拉酵母(Dekkera anomala)>Dekkera bruxellensis、德爾布有抱圓酵母(Torulasporadelbrueckii )、東方伊薩酵母(Issatchenkia orientalis)、Candidaishiwadae> Shizosaccharomyces pombe、路氏酵母(Saccharomycodes Iudwigii),但不限定于這些。另一方面，作為樣品中可能存在的應(yīng)該檢測(cè)出的微生物的靶基因序列，例如，能夠選擇上述樣品中被認(rèn)為有害的微生物的特異性基因序列，第I引物對(duì)能夠選擇特異地?cái)U(kuò)增 該序列的弓I物對(duì)。例如樣品為啤酒時(shí),這樣的有害微生物包括糖化酵母(S. diastatiCUS )，靶基因序列包括STAl (葡糖淀粉酶基因)。糖化酵母的STAl基因具有釀酒酵母的3個(gè)不同DNA區(qū)域(SI、S2、SGA)的各自一部分融合而成的構(gòu)造(圖1)，而啤酒釀造用酵母沒有該構(gòu)造，因此通過選擇STAl基因作為靶基因，能夠?qū)⑻腔湍?啤酒樣品中可能含有的)與啤酒釀造用酵母區(qū)別檢測(cè)。在樣品為啤酒且應(yīng)該檢測(cè)出的微生物為糖化酵母時(shí)，第I引物對(duì)優(yōu)選包含序列號(hào)I和序列號(hào)3記載的序列的引物對(duì)(擴(kuò)增酵母的26S rDNA序列)，第2引物對(duì)優(yōu)選包含序列號(hào)4和序列號(hào)5的序列的引物對(duì)(擴(kuò)增糖化酵母的STAl基因序列的引物對(duì))。本發(fā)明的一方式中，以由作為檢測(cè)對(duì)象的微生物和保有上述陽性對(duì)照基因的微生物中的任一者中提取核酸的條件對(duì)樣品進(jìn)行前處理。該前處理?xiàng)l件取決于微生物，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用這些微生物的已知的核酸提取條件。既可以將各微生物的適宜的核酸條件組合對(duì)樣品進(jìn)行前處理，也可以對(duì)各微生物在適宜條件下依次分階段地對(duì)樣品進(jìn)行前處理。本發(fā)明中，為了使上述PCR反應(yīng)中的上述靶基因的檢測(cè)靈敏度和上述陽性對(duì)照基因的檢測(cè)靈敏度為同等，使第I引物對(duì)中的至少I個(gè)引物中相對(duì)于靶基因序列的互補(bǔ)序列存在變異、和/或使第2引物對(duì)中的至少I個(gè)引物中相對(duì)于陽性對(duì)照基因序列的互補(bǔ)序列存在變異。結(jié)果，與上述靶基因序列或者與上述陽性對(duì)照基因序列之間存在錯(cuò)配，或者與上述靶基因序列或上述陽性對(duì)照基因序列之間的互補(bǔ)性發(fā)生變化。該變異能夠通過引物中核苷酸的插入、缺失或者置換而產(chǎn)生。特別是，本發(fā)明的一實(shí)施方式中，上述變異是由在引物中插入核苷酸而產(chǎn)生的。另外，該變異也能通過改變堿基之間的氫鍵或者改變空間位阻的非天然核苷酸來產(chǎn)生。一般地，作為陽性對(duì)照基因選擇管家基因，由于管家基因的拷貝數(shù)一般比較多，上述變異優(yōu)選在第2引物對(duì)中產(chǎn)生，通過核苷酸的插入、缺失或者置換產(chǎn)生錯(cuò)配是簡(jiǎn)便的。利用PCR的微生物檢測(cè)法中，一般設(shè)定為固定PCR條件并按常規(guī)方法進(jìn)行，通過將PCR條件固定為同一條件，在第I引物對(duì)或者第2引物對(duì)、優(yōu)選在第2引物對(duì)中進(jìn)行各種核苷酸的插入、缺失或者置換，使用這樣的引物對(duì)進(jìn)行PCR，對(duì)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行解析，由此能夠選擇靶基因的檢測(cè)靈敏度和上述陽性對(duì)照基因的檢測(cè)靈敏度變?yōu)橥鹊淖钸m的變異、特別是能夠選擇核苷酸的插入、缺失或者置換。通過將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳并比較擴(kuò)增產(chǎn)物的量能夠簡(jiǎn)便地解析擴(kuò)增產(chǎn)物量，必要時(shí)還可以通過實(shí)時(shí)PCR解析擴(kuò)增產(chǎn)物的量。本發(fā)明中，PCR反應(yīng)中靶基因的檢測(cè)靈敏度和陽性對(duì)照基因的檢測(cè)靈敏度為同等可定義為制作樣品的2倍稀釋系列、5倍稀釋系列、或者10倍稀釋系列等，對(duì)于這些稀釋樣品，除了樣品以外的條件均相同地進(jìn)行PCR并用凝膠電泳使擴(kuò)增產(chǎn)物泳動(dòng)時(shí)，用目視或者測(cè)定儀器檢測(cè)不到條帶的稀釋倍率對(duì)于靶基因和陽性對(duì)照基因是同一的。通過實(shí)時(shí)PCR解析時(shí)，靶基因的檢測(cè)靈敏度和陽性對(duì)照基因的檢測(cè)靈敏度為同等可定義為制作例如上述的樣品稀釋系列，對(duì)于這些稀釋樣品，除了樣品以外的條件均相同地進(jìn)行PCR，擴(kuò)增量在規(guī)定時(shí)間內(nèi)低于測(cè)定裝置的檢測(cè)限的(檢測(cè)不到擴(kuò)增)稀釋倍率對(duì)于靶基因和陽性對(duì)照基因是同一的。這樣，在PCR反應(yīng)中的靶基因的檢測(cè)靈敏度和陽性對(duì)照基因的檢測(cè)靈敏度為同等的條件下，應(yīng)用用于擴(kuò)增樣品中可能存在的微生物的靶基因序列的第I引物對(duì)以及用于擴(kuò) 增上述樣品中的陽性對(duì)照基因序列的第2引物對(duì)分別進(jìn)行PCR反應(yīng)，在上述陽性對(duì)照基因序列被擴(kuò)增且上述靶基因序列不被擴(kuò)增時(shí)判定為上述微生物不存在，在上述陽性對(duì)照基因序列被擴(kuò)增且上述靶基因序列也被擴(kuò)增時(shí)判定為上述微生物存在。通過此舉，實(shí)際上能夠回避假陰性誤判，即可以避免即使保有上述靶基因序列的微生物在樣品中存在也誤判為不存在(陰性)。以下的實(shí)施例表示的是為了幫助理解本發(fā)明的特定的方式，本發(fā)明的范圍當(dāng)然不受以下的實(shí)施例限制。實(shí)施例I作為靶基因，著眼于糖化酵母的葡糖淀粉酶基因(STA1)?？梢哉J(rèn)為，STAl是處于釀酒酵母基因組DNA上的不同位置上的3個(gè)DNA區(qū)域(S1、S2、SGA)在進(jìn)化的過程中融合而成的，通過在圖I那樣的區(qū)域中設(shè)計(jì)引物，能夠只特異地檢測(cè)出糖化酵母。作為管家基因，選擇包括糖化酵母在內(nèi)的一般酵母中的共有基因26S rDNA。針對(duì)反向引物(CYEAT-R1 ;序列號(hào)2)，設(shè)計(jì)了在表I的下劃線所示位點(diǎn)插入了腺嘌呤(a)以及胸腺嘧啶(Tt)的序列(CYEAST-R2 ;序列號(hào)3)。引物合成委托給OperonBiotechnologies K. K.。用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato Dextrose Agar, PDA)培養(yǎng)基,在25°C培養(yǎng)由美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(American TypeCulture Collection, ATCC)購入的糖化酵母ATCC130073 5天。用滅菌槍頭米集微量的在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落的一部分,將其懸浮于50 μ IPrepMan Ultra S ample Preparation Reagent (AppliedBiosystems)中。用相同的試劑制備稀釋直至103倍為止的10倍梯度稀釋系列之后，按照提供者制定的說明書進(jìn)行DNA的提取。使用制備的糖化酵母的梯度稀釋DNA，調(diào)查到哪一稀釋系列為止能被檢測(cè)出來。作為26S rDNA擴(kuò)增用引物，正向引物使用CYEAST-F1 (序列號(hào)1)，反向引物使用沒有錯(cuò)配的CYEAST-R1 (序列號(hào)2)和有錯(cuò)配的CYEAST-R2 (序列號(hào)3)(表I)。作為STAl基因擴(kuò)增用的引物，使用STA1-F4作為正向引物，使用STA1-R6作為反向引物(表2)。表I
權(quán)利要求
1.一種微生物檢測(cè)方法，所述微生物檢測(cè)方法包括應(yīng)用用于擴(kuò)增樣品中可能存在的微生物的靶基因序列的第I引物對(duì)以及用于擴(kuò)增所述樣品中的陽性對(duì)照基因序列的第2引物對(duì)進(jìn)行PCR反應(yīng)，在所述陽性對(duì)照基因序列被擴(kuò)增而所述靶基因序列不被擴(kuò)增時(shí)判定為所述微生物不存在，在所述陽性對(duì)照基因序列被擴(kuò)增而且所述靶基因序列也被擴(kuò)增時(shí)判定為所述微生物存在；其中，所述PCR反應(yīng)中的所述靶基因的檢測(cè)靈敏度和所述陽性對(duì)照基因的檢測(cè)靈敏度是同等的。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，第I引物對(duì)中的至少I個(gè)引物中相對(duì)于靶基因序列的互補(bǔ)序列存在變異；和/或第2引物對(duì)中的至少I個(gè)引物中相對(duì)于陽性對(duì)照基因序列的互補(bǔ)序列存在變異。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，微生物為糖化酵母，靶基因?yàn)镾TAl，陽性對(duì)照基因?yàn)榻湍傅?6S rDNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，變異為核苷酸在第I引物對(duì)或者第2引物對(duì)中的至少I個(gè)引物中的插入。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，第I引物對(duì)為如下一對(duì)引物包含序列號(hào)I的序列的引物以及包含序列號(hào)3的序列的引物。
6.根據(jù)權(quán)利要求2 5的任一項(xiàng)所述的方法，第2引物對(duì)為如下一對(duì)引物包含序列號(hào)4的序列的引物以及包含序列號(hào)5的序列的引物。
7.一種引物組，所述引物組包含用于擴(kuò)增樣品中可能存在的微生物的靶基因序列的第I引物對(duì)以及用于擴(kuò)增所述樣品中的陽性對(duì)照基因序列的第2引物對(duì)；同一 PCR反應(yīng)條件下所述靶基因的檢測(cè)靈敏度和所述陽性對(duì)照基因的檢測(cè)靈敏度是同等的。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的引物組，第I引物對(duì)中的至少I個(gè)引物中相對(duì)于靶基因序列的互補(bǔ)序列存在變異；和/或第2引物對(duì)中的至少I個(gè)引物中相對(duì)于陽性對(duì)照基因序列的互補(bǔ)序列存在變異。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的引物組，變異為核苷酸在第I引物對(duì)或者第2引物對(duì)中的至少I個(gè)引物中的插入。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的引物組，第I引物對(duì)為如下的一對(duì)引物包含序列號(hào)I的序列的引物以及包含序列號(hào)3的序列的引物。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或者10所述的引物組，第2引物對(duì)為如下的一對(duì)引物包含序列號(hào)4的序列的引物以及包含序列號(hào)5的序列的引物。
12.—種微生物檢測(cè)用PCR試劑盒，其包含權(quán)利要求7 11的任一項(xiàng)所述的引物組。
全文摘要
本發(fā)明提供一種在微生物混入制品等時(shí)不進(jìn)行假陰性判定而采用PCR法就能準(zhǔn)確檢測(cè)的PCR檢測(cè)系統(tǒng)。本發(fā)明提供一種微生物檢測(cè)方法，所述微生物檢測(cè)方法包括應(yīng)用用于擴(kuò)增樣品中可能存在的微生物的靶基因序列的第1引物對(duì)以及用于擴(kuò)增上述樣品中的陽性對(duì)照基因序列的第2引物對(duì)進(jìn)行PCR反應(yīng)，其中，上述PCR反應(yīng)中的上述靶基因的檢測(cè)靈敏度和上述陽性對(duì)照基因的檢測(cè)靈敏度是同等的。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK102859002SQ20118002004
公開日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2011年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月21日
發(fā)明者下津智志, 鈴木康司 申請(qǐng)人:朝日啤酒株式會(huì)社