專利名稱：改進地生產(chǎn)5’-黃苷一磷酸和5’-鳥苷一磷酸的微生物和使用其的5’-黃苷一磷酸和5’-鳥 ...的制作方法
改進地生產(chǎn)5’-黃苷一磷酸和5’-鳥苷一磷酸的微生物和使用其的5’ -黃苷一磷酸和5’ -鳥苷一磷酸的生產(chǎn)方法
背景技術(shù)：
I、發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及具有與其內(nèi)源活性相比增加的脯氨酸脫氫酶活性的棒狀菌微生物，通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的微生物從培養(yǎng)液生產(chǎn)5’ -黃苷一磷酸或5’ -鳥苷一磷酸(5’ -guaninemonophosphate)的方法,和該微生物用于生產(chǎn)5’ -黃苷一磷酸或5’ -鳥苷一磷酸的用途。2、相關(guān)技術(shù)的描述5’-鳥苷一磷酸(GMP)是與肌苷一磷酸(IMP) —起廣泛用作香味增強劑的食品添加劑。GMP其本身已知賦予類似蘑菇的味道，并且當(dāng)與谷氨酸一鈉(MSG)結(jié)合時增加其的味道強度。其通常與頂P結(jié)合使用。 迄今已知的制備GMP的方法的例子包括(I)酶降解從酵母細胞提取的RNA(核糖核酸)，(2) GMP直接微生物發(fā)酵，(3)鳥苷微生物發(fā)酵，隨后化學(xué)磷酸化，(4)鳥苷微生物發(fā)酵，隨后酶促磷酸化，(5)黃苷5’ - 一磷酸鹽(XMP)微生物發(fā)酵，隨后通過棒狀菌菌株轉(zhuǎn)變?yōu)镚MPjP ￠)XMP微生物發(fā)酵，隨后通過大腸桿菌(Escherichiacoli)將XMP轉(zhuǎn)變?yōu)镚MP。在它們中，方法(I)具有有限的材料供應(yīng)的困難并且是在經(jīng)濟上無益的，方法(2)受到由于GMP的膜通透性具有低產(chǎn)率的缺點。因此，其他方法廣泛用于工業(yè)應(yīng)用中。在上述方法中，當(dāng)GMP通過將XMP轉(zhuǎn)變?yōu)镚MP而產(chǎn)生時，要求增加XMP生產(chǎn)率或連續(xù)供應(yīng)在GMP轉(zhuǎn)變期間用作輔因子的ATP。為了增加XMP生產(chǎn)率，常規(guī)方法通過突變產(chǎn)生耐鳥苷或XMP微生物。例如，韓國專利申請?zhí)?0-1991-018061公開了能夠以高產(chǎn)率生產(chǎn)XMP的XMP脫氨基酶(aminase)非活性菌株，其對于腺嘌呤和鳥嘌呤是半營養(yǎng)缺陷型的，耐受鳥苷類似物并對溶菌酶一一種破壞細胞壁的酶——非常敏感。此外，韓國專利申請?zhí)?0-2001-000513公開了能夠在培養(yǎng)基中以高濃度直接積聚XMP的產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)的菌株和利用其生產(chǎn)XMP的方法,其中菌株通過如下制備用UV光照射母微生物，用誘變劑N-甲基-N’ -硝基-N-亞硝基胍(NTG)處理，并選擇耐受正纈氨酸的突變體，所述正纈氨酸為影響XMP生物合成的纈氨酸類似物。此外，韓國專利申請?zhí)?0-2008-006537描述了增加XMP產(chǎn)率的方法，其中涉及XMP生物合成的purN和purH基因被修飾。如以上所提及的，對于將XMP轉(zhuǎn)變?yōu)镚MP而言，關(guān)鍵是供應(yīng)在GMP轉(zhuǎn)變期間用作輔因子的ATP。用于XMP轉(zhuǎn)變?yōu)镚MP的大部分ATP由產(chǎn)XMP菌株供應(yīng)。在該轉(zhuǎn)變方法中，二甲苯增加了 ATP和XMP的膜通透性，并且向培養(yǎng)基添加二甲苯允許ATP和XMP滲入產(chǎn)GMP的菌株，隨后將XMP轉(zhuǎn)變?yōu)镚MP。因此，GMP生產(chǎn)的方法采取增加ATP生產(chǎn)率的策略。從XMP轉(zhuǎn)變?yōu)镚MP由以下反應(yīng)式表示
XMP + ATP + NH^------------------>GMP 十 AMP + PPi
XMP脫氨基酶即，作為輔因子的ATP的連續(xù)供應(yīng)對于轉(zhuǎn)變過程是必要的，其中XMP首先被產(chǎn)生并隨后通過向包括XMP和微生物的培養(yǎng)基添加具有XMP脫氨基酶活性的酶或微生物轉(zhuǎn)變?yōu)镚MP。因此，提高產(chǎn)XMP菌株的ATP生產(chǎn)率是非常重要的。在轉(zhuǎn)變過程中產(chǎn)生的AMP被再次用作ATP生產(chǎn)的底物。實際上，腺嘌呤基核苷酸對于在轉(zhuǎn)變過程中的ATP生產(chǎn)是循環(huán)的。因此，XMP生產(chǎn)率的改進對GMP的高生產(chǎn)產(chǎn)率是必要的，并且通過增加ATP生產(chǎn)率可改進XMP生產(chǎn)率。基于該背景，本發(fā)明人已經(jīng)做了很多努力以開發(fā)增加ATP生產(chǎn)率的方法。結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)提高的脯氨酸脫氫酶活性通過增加ATP生產(chǎn)改進了 XMP和GMP的生產(chǎn)產(chǎn)率。因此，本發(fā)明人鑒定了負(fù)責(zé)改進XMP生產(chǎn)產(chǎn)率的基因，設(shè)計了包括該基因的載體，并制備了利用該載體轉(zhuǎn)化的棒狀菌屬的微生物，并且他們發(fā)現(xiàn)XMP或GMP可以高產(chǎn)率由微生物生產(chǎn)，由此完成本發(fā)明
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供用于生產(chǎn)5’ -黃苷一磷酸或5’ -鳥苷一磷酸的棒狀菌微生物，其具有與其內(nèi)源活性相比增加的脯氨酸脫氫酶活性。本發(fā)明的另一個目的是提供通過培養(yǎng)微生物從培養(yǎng)液生產(chǎn)5’ -黃苷一磷酸或5’ -鳥苷一磷酸的方法。本發(fā)明的另一個目的是提供該微生物用于生產(chǎn)5’ -黃苷一磷酸或5’ -鳥苷一磷酸的用途。本發(fā)明的效果由于改進的脯氨酸脫氫酶的活性，本發(fā)明的棒狀菌微生物能夠以比常規(guī)產(chǎn)XMP和GMP微生物高得多的產(chǎn)率生產(chǎn)XMP或GMP。因此，利用本發(fā)明的微生物可以以高產(chǎn)率生產(chǎn)XMP 或 GMP。


圖I是示意圖,其顯示了通過將putA基因克隆入pDZ載體制備的pDZ-putA載體的結(jié)構(gòu)。
優(yōu)選實施方式詳述在一方面中，為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明涉及具有與其內(nèi)源活性相比增加的脯氨酸脫氫酶活性的棒狀菌微生物。優(yōu)選地，本發(fā)明提供具有與其內(nèi)源活性相比增加的脯氨酸脫氫酶活性的棒狀菌微生物，以顯示5’ -黃苷一磷酸(XMP)和5’ -鳥苷一磷酸(GMP)的改進的生產(chǎn)率。如本文所用的，術(shù)語“脯氨酸脫氫酶”是脯氨酸脫氫酶/ δ -I-吡咯啉-5-羧酸脫氫酶，并且已知參與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑，精氨酸和脯氨酸代謝途徑。本發(fā)明涉及通過增加相應(yīng)酶的活性顯示XMP和GMP的改進的生產(chǎn)產(chǎn)率的微生物。如本文所用的，術(shù)語“內(nèi)源活性”指的是在野生型微生物中固有的酶活性，和術(shù)語“與內(nèi)源活性相比增加”指與固有活性相比增加的酶活性。本發(fā)明增加的酶活性包括基因產(chǎn)物的內(nèi)源活性的改進、通過內(nèi)部或外部因子的內(nèi)源基因的擴增、基因拷貝數(shù)的增加或通過引入外來基因造成的活性增加，以及酶本身活性的增加，以實現(xiàn)超過固有功能的作用。增加的酶活性可非限制地通過在現(xiàn)有技術(shù)中已知的任何方法實現(xiàn)，例如，基因拷貝數(shù)的增加、啟動子的置換或修飾，和通過突變造成的酶活性的增加，但該方法不限于這些實例。通過本發(fā)明增加活性的脯氨酸脫氫酶可由棒狀菌的putA基因進行編碼。任何衍生物或類似物可被包括在本發(fā)明中，只要其是生物學(xué)上等同的基因或?qū)?yīng)于該基因。任何基因被包括在本發(fā)明中，只要其顯示與putA基因的活性基本上相同或相似的生物活性，并且具有與PutA基因序列優(yōu)選70%或更高、更優(yōu)選80%或更高、甚至更優(yōu)選90%或更高、甚至進一步更優(yōu)選95%或更高和最優(yōu)選98%或更高的同源性。優(yōu)選地，本發(fā)明的putA基因可由SEQ ID NO. 7的核苷酸序列編碼。當(dāng)基因的拷貝數(shù)通過內(nèi)部或外部因子增加時，增加的拷貝數(shù)可根據(jù)需要和目的容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。內(nèi)源基因的擴增也可利用本領(lǐng)域已知的方法進行，例如，通過在合適的選擇壓力下進行培養(yǎng)，但內(nèi)源基因的擴增方法不限于該實例。在本發(fā)明的優(yōu)選實例中，將攜帶編碼脯氨酸脫氫酶的基因的載體引入棒狀菌微生物，以產(chǎn)生具有超過內(nèi)源活性的提高的轉(zhuǎn)化微生物。
本發(fā)明的“棒狀菌微生物”可非限制地為任何菌株，只要其在本領(lǐng)域是已知的并屬于棒狀菌屬。優(yōu)選地，其例子可包括產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)、谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)、黃色短桿菌(Brevibacterium fIavum)和乳酸發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum),但可用于本發(fā)明的棒狀菌屬的微生物的類型不限于這些例子。詳細地，棒狀菌微生物包括產(chǎn)氨棒桿菌ATCC6872、熱產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium thermoaminogenes) FERMBP-1539、谷氨酸棒狀桿菌 ATCC13032、谷氨酸棒狀桿菌R、黃色短桿菌ATCC14067、乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC13869和其衍生物。優(yōu)選的是從產(chǎn)氨棒桿菌KCCM10530轉(zhuǎn)化的產(chǎn)氨棒桿菌KCJ-1346。具體地，本發(fā)明的菌株可為具有并入產(chǎn)氨棒桿菌KCCM10530基因組的putA基因的兩個或多個拷貝的菌株，其由將具有圖I的酶切圖的載體引入其中和通過培養(yǎng)用載體轉(zhuǎn)化的微生物將putA基因的至少兩個拷貝與內(nèi)源基因同源重組產(chǎn)生。如本文所用的，術(shù)語“5’ -黃苷一磷酸(XMP) ”是核酸生物合成中的中間產(chǎn)物并在動物和植物中具有生理意義。同樣，在包括食品工業(yè)、制藥工業(yè)和醫(yī)療工業(yè)在內(nèi)的多種領(lǐng)域中得到應(yīng)用。其為與谷氨酸一鈉協(xié)同用作核酸基香味增強劑的食品添加劑。XMP為嘌呤核苷酸生物合成代謝中的中間產(chǎn)物，并且是生產(chǎn)5’ -鳥苷一磷酸(GMP)的重要原材料。優(yōu)選地，制備和培養(yǎng)具有改進的XMP生產(chǎn)率的轉(zhuǎn)化微生物，以便從培養(yǎng)液獲得XMP。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)與常規(guī)微生物相比轉(zhuǎn)化微生物顯示高大約4. 5%的XMP生產(chǎn)率，并且因此通過使用該微生物可增加XMP生產(chǎn)。如本文所用的，術(shù)語“5’_鳥苷一磷酸(GMP) ”為核苷酸之一，其由鳥苷和磷酸鹽組成。其在核酸中被發(fā)現(xiàn)，并根據(jù)位置分成5’-、3’_和2’-型3種類型。在本發(fā)明中，5’-鳥苷一磷酸作為無色針狀晶體被生產(chǎn)，并在體內(nèi)以游離形式存在。它具有CltlH14N5O8P的分子式。它的鈉鹽提供了香菇味道并因此被用作化學(xué)調(diào)味劑。GMP是提供蘑菇味道的核酸基香味增強劑之一。優(yōu)選地，本發(fā)明確定了利用轉(zhuǎn)化微生物以高產(chǎn)率生產(chǎn)5’ -鳥苷一磷酸的方法，并發(fā)現(xiàn)與利用常規(guī)微生物的方法相比，該方法顯示了大約7%GMP濃度的增加。在本發(fā)明中，包括putA基因的載體被引入以制備具有改進的脯氨酸脫氫酶活性的微生物。關(guān)于本發(fā)明的目的，該載體可包括包含具有基本上等同于putA基因的生物活性的基因的載體。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是顯示基本上等同于或類似于PUtA基因的生物功能的基因的序列可根據(jù)轉(zhuǎn)化微生物的類型和特性而不同。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及包括SEQ ID NO. 7的基因的重組載體，其具有圖I的酶切圖。本發(fā)明的SEQ ID NO. 7的基因為棒狀菌putA基因的野生型核苷酸序列。“putA基因”指編碼脯氨酸脫氫酶的基因。在谷氨酸棒狀桿菌ATCCl3032的例子中，顯示以上功能的基因已知為登錄號NC_006958，并且其mRNA序列已知為YP_224396. I。在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明提供了包括由SEQ ID NO. 7表示的putA基因的重組載體。本發(fā)明的載體可非限制地為通常用于本領(lǐng)域的任何載體，只要它能夠包括PUtA基因。根據(jù)待用宿主的特性優(yōu)選地選擇最優(yōu)載體。優(yōu)選地，該載體為PDZ-putA。在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，SEQ ID NO. 7的putA基因被引入pDZ，由此制備pDZ- putA載體(圖I)。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化微生物可通過將putA基因引入宿主微生物進行制備。優(yōu)選地，將該putA基因克隆入載體，該載體被轉(zhuǎn)化入細胞。該轉(zhuǎn)化可非限制地通過任何方法進行，并且根據(jù)本領(lǐng)域已知的典型方法容易地進行。如本文所用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”指將DNA引入宿主細胞，以便DNA可作為染色體外元件或通過染色體整合復(fù)制，和為由外來DNA攝取引起的人工遺傳改變。典型的轉(zhuǎn)化方法包括CaCl2
沉淀、Hanahan方法-其中結(jié)合DMS0( 二甲亞砜)作為還原材料改進CaCl2沉淀的作用、
電穿孔、磷酸鈣轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、碳化硅纖維介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、土壤桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、硫酸葡聚糖、Iipofectamine和干燥/抑制介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。利用本發(fā)明的pDZ-putA的轉(zhuǎn)化不限于這些實例，而可非限制地利用本領(lǐng)域已知的任何方法實現(xiàn)。如本文所用的，術(shù)語“載體”——其描述了能夠?qū)械鞍纵斔瓦M入合適宿主細胞的重組載體，指的是遺傳構(gòu)建體，其包括基因插入物以被并入宿主細胞染色體這樣的方式連接的必需調(diào)節(jié)元件。優(yōu)選地，包括本發(fā)明的putA基因的重組載體可為包括圖I的酶切圖的重組載體。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，該載體通過轉(zhuǎn)化方法被引入產(chǎn)氨棒桿菌KCCM10530，其隨后在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)以允許通過同源重組由putA基因的兩個拷貝置換內(nèi)源基因，導(dǎo)致putA基因的兩個拷貝插入染色體。因此，被命名為KCJ-1346的新型轉(zhuǎn)化的微生物通過產(chǎn)氨棒桿菌的轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生，其在2010年2月24日以登錄號KCCMl 1068P被保藏在國際保藏單位(International Depository Authority),韓國微生物保藏中心(KCCM, 361-221, Yurim B/D, Hongie-l-dong, Seodaemun-gu, Seoul, Korea)中。根據(jù)本發(fā)明，XMP或GMP可通過上述轉(zhuǎn)化微生物的直接發(fā)酵以高產(chǎn)率在培養(yǎng)基中生產(chǎn)。優(yōu)選地，用于該方法中的微生物為具有改進的脯氨酸脫氫酶活性的微生物，并且載體的putA基因被插入宿主微生物的染色體，由此增加XMP和GMP的生產(chǎn)。優(yōu)選地，用于生產(chǎn)方法中的微生物可為具有登錄號KCCM11068P的微生物。在另一方面,本發(fā)明涉及通過培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的微生物從培養(yǎng)液生產(chǎn)5’ -黃苷一磷酸或5’ -鳥苷一磷酸的方法。優(yōu)選地，本發(fā)明提供生產(chǎn)XMP的方法，其包括培養(yǎng)用包括putA基因的載體轉(zhuǎn)化的菌株，以便獲得XMP的步驟，并也提供了生產(chǎn)GMP的方法，其包括以下步驟(a)培養(yǎng)用包括putA基因的載體轉(zhuǎn)化的菌株；(b)添加XMP脫氨基酶至在步驟(a)中獲得的菌株的培養(yǎng)液；和(c)從步驟(b)的培養(yǎng)液獲得GMP。更優(yōu)選地，提供可通過直接發(fā)酵保藏的微生物在培養(yǎng)基中以高產(chǎn)率直接積聚XMP而生產(chǎn)XMP的方法。另外，該轉(zhuǎn)變過程通過以下進行添加具有XMP脫氨基酶活性的酶或微生物，優(yōu)選大腸桿菌至包括XMP和該轉(zhuǎn)化微生物的培養(yǎng)基，并且隨后，GMP從培養(yǎng)基中分離并純化以便獲得GMP。在本發(fā)明中使用的培養(yǎng)基可非限制地為在本領(lǐng)域中通常使用的任何培養(yǎng)基。優(yōu)選地，該培養(yǎng)基包含葡萄糖作為碳源和任選的合適量的多種其他碳源。對于在培養(yǎng)中的使用，培養(yǎng)基必須達到微生物生長的要求。棒狀菌菌株的培養(yǎng)基是本領(lǐng)域已知的(例如，Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology.WashingtonD. C.，USA, 1981)。所用碳源的例子可包括糖和碳水化合物諸如葡萄糖、半乳糖、蔗糖、阿拉伯糖、麥芽糖、木糖、海藻糖、核糖、乳糖、果糖、麥芽糖、淀粉和纖維素，油類和脂類諸如大豆油、向日葵油、蓖麻油和椰子油，脂肪酸諸如棕櫚酸、硬脂酸和亞麻酸，醇類諸如甘油和乙醇，和有機酸諸如乙酸。這些碳源可單獨使用或結(jié)合使用。所用氮源的例子可包括有機氮源諸如蛋白胨、酵母提取物、牛肉膏、麥芽膏、玉米漿、大豆和尿素，和無機氮源諸如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨。這些氮源也可單獨使用或結(jié)合使用。培養(yǎng)基·中所用磷源的例子可包括磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或相應(yīng)的鈉鹽。另外，培養(yǎng)基可包括生長需要的金屬鹽諸如硫酸鎂和硫酸鐵。除了以上材料，還可進一步包括必需要素諸如氨基酸和維生素或合適的前體。這些材料在培養(yǎng)期間可以以間歇方式或連續(xù)方式被適當(dāng)?shù)靥砑又僚囵B(yǎng)基。在培養(yǎng)期間，培養(yǎng)基的pH可由堿性化合物諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀和氨水，或酸性化合物諸如磷酸和硫酸進行合適地調(diào)節(jié)。消泡劑諸如脂肪酸聚乙二醇酯可用于防止氣泡的產(chǎn)生。培養(yǎng)基可被充入氧氣或含氧氣體(例如，空氣)以保持需氧條件，或被充入氮氣、氫氣或二氧化碳氣體以保持厭氧和微需氧條件。培養(yǎng)溫度通常被保持在20°C至45°C，并且優(yōu)選在30°C至35°C或35°C至37°C。培養(yǎng)可繼續(xù)，直到獲得最大量的期望材料，并優(yōu)選地，它可在10至160小時內(nèi)實現(xiàn)。XMP或GMP可被分泌入培養(yǎng)基或保留在細胞內(nèi)。生產(chǎn)本發(fā)明XMP或GMP的方法包括從細胞或培養(yǎng)基中回收XMP或GMP的步驟。從細胞或培養(yǎng)基中回收XMP或GMP的方法是本領(lǐng)域廣泛已知的?；厥誜MP或GMP的方法可包括過濾、陰離子交換層析、結(jié)晶和HPLCjS不限于此。在仍然另一個方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的微生物用于生產(chǎn)5’ -黃苷一磷酸或5’ -鳥苷一磷酸的用途。生產(chǎn)5’ -黃苷一磷酸或5’ -鳥苷一磷酸的棒狀菌微生物具有與其內(nèi)源活性相比增加的脯氨酸脫氫酶活性，由于脯氨酸脫氫酶活性的改進，該微生物能夠以高產(chǎn)率生產(chǎn)XMP或GMP，由此有效用于生產(chǎn)5’ -黃苷一磷酸或5’ -鳥苷一磷酸。在下文中，將參考實施例更詳細地描述本發(fā)明。然而，這些實施例僅出于說明性的目的，并且本發(fā)明不意欲被這些實施例所限制。實施例I:產(chǎn)XMP菌株產(chǎn)氨棒桿菌KCCM10530衍生的putA的克隆和為了染色體組并入構(gòu)建重組載體(pDZ-putA)在該實施例中，在韓國專利公布號10-2007-94433中公開的pDZ載體用于實施基因的基因組并入。為了利用PDZ載體將基因并入棒狀菌基因組，構(gòu)建在兩端上包括插入序列的PDZ載體，因為與并入染色體的區(qū)域具有同源性的序列必須被包括在pDZ載體中。在該實施例中，為了擴增putA基因，基于NIH基因庫獲得putA基因(NCBIID_3344496)的核苷酸序列?；谠撔蛄校铣蓛蓪σ?SEQ ID NO. I至4)。PCR在高保真DNA聚合酶PfuUltra (Stratagene，USA)的存在下，利用棒狀菌KCCM10530的基因組作為模板，SEQ ID NO. I至4的寡核苷酸作為引物，在25個周期的PCR條件下進行，所述周期由以下組成在95°C下變性30秒；在55°C退火30秒；和在68°C下聚合2分鐘。如此獲得的PCR產(chǎn)物為putA基因(putA-A、putA-B)的兩個拷貝，每個4. 4kb長，其分別利用SEQ ID NO. I和2和SEQ ID NO. 3和4兩個引物組進行擴增。SEQ ID NO. I:CCCAAGCCTTGAGCGCGTCGGTCACTCAACTASEQ ID NO. 2:CAGCCAATCTTGCAGCCAASEQ ID NO. 3:TGAGCGTCGGTCACTCAACTA
SEQ ID NO. 4:CGGGATCCCAGCCAATCTTGCAGTCCAA在用限制酶(putA-AHindIII, putA-B BamHI)處理后，PCR 產(chǎn)物 putA-A、putA-B通過三件式連接(three-piece junction)被插入先前用HindIII和BamHI處理的pDZ載體。最終，獲得其中以串聯(lián)形式克隆的PutA基因的兩個拷貝的重組pDZ-putA載體。圖I為示意圖，其顯示用于并入棒狀菌基因組的PDZ-putA載體的結(jié)構(gòu)。實施例2:putA_插入的菌株的產(chǎn)生pDZ-putA載體構(gòu)建體被轉(zhuǎn)化入KCCM10530菌株并經(jīng)歷與基因組的第二同源重組，以便在基因組上鄰近putA基因的位置上插入putA基因的一個拷貝，如在實施例I中所描述的。因此，獲得產(chǎn)XMP的產(chǎn)氨棒桿菌KCJ-1346，所述棒狀菌在其基因組上具有putA基因的兩個拷貝。被命名為KCJ-1346的新型轉(zhuǎn)化微生物在2010年2月24日以登錄號KCCM11068P被保藏在國際保藏單位(International Depository Authority),韓國微生物保藏中心(KCCM, 361-221, Yurim B/D, Hongie-l-dong, Seodaemun-gu, Seoul, Korea)中。利用 PCR,利用一組引物(SEQ ID NO. 5和6)，確定以串聯(lián)方式插入putA基因的兩個拷貝，所述引物靶向putA基因的兩個拷貝的上游和下游的核苷酸序列。SEQ ID NO. 5:CGAACTACGTGGCACAGTTTGSEQ ID NO. 6:AGCAGGCCATTAAAACGACC實施例3:putA-插入的菌株的XMP生產(chǎn)培養(yǎng)在實施例2中制備的產(chǎn)XMP菌株產(chǎn)氨棒桿菌KCJ-1346，以如下產(chǎn)生XMP。母菌株產(chǎn)氨棒桿菌KCCM10530和菌株KCJ-1346被接種入各自14mL的管中，每個包含3mL的以下種子培養(yǎng)基，并在30°C下溫育20小時，伴隨在200rpm下振蕩。隨后，種子培養(yǎng)物以0. 4mL的量被添加至在各自250mL的角擋板燒瓶(corner-baffle flask)中32mL的以下生產(chǎn)培養(yǎng)基(24mL的主培養(yǎng)基+8mL的附加培養(yǎng)基)，隨后在30°C和230rpm下振蕩培養(yǎng)96小時。此后，利用HPLC定量測量5’ -黃苷一磷酸的生產(chǎn)。由產(chǎn)氨棒桿菌KCCM10530和KCJ-1346生產(chǎn)的XMP量在下面的表I中給出。[表 I]
菌株~IKCCM10530 IKCJ-1346 (g/L) 28.62979種子培養(yǎng)基葡萄糖30g/L、蛋白胨15g/L、酵母提取物15g/L、NaC12. 5g/L、尿素3g/L、腺嘌呤 150mg/L、鳥嘌呤 150mg/L(pH7. 2)生產(chǎn)培養(yǎng)基(主培養(yǎng)基)葡萄糖80g/L、硫酸鎂10g/L、硫酸亞鐵20mg/L、硫酸鋅10mg/L、硫酸猛10mg/L、腺嘌呤30mg/L、鳥嘌呤30mg/L、生物素100 μ g/L、硫酸銅lmg/L、氯化硫胺 5mg/L、氯化I丐 10mg/L (pH7. 2)。生產(chǎn)培養(yǎng)基(附加培養(yǎng)基)磷酸二氫鉀10g/L、磷酸氫二鉀10g/L、尿素7g/L、硫酸銨5g/L。如表I所示的，發(fā)現(xiàn)與母菌株KCCM10530相比，KCJ-1346增加XMP生產(chǎn)L 3g/L，相應(yīng)于4. 5%的增加。實施例4 putA-插入菌株的脯氨酸脫氫酶活性在實施例2中制備的產(chǎn)XMP產(chǎn)氨棒桿菌KCJ-134如下測定脯氨酸脫氫酶活性。該菌株被接種入培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基包含10g/L的細菌用蛋白胨，5g/L的細菌用牛肉膏、5g/L的細菌用酵母提取物、2. 5g/L的NaCl、50mg/L的腺嘌呤和50mg/L的鳥嘌呤，并在30°C下溫育12小時，直到獲得0D10。IOmL的細胞培養(yǎng)物被回收，用包括50mMHEPES、IOmM乙酸鉀、IOmMCaCl2和IOmM MgCl2的緩沖液清洗兩次，并懸浮在ImL的IOOmM Tris-HCl緩沖液(ρΗ7· 5)中。在使用超聲波儀破壞后，離心細胞溶解產(chǎn)物以分離上清液。重新離心該上清液，以提供隨后懸浮在IOOyL的緩沖液中的團粒。10 μ L的該懸浮液被用作酶溶液。反應(yīng)緩沖液通過混合 IOOmM Tris-HCl (ρΗ7. 5)和 50 μ M2, 6-二氯親酌· (dichloroindoIphenoI)(Cl2Ind)制備。Cl2Ind就在反應(yīng)前被融化并混合。向980 μ L的反應(yīng)混合物添加作為底物的10 μ L的IOOmM的脯氨酸和10 μ L酶溶液，隨后在30°C下溫育15分鐘并振蕩。通過測量減少的Cl2Ind的濃度測定酶活性。Cl2Ind在600nm下具有的吸收系數(shù)。[表2]
權(quán)利要求
1.用于生產(chǎn)5’-黃苷一磷酸或5’-鳥苷一磷酸的棒狀菌(Corynebacterium)微生物，其具有與其內(nèi)源活性相比增加的脯氨酸脫氫酶活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的棒狀菌微生物，其中所述脯氨酸脫氫酶活性通過棒狀菌PutA基因的表達水平的改進增加。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的棒狀菌微生物，其中所述putA基因具有SEQID NO. 7的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的棒狀菌微生物，其中所述微生物通過引入包括putA基因的載體進行轉(zhuǎn)化。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的棒狀菌微生物，其中所述微生物通過引入具有圖I的酶切圖的重組載體進行轉(zhuǎn)化。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的棒狀菌微生物，其中所述微生物具有改進的ATP生產(chǎn)率。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的棒狀菌微生物，其中所述微生物為產(chǎn)氨棒桿菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的棒狀菌微生物，其中所述微生物由登錄號KCCM11068P確定。
9.通過培養(yǎng)權(quán)利要求I至8任一項所述的微生物從培養(yǎng)液生產(chǎn)5’-黃苷一磷酸(XMP)或5’ -鳥苷一磷酸(GMP)的方法。
10.生產(chǎn)5’-鳥苷一磷酸的方法，包括 (a)培養(yǎng)用包括putA基因的載體轉(zhuǎn)化的菌株；(b)添加5’-黃苷一磷酸脫氨基酶至在步驟(a)中獲得的所述菌株的培養(yǎng)液；和 (c)從步驟(b)的所述培養(yǎng)液獲得5’-鳥苷一磷酸。
11.權(quán)利要求I的所述棒狀菌微生物用于生產(chǎn)5’-黃苷一磷酸或5’-鳥苷一磷酸的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及改進地生產(chǎn)5’-黃苷一磷酸和5’-鳥苷一磷酸的微生物，并且更具體地，涉及具有與其固有活性相比增加的脯氨酸脫氫酶活性的棒狀菌屬某種(Corynebacterium sp.)的微生物，從由培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的微生物獲得的培養(yǎng)基生產(chǎn)5’-黃苷一磷酸或5’-鳥苷一磷酸的方法，和該微生物用于生產(chǎn)5’-黃苷一磷酸或5’-鳥苷一磷酸的用途。
文檔編號C12N15/53GK102985529SQ201180019964
公開日2013年3月20日 申請日期2011年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月19日
發(fā)明者趙鎮(zhèn)滿, 李珍南, 金蕙園, 李智惠, 尹蘭瑛, 李光雨, 吳潤錫, 樸長熙 申請人:Cj第一制糖株式會社