專利名稱：An3-相互作用蛋白的復(fù)合物及其用于促進(jìn)植物生長(zhǎng)的用途的制作方法
AN3-相互作用蛋白的復(fù)合物及其用于促進(jìn)植物生長(zhǎng)的用途本發(fā)明涉及基于AN3-相互作用物、更具體而言是SWI/SNF復(fù)合物亞基的植物變體的相互作用物，以及優(yōu)選在不合AN3的蛋白質(zhì)復(fù)合物中與上述亞基相互作用的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)復(fù)合物。還涉及復(fù)合物促進(jìn)植物生長(zhǎng)的用途，和通過超量表達(dá)至少一個(gè)，優(yōu)選至少兩個(gè)復(fù)合物成員，來刺激復(fù)合物形成的方法。對(duì)更多源自植物的產(chǎn)品的需求急劇增加。在不久的將來，農(nóng)業(yè)面對(duì)的挑戰(zhàn)將是以可持續(xù)的方式滿足對(duì)飼料和食品的不斷增長(zhǎng)的需求。此外，植物開始作為能量來源扮演重要的角色。為了應(yīng)對(duì)這些主要的挑戰(zhàn)，需要實(shí)現(xiàn)植物產(chǎn)量的長(zhǎng)遠(yuǎn)增長(zhǎng)。生物量生產(chǎn)是多因素的系統(tǒng)，其中大量的過程注入到產(chǎn)生新細(xì)胞、組織和器官的分生組織的活性中。雖然已經(jīng)對(duì)產(chǎn)量性能實(shí)施了相當(dāng)多的研究，但對(duì)于作為產(chǎn)量的基礎(chǔ)的分子網(wǎng)絡(luò)仍然知之甚少(VanCamp，2005)。在擬南芥中已描述了多種基因，當(dāng)所述基因被突變或異位表達(dá)時(shí)，導(dǎo)致更大結(jié)構(gòu)(例如葉或根)的形成。這些所謂的“內(nèi)在產(chǎn)量基因”參與相互關(guān)系幾乎未知的許多不同的過程。 這些“內(nèi)在產(chǎn)量基因”中的一種——AN3(也稱為GIF1)，是在對(duì)GRF(生長(zhǎng)調(diào)控因子)相互作用物的搜索中(Kim和Kende，2004)和通過對(duì)狹葉擬南芥突變體的分析(Horiguchi等人，2005)鑒別的。AN3是人SYT (滑膜肉瘤易位)蛋白的同源物，是由擬南芥基因組中的小基因家族編碼的。SYT是轉(zhuǎn)錄輔激活物，盡管在腫瘤發(fā)生中涉及其染色體易位，但其生物學(xué)功能仍不清楚(Clark等人，1994 ；de Bruijn等人，1996)。利用酵母GAL4系統(tǒng)，AN3表現(xiàn)出具有轉(zhuǎn)錄激活活性(Kim和Kende，2004)。這與酵母雙雜交和體外結(jié)合測(cè)定一起表面了 AN3與若干GRF的相互作用(Kim和Kende, 2004 ;Horiguchi等人,2005),提示AN3作為GRF的轉(zhuǎn)錄輔激活物的作用。GRF (生長(zhǎng)調(diào)控因子)基因存在于所有種子植物的基因組中，因此被詳細(xì)研究，并編碼在葉生長(zhǎng)和發(fā)育中發(fā)揮調(diào)控作用的推定的轉(zhuǎn)錄因子(Kim等人，2003)。支持GRF和AN3轉(zhuǎn)錄激活物和輔激活物復(fù)合物的是，grf和an3突變體表現(xiàn)出相似的表現(xiàn)型，且grf和an3突變的組合表現(xiàn)出合作效應(yīng)(Kim和Kende，2004)。an3突變體的狹葉表現(xiàn)型顯示為細(xì)胞數(shù)量減少的結(jié)果。此外，AN3的異位表達(dá)導(dǎo)致具有由更多細(xì)胞組成的更大葉的轉(zhuǎn)基因植物，表示AN3控制細(xì)胞數(shù)量和器官大小(Horiguchi等人，2005)。雖然AN3在植物生長(zhǎng)調(diào)控中的功能仍然未知，但這些結(jié)果顯示AN3滿足了對(duì)“內(nèi)在產(chǎn)量基因”的要求。在試圖解譯作為產(chǎn)量增加機(jī)制的基礎(chǔ)的分子網(wǎng)絡(luò)的工作中，開展了基因組范圍的、以蛋白質(zhì)為中心的方式，在擬南芥細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物中研究AN3相互作用蛋白質(zhì)。串聯(lián)親和純化(TAP)技術(shù)與基于質(zhì)譜法(MS)的蛋白質(zhì)鑒定組合，導(dǎo)致分離并鑒定了可能在植物生長(zhǎng)的調(diào)控中發(fā)揮功能的25種AN3相互作用蛋白(表I)。我們分離了屬于多蛋白質(zhì)復(fù)合物的若干蛋白質(zhì)。此外，許多相互作用物是完全未被表征的。關(guān)于少數(shù)AN3相互作用物的報(bào)道顯不，它們涉及若干發(fā)育過程(Wagner&Meyerowitz, 2002 ;Meagher 等人，2005 ；Sarnowski等人，2005 ；Hurtado等人，2006 ;Kwon等人，2006)，但迄今為止，所鑒定的基因中無一與刺激植物生長(zhǎng)相關(guān)。
表I:通過對(duì)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物的TAP分析鑒定的AN3的相互作用物?？俆AP給出
了共純化相互作用物的總時(shí)間；C-GS和N-GS指實(shí)驗(yàn)中是否使用了 C或N末端的GS標(biāo)簽。
表1. 35S-AN3 (8次實(shí)驗(yàn))__—
AT編兮________蛋白質(zhì)名稱__總TAP C-GS N-GS
AT5G28640 AN3__4__3__1__
AT4G16143 輸入蛋白 a -2 (1ΜΡΑ2)__5__4__I_
AT3G06720 輸入蛋丨::!(-1 亞基(ΙΜΡΑ1)__4__4__/______
AT5G5348Q 輸入蚩閂 β-2___4__4__/_
AT1G09270 輸入蛋亞基(IMPA4)__I__I__/_
AT2G28290 染色質(zhì)寬建蛋 (SYD)__8__4__4_
AT3G60830 肌動(dòng)蛋H相關(guān)蛋Α7 (ARP7)__7__4__3_
AT2G46020 SNF2蛋臼(BRM)__6__4__2_
AT1G18450 肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋臼4 CARP4)__4__4__/_
AT1G2170Q 含有SWIRM結(jié)構(gòu)域的蛋m (SWI3C) _4__4__/_____
AT5G14170 YiSW舊復(fù)合物BAF60b結(jié)構(gòu)域的44I
_ 銀白(Swp73B)_____
AT4G17330 G2484-1,含有agenet結(jié)構(gòu)域的蛋白 _6__4__2_
AT3G15000 表達(dá)的蛋白質(zhì)，與DAG蛋白相似 6__3__3_
AT5G55210 表達(dá)的蛋閂質(zhì)__4___4__/_
AT5G17510 表達(dá)的蛋白質(zhì)_____3__3__/_
AT2G16570 ATASE (Gln磷酸核糖焦磷酸酰胺轉(zhuǎn)2I2
__移酶1)____
AT4G35550 同源框-亮氨酸拉鏈蛋白(HB-2) 11/
__/HD-ZIP 蛋 H____
AT1G2067Q 含侖DNA結(jié)合溴結(jié)構(gòu)域的蛋白__I__I__/_
AT3G55220 剪接因子__I__I__/_
AT2G46340 光敏色素A抑制了spal (SPA1) 1__I__/_
AT5G13030 農(nóng)達(dá)的蛋丨質(zhì)____I__I__!___
AT5G17330 GAD (谷氨酸脫羧酶)；結(jié)合鈣調(diào)1 / 1 __1M.__________
AT1G80480 — PTAC17 (質(zhì)體轉(zhuǎn)錄活性 17)I__/__I_—
AT1G43800 酰基-(?；d體蛋白)去飽和酶 1__/__I_
AT5G45620 26S蛋白酶體調(diào)控亞基(RPN9) 1__I__/_若干AN3P相互作用物是SWI/SNF型染色質(zhì)重建復(fù)合物的亞基的同源物(Thaete等人，1999 ;Ishida等人，2004)。最近在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中顯示，SWI/SNF ATP-依賴性染色質(zhì)重建復(fù)合物在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞分化和增殖中發(fā)揮重要作用(Riesman等人，2009)。令人驚訝地，我們發(fā)現(xiàn)了 SWI/SNF復(fù)合物的亞基的植物變體及其相互作用物在植物生長(zhǎng)中發(fā)揮了重要的作用，并可用于增加植物產(chǎn)量。本發(fā)明的第一個(gè)方面是分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，優(yōu)選不含AN3p的蛋白質(zhì)復(fù)合物，至少包含SWI/SNF3亞基的植物變體，所述亞基能夠與AN3p相互作用，和與所述變體SWI/SNF3亞基相互作用的一種或多種蛋白質(zhì)。在本文中使用的不合AN3p的蛋白質(zhì)復(fù)合物意指AN3p不存在于分離的復(fù)合物中；然而，復(fù)合物的一個(gè)或多個(gè)亞基可能能夠與AN3相互作用，且AN3可能能夠與作為整體的復(fù)合物相互作用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的復(fù)合物不再能夠與AN3相互作用，以此與SWI/SNF3亞基的植物變體相互作用的蛋白質(zhì)直接或間接地抑制AN3p與所述變體的結(jié)合。作為非限制性實(shí)例，對(duì)AN3p結(jié)合的直接抑制可以是由與相同的結(jié)構(gòu)域結(jié)合所導(dǎo)致的；作為非限制性實(shí)例，對(duì)AN3p結(jié)合的間接抑制可以是由當(dāng)與其相互作用物結(jié)合時(shí)，所述變體中的構(gòu)象改變所導(dǎo)致的。SWI/SNF染色質(zhì)重建復(fù)合物亞基的植物變體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且已經(jīng)被，在其他中，Jerzmanowski (2007)所描述,通過弓I用整合到本文中。變體在本文中包括但不限于所述細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的同源物、直系同源物和旁系同源物。蛋白質(zhì)的“同源物”涵蓋了相對(duì)于所討論的未修飾的蛋白質(zhì)，具有氨基酸替換、缺失和/或插入的，并具有與其來源的未修飾的蛋白質(zhì)相似的生物學(xué)和功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶。直系同源物和旁系同源物涵蓋了用于描述基因的祖先關(guān)系的進(jìn)化概念。旁系同源物是通過祖先基因復(fù)制產(chǎn)生的、在相同物種中的基因；而直系同源物是來自通過物種形成產(chǎn)生的不同生物體的基因，并也源自共同的祖先基因。優(yōu)選地，如BLASTp (Altschul等人，1997 ；·Altschul等，2005)所測(cè)量的，所述同源物、直系同源物和旁系同源物在蛋白質(zhì)水平具有至少 30%，優(yōu)選至少 40%，優(yōu)選 50%、51%、52%、53%、54%或55%、56%、57%、58%、59%，優(yōu)選 60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%，更優(yōu)選 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%，甚至更優(yōu)選 80 %、81 %、82 %、83 %、84 %、85 %、86%、87%、88%、89%，最優(yōu)選 90% ,91 % ,92% ,93% ,94% ,95% ,96% ,97% ,98% ,99%^；更高的序列同一性。本文中使用的植物可以是任何植物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述植物是擬南芥(Arabidopsis thaliana)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述植物是作物植物，優(yōu)選單子葉植物或谷類植物，甚至更優(yōu)選地其是選自稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、高粱和燕麥的谷類植物。優(yōu)選地，SffI/SNF染色質(zhì)重建復(fù)合物的所述植物變體選自由AT1G18450(ARP4)、AT3G60830 (ARP7)、AT5G14170 (Swp73B)和 AT1G21700 (SffI3C)編碼的蛋白質(zhì)，或其變體。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，優(yōu)選分離的、不含AN3蛋白的蛋白質(zhì)復(fù)合物，至少包含ARP4p或其變體，和選自由AT5G45600、AT1G76380、AT3G01890、AT5G26360、AT5G14240、AT1G47128、AT2G27100、AT5G55040、AT3G03460 和 AT1G54390 編碼的蛋白質(zhì)，或其變體。另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，優(yōu)選分離的、不合AN3蛋白的蛋白質(zhì)復(fù)合物，至少包含ARP7p或其變體，和選自由AT3G20050、AT5G14240、AT4G22320、AT5G26360、AT3G02530、AT3G18190、AT3G03960、AT3G08580、AT4G14880 和 AT1G07820 編碼的蛋白質(zhì)，或其變體。另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，優(yōu)選分離的、不合AN3蛋白的蛋白質(zhì)復(fù)合物，至少包含Swp73Bp或其變體，和選自由AT2G47620、AT2G33610、AT3G17590、AT4G34430、AT1G32730、AT3G22990、AT1G06500、AT1G47128、AT3G18380、AT3G06010、AT1G58025、AT5G03290、AT5G55040、AT3G50000、AT4G28520、AT5G44120 和 AT4G22320 編碼的蛋白質(zhì)，或其變體。
仍然另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，優(yōu)選分離的、不含AN3蛋白的蛋白質(zhì)復(fù)合物，至少包含SWI3Cp或其變體，和選自由AT3G01890、AT1G76380、AT3G03460、AT4G22320、ATlGl 1840、AT4G14880 和 AT4G04740 編碼的蛋白質(zhì)，或其變體。本發(fā)明的另一個(gè)方面是根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)復(fù)合物用于調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)和/或植物產(chǎn)量的用途。優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)是植物生長(zhǎng)和/或產(chǎn)量的增加。優(yōu)選地，生長(zhǎng)的增加測(cè)量為生物量生產(chǎn)的增加?！爱a(chǎn)量”指這樣的狀態(tài)，其中僅植物的部分，優(yōu)選植物的經(jīng)濟(jì)學(xué)重要的部分(例如葉、根或種子)的生物量是增加的。術(shù)語“增加”在本文中意指較之本文定義的對(duì)照植物，至少5%、6%、7%、8%、9%或10%，優(yōu)選至少15%或20%，更優(yōu)選25%、30%、35%或40%更多的產(chǎn)量和/或生長(zhǎng)。如本文中所用，植物生長(zhǎng)的增加優(yōu)選地測(cè)量為總植物生物量、葉生物量、根生物量和種子生物量中的任意一種或多種的增加。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述增加是總植物生物量的增加。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述植物是作物植物，優(yōu)選單子葉植物或谷類植物，甚至更優(yōu)選地是選自稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、高粱和燕麥的谷類植物。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是促進(jìn)根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成的方法，包括超量表達(dá)所述復(fù)合物的至少一種蛋白質(zhì)，優(yōu)選至少兩種蛋白質(zhì)?？梢酝ㄟ^將預(yù)期用于實(shí)施所述超量表達(dá)的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)移到植物中，來獲得靶基因的超量表達(dá)。將外源基因轉(zhuǎn)移到植物基因組中被稱為轉(zhuǎn)化。植物物種的轉(zhuǎn)化是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)。有利地，可以使用若干轉(zhuǎn)化方法中的任一種，將目的基因引入到合適的祖先細(xì)胞中?？梢岳妹枋鲇糜谵D(zhuǎn)化和從植物組織或植物細(xì)胞再生植物的方法進(jìn)行瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化方法包括但不限于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，使用脂質(zhì)體、電穿孔、增加游離DNA攝入的化學(xué)品、將DNA直接注射到植物中、基因槍轟擊、使用病毒或花粉轉(zhuǎn)化，和顯微投影。優(yōu)選地，所述超量表達(dá)導(dǎo)致植物生長(zhǎng)和/或產(chǎn)量的增加。植物生長(zhǎng)和/或產(chǎn)量的增加是通過比較包含根據(jù)本發(fā)明使用的基因的測(cè)試植物和作為對(duì)照在相同條件下生長(zhǎng)的親代非轉(zhuǎn)化的植物來測(cè)量的。本發(fā)明的另一個(gè)方面是抑制根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成的方法，包括阻抑所述復(fù)合物的至少一種蛋白質(zhì)，優(yōu)選至少兩種蛋白質(zhì)的表達(dá)。在復(fù)合物表現(xiàn)出生長(zhǎng)限制效應(yīng)的情況下，對(duì)復(fù)合物形成的抑制可以是理想的?？梢酝ㄟ^將預(yù)期用于實(shí)施所述表達(dá)阻抑的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)移到植物中，來獲得靶基因的表達(dá)阻抑。用于阻抑植物中的表達(dá)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括但不限于使用RNAi、反義RNA和基因沉默。
附圖
簡(jiǎn)介圖I :2株超量表達(dá)SWIRM品系的葉表現(xiàn)型。A)總蓮座面積；B)單片葉面積。植物在體外生長(zhǎng)21天，SffIRM是SWI3C的別名。
實(shí)施例實(shí)施例的材料和方法AN3相互作用物的載體構(gòu)建通過Multisite Gateway LR反應(yīng)，完成處于35S (CaMV)啟動(dòng)子控制下的N末端和C末端GS標(biāo)記的GFP和AN3的構(gòu)建。通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增沒有(_)和有(+)終止密碼子的編碼區(qū)，并克隆到Gateway pD0NR221載體(Invitrogen)中，獲得pEntryLlL2-GFP (-)、pEntryLlL2_GFP (+)、pEntryLlL2_AN3 (-)和pEntryLlL2_AN3 (+)。通過分別在 pEntryL4Rl_Pro35S、pEntryLlL2_GFP (-)或 pEntryLlL2_AN3 (-),和 pEntryR2L3_GS與目的載體pKCTAP之間的Multisite Gateway LR反應(yīng)，獲得含有Pro35s :GFP_GS-和Pro35s AN3-GS 的植物轉(zhuǎn)化載體(Van Leene 等人，2007)。為了 獲得 Pro35S =GS-GFP 和 Pro35S GS-AN3 載體，在 pEntryL4L3_Pro35S 和 pEntryLlL2_GFP (+)或 pEntryLlL2_AN3 (+)之間，與pKNGSTAP 進(jìn)行 Multisite LR 重組。通過序列分析檢查所有的入門和目的載體。通過電穿孔將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)C58ClRifE(pMP90)菌株。在含有 100yg/mL 利福平、40 μ g/mL慶大霉素和100 μ g/mL大觀霉素的酵母提取物肉湯平板上選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。ARP4、ARP7、Swp 73B和SW13C相互作用物的載體構(gòu)建通過Multisite Gateway LR反應(yīng),完成處于35S (CaMV)啟動(dòng)子控制下的N末端和C末端GS標(biāo)記的ARP4、ARP7、Swp73B和SW13C的構(gòu)建。通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增沒有 (-)和有(+)終止密碼子的編碼區(qū)，并克隆到Gateway pD0NR221載體(Invitrogen)中，獲得pEntryLlL2-ARP4 (-)、pEntryLlL2-ARP4 (+)、pEntryLlL2-ARP7 (-)、pEntryLlL2-ARP7 (+)、pEntryLlL2-Swp73B(-)、pEntryLlL2-Swp73B( + )、pEntryLIL2-SWI3C(-)和pEntryLlL2_SWI3C(+)。通過分別在 pEntryL4Rl_Pro35S、pEntryLlL2_ARP4(-)、pEntryLlL2-ARP7 (-)、pEntryLlL2_Swp73B (-)或 pEntryLlL2_SWI3C (-)，和 pEntryR2L3_GS與目的載體pKCTAP之間的Multisite Gateway LR反應(yīng)，獲得含有Pro35s :ARP4_GS-、Pro35s :ARP7-GS-、Pro35s:Swp 73B-GS-和 Pro35s:SW13C-GS 的植物轉(zhuǎn)化載體(VanLeene 等人，2007)。為了獲得 Pro35S:GS_ARP4、Pro35S:GS_ARP7、Pro35S:GS-Swp73B 和 Pro35S:GS-SWI3C 載體，在 pEntryL4L3_Pro35S 和 pEntryLlL2_ARP4 (+)、pEntryLlL2-ARP7 (+)、pEntryLlL2-Swp73B (+)或 pEntryLlL2_SWI3C (+)之間，與 pKNGSTAP進(jìn)行Multisite LR重組。通過序列分析檢查所有的入門和目的載體。通過電穿孔將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) C58ClRifR (pMP90)菌株。在含有 100yg/mL 利福平、40 μ g/mL慶大霉素和100 μ g/mL大觀霉素的酵母提取物肉湯平板上選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。細(xì)胞懸浮培養(yǎng)在25。C 黑暗中，在 50mL MSMO培養(yǎng)基(4. 43g/L MSMO, Sigma_Aldrich)、30g/L蔗糖、O. 5mg/L NAA、0.05mg/L激動(dòng)素，用IMKOH調(diào)節(jié)為pH 5. 7)中培養(yǎng)野生型和轉(zhuǎn)基因的擬南芥細(xì)胞懸浮PSB-D培養(yǎng)物，溫和攪拌(130rpm)。每7天將細(xì)胞按1/10稀釋度在新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)物轉(zhuǎn)化如前所述，通過農(nóng)桿菌屬共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化擬南芥培養(yǎng)物(Van Leene等人,2007)。通過離心(IOmin, 5000rpm)，用等體積的MSMO培養(yǎng)基洗滌在YEB中對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的農(nóng)桿菌屬培養(yǎng)物(OD600在I. O和I. 5之間)3次，并在細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)培養(yǎng)基中重懸，直到OD6tltl為I. O。傳代培養(yǎng)2天后，用200 μ L經(jīng)洗滌的農(nóng)桿菌和200 μ M acetoseringone，在25° C黑暗中孵育3mL懸浮培養(yǎng)物48h，溫和攪拌(130rpm)。共培養(yǎng)2天后，向細(xì)胞培養(yǎng)物中加入含有三種抗生素的混合物(25 μ g/mL卡那霉素、500 μ g/mL羧節(jié)青霉素和500 μ g/mL萬古霉素)的7mLMSM0，并在標(biāo)準(zhǔn)條件下(25° C，130rpm和持續(xù)黑暗)進(jìn)一步懸浮生長(zhǎng)。分別在共培養(yǎng)后的第11和第18天，通過在含有抗生素混合物的50mL新鮮MSMO培養(yǎng)基中按1:5和1:10的比例sequentional稀釋,來選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)物。在反選擇細(xì)菌后，在含有25 μ g/mL卡那霉素的50mL MSMO培養(yǎng)基中，每周按1:5的比例進(jìn)一步地再傳代培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞2周。之后，每周按1:10的稀釋度，在新鮮培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)細(xì)胞。細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物的表達(dá)分析在源自傳代培養(yǎng)2天后收獲的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞的總蛋白提取物中分析轉(zhuǎn)基因表達(dá)。在12%SDS-PAGE凝膠上分離等量的總蛋白并印跡到Immobilon-P膜(MiIlipore, Bedford, MA)上。在 20mM Tris-HCl,pH 7. 4,150mM NaCl 和 O. l%Triton X-IOO中的3%脫脂乳中，封閉蛋白質(zhì)凝膠印跡。為了檢測(cè)GS標(biāo)記的蛋白質(zhì)，用人血漿孵育印跡，然后用與辣根過氧化物酶(HRP ;GE-HealthCare)偶聯(lián)的抗人IgG孵育。通過化學(xué)發(fā)光檢測(cè)(Perkin Elmer, Norwalk, CT)對(duì)蛋白質(zhì)凝膠印跡顯色。蛋白質(zhì)提取物制備
在液氮中研磨細(xì)胞材料(15g)至均質(zhì)。在4° C,使用Ultra-Turrax T25混合器(IKA Works, Wilmington, NC),在等體積(w/v)的提取緩沖液(25mM Tris-HCl, pH 7.6、15mM MgCl2、5mM EGTA、150mM NaCl、15mM 對(duì)-硝基苯基磷酸、60mM β-甘油磷酸酯、0.1%(v/v) Nonidet Ρ-40 (ΝΡ-40)、0· ImM釩酸鈉、ImM NaFUmM DTTUmM PMSF、10 μ g/mL亮肽素、10 μ g/mL抑酶肽、5 μ g/mL抗痛素(antipain)、5 μ g/mL糜蛋白酶抑制素、5 μ g/mL胃蛋白酶抑制素、10 μ g/mL大豆胰蛋白酶抑制劑、O. ImM苯甲脒、I μ M反式-環(huán)氧丁二酰基_L_亮氨酸-4-胍基丁基酰胺(E64)、5% (v/v)乙二醇)中制備蛋白質(zhì)粗提物。通過4° C，在36900g20min和178000g 45min的兩步離心，獲得可溶性蛋白質(zhì)級(jí)分。將提取物通過
O.45 μ m 過濾器(Alltech, Deerfield, IL),并用蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(Bio-Rad, Hercules,CA)確定蛋白質(zhì)含量。串聯(lián)親和純化按BUrckstUmmer等人(2006)所述并進(jìn)行一些修改來實(shí)施純化。簡(jiǎn)而言之，在4° C，溫和轉(zhuǎn)動(dòng)下，將200mg總蛋白提取物與已用3mL提取緩沖液預(yù)平衡過的100 μ L IgG瓊脂糖 6Fast Flow Flow 珠(GE-Healthcare, Little Chalfont, UK)孵育 lh。將 IgG 瓊月旨糖珠轉(zhuǎn)移到 ImL Mobicol 柱(MoBiTec, Goettingen, Germany),并用 10mT, IgG 洗漆緩沖液(IOmM Tris-HCl，pH 8. 0,150mM NaCl，O. I % NP-40，5 % 乙二醇)和 5mL 煙草(Nicotianatabacum L.)蝕斑病毒(TEV)緩沖液(IOmM Tris-HCl, pH 8. 0,150mM NaCl，0. 1% (v/v)ΝΡ-40,0. 5mMEDTA, ImM PMSF, I μ M E64,5% (v/v)乙二醇)洗滌。通過 AcTEV 消化物(2x100U, Invitrogen)在16° C洗脫結(jié)合的復(fù)合物lh。在4°C,溫和轉(zhuǎn)動(dòng)下,將IgG洗脫的級(jí)分與已用3mL TEV緩沖液預(yù)平衡過的100 μ L鏈霉親和素樹脂(Stratagene，La Jolla7CA)孵育lh。將鏈霉親和素珠裝填在Mobicol柱中，并用IOmL TEV緩沖液洗滌。用ImL鏈霉親和素洗脫緩沖液(IOmM Tris-HCl,pH 8. 0,150mM NaCI，0. 1% (ν/ν)ΝΡ-40,0. 5mM EDTA, ImMPMSF, I μ M E64,5% (v/v)乙二醇，20mM脫硫生物素)洗脫結(jié)合的復(fù)合物，并使用TCA(25%v/v)沉淀。用含有50mMHCl的冰冷丙酮洗滌蛋白質(zhì)沉淀2次，重新溶解在樣品緩沖液中，并在4-12%梯度NuPAGE凝膠(Invitrogen)上分離。用膠體的考馬斯亮藍(lán)染色使蛋白質(zhì)可視化。蛋白水解和肽分離
在脫色后，在H2O中洗滌凝膠片I小時(shí)，在25mL的50mMNH4HC03中的6. 66mM DTT中還原多肽的二硫橋40min，之后，在25mL的50mM NH4HCO3中的55mM IAM中烷基化硫醇基30min。用水洗滌凝膠片3次后，將蛋白質(zhì)凝膠的整個(gè)泳道切成薄片，收集到微滴度板中，并基本上如前所述進(jìn)行處理，僅作微小修改(Van Leene等人，2007)。在每個(gè)微滴度板的孔中，將脫水的凝膠顆粒在含有250ng胰蛋白酶(MSGold ;Promega，Madison, WI)、50mMNH4HCO3和10% CH3CN(v/v)的20 μ L消化緩沖液中4° C再水化30min。在添加了含有50mMNH4HCO3和10% CH3CN(v/v)的10 μ L緩沖液后，在37°C消化蛋白質(zhì)3小時(shí)。濃縮所獲得的肽，用微柱固相吸頭脫鹽(PerfectPureTM C18吸頭，200nL床體積；Eppendorf, Hamburg,Germany)，并使用I. 2 μ L的50 % CH3CN :0. I % CF3COOH溶液直接洗脫到MALDI靶平板上(Op t i -T 0F 384ff e 11 Insert ；Applied Biosystems, Foster City, CA),用 a -氰基 _4_ 輕基肉桂酸使所述溶液飽和并用20fmole/μ L Glul-血纖維蛋白肽B(Sigma-Aldrich)、20fmole/ μ L des_Pro2-緩激肽(Sigma-Aldrich)和 20fmole/ μ L 人促腎上腺皮質(zhì)激素片段18-39 (Sigma-Aldrich)對(duì)所述溶液摻料。
獲得質(zhì)譜使用MALDI-串聯(lián)MS裝置(4800ProteomicsAnalyzer ；Applied Biosystems)獲得肽質(zhì)譜指紋和之后的所選定的肽的IkV CID片段化譜。使用基本如Van Leene等人(2007)所述的設(shè)定，獲得肽質(zhì)譜和肽序列譜。根據(jù)生產(chǎn)商的說明校正每個(gè)MALDI平板。用位于m/z963. 516(des-Pro2-緩激肽)、m/z 1570. 677 (Glul-血纖維蛋白肽 B)和 m/z 2465，198(促腎上腺皮質(zhì)激素片段18-39)的三種內(nèi)參內(nèi)部校正所有的肽質(zhì)量指紋(PMF)譜，使所分析的MALDI靶上的每個(gè)所分析的肽印跡的平均質(zhì)量精確度為5ppm土 lOppm。利用單個(gè)PMF譜，對(duì)通過質(zhì)量排阻過濾器的信號(hào)噪音比超過20的多至16種肽進(jìn)行片段化分析?；贛S的蛋白質(zhì)同源性鑒定使用附帶的軟件套件(GPS Explorer 3. 6, Applied Biosystems),處理每個(gè)樣品的PMF譜和肽序列譜，參數(shù)設(shè)定基本如Van Leene等人(2007)所述。生成數(shù)據(jù)搜索文件，并用于通過使用局部數(shù)據(jù)庫搜索引擎(Mascot2. I, Matrix Science)的蛋白質(zhì)同源性鑒定。從9個(gè)公眾數(shù)據(jù)庫匯編形成內(nèi)部的非冗余擬南芥蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，稱為SNAPS擬南芥0. 4版(SNAPS=蛋白質(zhì)序列的簡(jiǎn)單非冗余裝配，77488個(gè)序列條目，30468560個(gè)殘基；可獲得自http://www. ptools. ua. ac. be/snaps)。保留具有超過95%可能性的相對(duì)分?jǐn)?shù)的蛋白質(zhì)同源性鑒定的最佳命中(第一位)。當(dāng)分?jǐn)?shù)超過98%可能性閾值時(shí)，保留其他的陽性鑒定結(jié)果(第二位和更多)。實(shí)施例I :鑒定AN3相互作用物為了體內(nèi)鑒定AN3相互作用伙伴，對(duì)AN3的N末端和C末端GS-融合體實(shí)施串聯(lián)親和純化(TAP)，所述融合體是在組成型35SCaMV啟動(dòng)子控制下在轉(zhuǎn)基因擬南芥懸浮培養(yǎng)物中異位表達(dá)的。對(duì)來自新鮮培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)2天后收獲的AN3-GS和GS-AN3品系的提取物實(shí)施2次獨(dú)立的TAP純化。在4-12%NuPAGE凝膠上分離親和純化的蛋白質(zhì)，并用考馬斯亮藍(lán)染色。切割蛋白質(zhì)條帶，用胰蛋白酶在凝膠內(nèi)消化，并對(duì)其施用MALDI-T0F/T0F質(zhì)譜法進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。在減去由對(duì)照純化(Van Leene等人,2007)鑒定的背景蛋白質(zhì)后,從獲得的命中列表中鑒定出除AN3自身外的25種AN3相互作用蛋白(表I)。僅在8次TAP實(shí)驗(yàn)中的一次鑒定了 9種蛋白質(zhì)。
實(shí)施例2 :鑒定ARP4相互作用物根據(jù)上述方法鑒定ARP4相互作用物。結(jié)果總結(jié)在表2中。除在AN3復(fù)合物中已鑒定過的蛋白質(zhì)外(表I)，還鑒定了若干種新的相互作用物。表2 :通過對(duì)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物的TAP分析鑒定的ARP4的相互作用物。總TAP給出了共純化相互作用物的總時(shí)間；C-GS和N-GS指實(shí)驗(yàn)中是否使用了 C或N末端的GS標(biāo)簽。
權(quán)利要求
1.分離的不含AN3蛋白的蛋白質(zhì)復(fù)合物，所述復(fù)合物至少包含SWI/SNF3亞基的能夠與AN3p相互作用的植物變體，和一種或多種與所述變體SWI/SNF3亞基相互作用的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求I的分離的不含AN3蛋白的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中所述SWI/SNF3亞基選自由 AT1G18450 (ARP4)、AT3G60830 (ARP7)、AT5G14170 (Swp73B)和 AT1G21700 (SffI3C)編碼的蛋白質(zhì)，或其變體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的分離的不含AN3蛋白的蛋白質(zhì)復(fù)合物，所述蛋白質(zhì)復(fù)合物至少包含 ARP4p 和選自由 AT5G45600、AT1G76380、AT3G01890、AT5G26360、AT5G14240、AT1G47128、AT2G27100, AT5G55040, AT3G03460 和 AT1G54390 編碼的蛋白質(zhì)，或其變體。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的分離的不含AN3蛋白的蛋白質(zhì)復(fù)合物，所述蛋白質(zhì)復(fù)合物至少包含 ARP7p 和選自由 AT3G20050、AT5G14240、AT4G22320、AT5G26360、AT3G02530、AT3G18190、AT3G03960、AT3G08580、AT4G14880 和 AT1G07820 編碼的蛋白質(zhì)，或其變體。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的分離的不含AN3蛋白的蛋白質(zhì)復(fù)合物，所述蛋白質(zhì)復(fù)合物至少包含 Swp73Bp 和選自由 AT2G47620、AT2G33610、AT3G17590、AT4G34430、AT1G32730、AT3G22990、AT1G06500、AT1G47128、AT3G18380、AT3G06010、AT1G58025、AT5G03290、AT5G55040、AT3G50000、AT4G28520、AT5G44120 和 AT4G22320 編碼的蛋白質(zhì)，或其變體。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的分離的不含AN3蛋白的蛋白質(zhì)復(fù)合物，所述蛋白質(zhì)復(fù)合物至少包含 SWI3Cp 和選自由 AT3G01890、AT1G76380、AT3G03460、AT4G22320、ATlGl 1840、AT4G14880和AT4G04740編碼的蛋白質(zhì)，或其變體。
7.根據(jù)任一項(xiàng)上述權(quán)利要求的蛋白質(zhì)復(fù)合物用于調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)和/或植物產(chǎn)量的用途。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的蛋白質(zhì)復(fù)合物的用途，其中所述植物生長(zhǎng)和/或植物產(chǎn)量的調(diào)節(jié)是植物生長(zhǎng)和/或植物產(chǎn)量的增加。
9.促進(jìn)根據(jù)權(quán)利要求1-6的任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)復(fù)合物的復(fù)合物形成的方法，所述方法包括超量表達(dá)復(fù)合物的至少一種蛋白質(zhì)。
10.抑制根據(jù)權(quán)利要求1-6的任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)復(fù)合物的復(fù)合物形成的方法，所述方法包括下調(diào)復(fù)合物的至少一種蛋白質(zhì)的表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明涉及基于AN3-相互作用物、更具體而言是SWI/SNF復(fù)合物亞基的植物變體的相互作用物，以及優(yōu)選在不含AN3的蛋白質(zhì)復(fù)合物中與上述亞基相互作用的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)復(fù)合物。還涉及復(fù)合物促進(jìn)植物生長(zhǎng)的用途，和通過超量表達(dá)至少一個(gè)，優(yōu)選至少兩個(gè)復(fù)合物成員，刺激復(fù)合物形成的方法。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102892889SQ201180019925
公開日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2011年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月22日
發(fā)明者G·德耶格爾, D·G·因澤, A·韋爾凱斯特 申請(qǐng)人:巴斯夫植物科學(xué)有限公司