專(zhuān)利名稱(chēng)：蓬亂蛋白和β-連環(huán)蛋白之間的相互作用在經(jīng)典Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的新功能的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及經(jīng)典Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的相互作 用蛋白及其用途。
背景技術(shù)：
經(jīng)典Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)控制了許多生命過(guò)程，這些過(guò)程包括生物體的 生長(zhǎng)、發(fā)育、疾病、衰老與死亡等等；也包括細(xì)胞形態(tài)與功能的分化與維持、 免疫、應(yīng)激、細(xì)胞癌變與細(xì)胞凋亡等等。Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在不同物種之間具 有高度的保守性，通過(guò)對(duì)果蠅、爪蟾、小鼠等模式生物的研究，已經(jīng)大體確立 了經(jīng)典Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的分子框架。發(fā)育過(guò)程中，特定的時(shí)間和特定的環(huán)境 誘導(dǎo)下，某些組織或細(xì)胞群體分泌Wnt蛋白，結(jié)合受體巻曲蛋白(Frizzled)家 族成員，和共受體低密度脂蛋白LRP5/6,將信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi)。在沒(méi)有Wnt信 號(hào)刺激時(shí)，這條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵分子(3-連環(huán)蛋白(P-catenin)參與由Axin， 結(jié)腸癌抑制因子(APC)，糖原合酶激酶3(5(GSK3f3)，酪蛋白激酶1 (CK1)，以及 (3-TrCP蛋白形成的巨大的蛋白質(zhì)復(fù)合物，在GSK3(3和CK1作用下受到磷酸化標(biāo) 記，進(jìn)而在(3-TrCP蛋白介導(dǎo)的泛素化修飾后被蛋白酶體降解。在Wnt信號(hào)刺激 下，胞內(nèi)的Dishevelled (Dvl)和Frat等Wnt途徑的正向調(diào)節(jié)分子打散Axin、 APC和GSK3等形成的降解復(fù)合物，Axin被LRP帶上膜進(jìn)而降解。(3-連環(huán)蛋白 磷酸化水平降低，進(jìn)而可以在細(xì)胞質(zhì)中大量積累。部分p-連環(huán)蛋白進(jìn)入細(xì)胞核， 與核內(nèi)的含有HMG-Box的轉(zhuǎn)錄因子-淋巴細(xì)胞增強(qiáng)因子1/ T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子 (LEF1/TCF)家族的蛋白(如TCF-4)相互作用，啟動(dòng)下游耙基因的開(kāi)放(Gurabiner BM. 1998. van Noort M. & Clevers H. 2002. Wodarz A. & Nusse R. 1998.)。
Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑不僅影響胚胎發(fā)育中的體軸誘導(dǎo)、胚層建立、體節(jié)分化、 組織或器官形成等一系列重要的早期事件，參與體細(xì)胞的分化和極化；而且在 成體中Wnt信號(hào)途徑的異常活化已經(jīng)證明與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。研究發(fā) 現(xiàn)，大約90%的結(jié)腸癌都是由于Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活性突變而引起的，此外Wnt信號(hào)途徑的異常活化還與一系列的腫瘤發(fā)生有關(guān)，比如小腸腺瘤、肝癌、 胃癌、食道腺癌、惡性黑色素瘤、乳腺癌(Giles RH， van Es JH， Clevers H. 2003)中均發(fā)現(xiàn)了 Wnt信號(hào)異?；蛘呤寝D(zhuǎn)導(dǎo)途徑中信號(hào)分子的突變。因此對(duì)Wnt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的分子機(jī)制的研究和理解，對(duì)于探索腫瘤治療藥物、尋找新的藥 物耙點(diǎn)和理論依據(jù)具有重要意義。
經(jīng)典Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的生物學(xué)功能主要是通過(guò)下游靶基因的表達(dá)而得以 實(shí)現(xiàn)。而很多靶基因比如c-myc、 cyclinDl，在細(xì)胞增殖中起到重要作用。研 究表明，在很多癌癥細(xì)胞里可以檢測(cè)到P-連環(huán)蛋白在細(xì)胞核中的大量積累以 及c-myc、 cyclinDl的高表達(dá)，說(shuō)明這些腫瘤細(xì)胞中Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑下游的 轉(zhuǎn)錄復(fù)合物處于高轉(zhuǎn)錄活性狀態(tài)。因?yàn)檗D(zhuǎn)錄復(fù)合物的活性高低直接關(guān)系到Wnt 信號(hào)效應(yīng)，那么對(duì)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的分子調(diào)控機(jī)制的硏究，也就具有十分重要的意 義。
綜上，盡管目前本領(lǐng)域?qū)τ诮?jīng)典Wnt信號(hào)途徑的分子機(jī)制有所了解，然而 對(duì)于該途徑的異?；罨膯?dòng)等環(huán)節(jié)仍然不清楚。因此，本領(lǐng)域需要進(jìn)一步對(duì) Wnt信號(hào)途徑中一些關(guān)鍵影響因素加以研究，以期找到可調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途 徑的物質(zhì)，從而調(diào)控Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的細(xì)胞事件。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種篩選調(diào)節(jié)蓬亂蛋白與e-連環(huán)蛋白相互作用的調(diào) 節(jié)劑的方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種蓬亂蛋白的活性片段，其可用于制備調(diào)節(jié) (特別是抑制)蓬亂蛋白和P -連環(huán)蛋白相互作用的調(diào)節(jié)劑(特別是抑制劑)，或用于 篩選調(diào)節(jié)蓬亂蛋白和P -連環(huán)蛋白相互作用的調(diào)節(jié)劑。
在本發(fā)明的第一方面，提供一種篩選調(diào)節(jié)蓬亂蛋白(Dishevelled, Dvl)與 3-連環(huán)蛋白(P-catenin， P -cat)相互作用的調(diào)節(jié)劑的方法，所述方法包括以 下步驟
(a) 將候選物質(zhì)與蓬亂蛋白和e-連環(huán)蛋白相互作用的體系接觸；和
(b) 檢測(cè)候選物質(zhì)對(duì)蓬亂蛋白和e -連環(huán)蛋白之間相互作用的影響；
其中，若所述候選物質(zhì)可抑制或促進(jìn)蓬亂蛋白和P-連環(huán)蛋白之間的相互作 用，則表明該候選物質(zhì)是調(diào)節(jié)蓬亂蛋白和P-連環(huán)蛋白相互作用的調(diào)節(jié)劑。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的相互作用是蓬亂蛋白和P-連環(huán)蛋白發(fā)生
^口 口 o
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的蓬亂蛋白選自蓬亂蛋白1 (Dvl 1)、 蓬亂蛋白2 (Dvl 2)或蓬亂蛋白3 (Dvl 3)。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，步驟(a)包括向蓬亂蛋白和P-連環(huán)蛋白相 互作用的體系中添加候選物質(zhì)；和
步驟(b)包括檢測(cè)蓬亂蛋白和P-連環(huán)蛋白相互作用情況，并與對(duì)照組比較， 其中所述的對(duì)照組是不添加所述候選物質(zhì)的、蓬亂蛋白和P -連環(huán)蛋白相互作用的 體系；
若測(cè)試組中蓬亂蛋白和e-連環(huán)蛋白相互作用在統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于(優(yōu)選顯著低 于，如低20%;更優(yōu)選的低40%)對(duì)照組，就表明該候選物質(zhì)是抑制蓬亂蛋白和 P-連環(huán)蛋白相互作用的調(diào)節(jié)劑；
若測(cè)試組中蓬亂蛋白和P-連環(huán)蛋白相互作用在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于(優(yōu)選顯著低 于，如高20%;更優(yōu)選的高40%)對(duì)照組，就表明該候選物質(zhì)是促進(jìn)蓬亂蛋白和 e -連環(huán)蛋白相互作用的調(diào)節(jié)劑。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述體系選自溶液體系、細(xì)胞體系、或組織體系。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述體系中還包含Wnt蛋白。 在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的Wnt蛋白包括但不限于Wntl蛋白、Wnt3a 蛋白或Wnt8蛋白。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述方法還包括對(duì)于篩選出的調(diào)節(jié)劑，進(jìn)一步 測(cè)試其對(duì)于Wnt信號(hào)途徑下游基因的影響；如果其可上調(diào)Wnt信號(hào)途徑下游基 因的表達(dá)，則表明該調(diào)節(jié)劑是促進(jìn)蓬亂蛋白和e-連環(huán)蛋白之間的相互作用的促 進(jìn)劑；如果其可下調(diào)Wnt信號(hào)途徑下游基因的表達(dá)，則表明該調(diào)節(jié)劑是抑制蓬
亂蛋白和e-連環(huán)蛋白之間的相互作用的抑制劑。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，Wnt信號(hào)途徑下游基因例如(但不限于)哺乳 細(xì)胞中的c-myc基因、cyclinDl基因、Axin2基因、LEF1基因、PPARdelta基 因；或魚(yú)類(lèi)(如斑馬魚(yú))細(xì)胞中的^;f基因、";^基因。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的Wnt信號(hào)途徑下游基因異?；罨?如上調(diào))
導(dǎo)致腫瘤(如結(jié)腸癌)的發(fā)生。在本發(fā)明的第二方面，提供一種通過(guò)所述的方法獲得的調(diào)節(jié)蓬亂蛋白與P -連 環(huán)蛋白相互作用的調(diào)節(jié)劑。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的調(diào)節(jié)劑是抑制劑，通過(guò)抑制蓬亂蛋白與e
-連環(huán)蛋白的相互作用，從而抑制Wnt信號(hào)途徑下游基因異?；罨?。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的調(diào)節(jié)劑是抑制劑，所述的抑制劑為一種多
肽，含有SEQ ID NO: 5中496 695位氨基酸序列。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，該多肽還含有核定位信號(hào)蛋白(NLS)的氨基酸序列。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的核定位信號(hào)蛋白的氨基酸序列位于所述多 肽的C末端。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的調(diào)節(jié)劑是一種核酸分子或其轉(zhuǎn)錄本 (mRNA)，所述核酸分子含有SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供一種蓬亂蛋白的用途，用于篩選調(diào)節(jié)蓬亂蛋白 與e -連環(huán)蛋白相互作用的調(diào)節(jié)劑。
本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而 易見(jiàn)的。


圖1顯示了正常組織和結(jié)腸癌樣本中Dvl3的分布情況。由圖顯示在結(jié)腸 癌樣本的細(xì)胞核里有大量Dvl3積累，而在正常細(xì)胞中Dvl3在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核 都有分布，且胞質(zhì)中的量遠(yuǎn)高于核內(nèi)。其中，右上角放大圖中箭頭所示位置為 細(xì)胞核。
圖2A顯示了p-cat本身不能通過(guò)與抗Flag抗體結(jié)合免疫沉淀得到，只有 在轉(zhuǎn)染了Dvl3-NLS-Flag的情況下內(nèi)源的p-cat才能在免疫沉淀樣品中檢測(cè)到。
圖2B顯示了在體外Pull Down實(shí)驗(yàn)中用抗myc抗體免疫沉淀 His-卩-cat-myc可以共沉淀到His-Dvl3。
圖2C顯示了只有在Wnt3a刺激的條件下Dvl3才能共沉淀到內(nèi)源的p-cat。
圖3A顯示了用抗myc抗體免疫沉淀His-P-cat-myc時(shí)能夠共沉淀到 His-C一flag。圖3B顯示了在共轉(zhuǎn)染了 C-NLS-Flag的情況下，用抗HA抗體免疫沉淀
Dvll-NLS-HA不能共沉淀到p-cat-myc。
圖3C顯示了 Dvl 1-C-NLS能夠有效地抑制Wnt3a激活的Topflash活性。 圖3D顯示了在SW480細(xì)胞中，Dvl 1-C-NLS對(duì)Topflash活性的抑制是劑
量依賴(lài)的，其中，"+ "表示含lOOng Dvl-C-NLS， " + + "表示含200ng
Dvl-C-NLS。
圖犯顯示了在Wnt3a刺激下，(3-cat和TCF-4能夠結(jié)合到Wnt信號(hào)下游靶 基因c-myc啟動(dòng)子上，在轉(zhuǎn)染Dvl 1-C-NLS片段的細(xì)胞中，P-cat結(jié)合到下游 耙基因c-myc啟動(dòng)子上的能力顯著地降低，而TCF-4基本不受影響。
圖4A顯示了注射Dvl 1-C-NLS的mRNA的胚胎中km和"W的表達(dá)明顯 地較對(duì)照組胚胎下降。
圖4B顯示了注射Dvl-C-NLS的mRNA后，t&6和Kox表達(dá)正常以及明顯下 調(diào)的胚胎的統(tǒng)計(jì)情況。對(duì)99個(gè)胚胎統(tǒng)計(jì)后有51%的胚胎中";^的表達(dá)有明顯 下調(diào)，對(duì)83個(gè)胚胎統(tǒng)計(jì)后有59%的胚胎對(duì)KOx的表達(dá)有明顯下調(diào)(n二71， 83， 89， 99分別表示統(tǒng)計(jì)的胚胎數(shù)目)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，首次發(fā)現(xiàn)在經(jīng)典Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中， 蓬亂蛋白(Dvl)可與e-連環(huán)蛋白(e-cat)在Wnt激活的條件下可發(fā)生相互作 用，從而促進(jìn)e-cat的積累及Wnt下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的異常激活。由于Wnt 下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的異常激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因此依據(jù)該新發(fā)現(xiàn)的 Dvl禾叩-cat之間的相互作用機(jī)制，可提供通過(guò)抑制Wnt下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)從而 實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤發(fā)生的新的藥物靶點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
蓬亂蛋白及其活性片段
目前發(fā)現(xiàn)的蓬亂蛋白(Dvl)家族成員有三種，即Dvll、 Dvl2、 Dvl3，這三 種蛋白具有較高的同源性。在以往的研究中，Dvl蛋白最初被作為一個(gè)細(xì)胞質(zhì) 蛋白參與經(jīng)典Wnt信號(hào)的傳遞，它的主要功能是在細(xì)胞質(zhì)中接受Wnt信號(hào)促使 (3-cat在細(xì)胞質(zhì)中積累從而能夠大量進(jìn)入細(xì)胞核中啟動(dòng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。近 來(lái)，本領(lǐng)域人員發(fā)現(xiàn)Dvl蛋白不僅在細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)導(dǎo)Wnt信號(hào)，而且在細(xì)胞核中 也具有重要的作用，但對(duì)其作用機(jī)制尚不了解。然而，本發(fā)明人經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期研究，對(duì)此作用機(jī)制有了進(jìn)一步的揭示。
在本發(fā)明中，所用的Dvl蛋白可以是天然存在的，比如其可被純化和分離 自哺乳動(dòng)物。優(yōu)選的，所述天然存在的Dvl 1蛋白的氨基酸序列可以與SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列基本上相同；Dvl 2蛋白的氨基酸序列可以與SEQ ID N0: 3所示的氨基酸序列基本上相同；Dvl3蛋白的氨基酸序列可以與SEQIDN0: 4 所示的氨基酸序列基本上相同。此外，所述的Dvl蛋白也可以是重組制備的， 比如可以根據(jù)常規(guī)的基因重組技術(shù)來(lái)生產(chǎn)重組的Dvl蛋白。優(yōu)選的，本發(fā)明釆 用重組的Dvl蛋白。此外，任何不影響Dvl蛋白的生物活性的變化形式都可用 于本發(fā)明中，例如Dvl蛋白的活性片段、衍生物，只要其也具有與P-cat相互 作用的功能，且不會(huì)帶來(lái)其它不良影響，如可以是含有Dvl蛋白第496 695位 氨基酸的蛋白片段。
本發(fā)明還提供了一種由Dvl 1蛋白第496 695位氨基酸組成的多肽，本發(fā) 明人將之命名為Dvl l-C多肽(片段)，該多肽具有SEQ ID N0: 5所示的氨基酸 序列。
所述的Dvl l-C多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選合成片 段。所述的Dvl l-C多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使 用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物 細(xì)胞)中產(chǎn)生。此外，任何不影響Dv11-C多肽的生物活性的變化形式都可用于 本發(fā)明中，例如Dvl 1-C多肽的活性片段、衍生物或經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸(通 常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-IO個(gè))缺失、插入和 /或取代形成的變異體，只要其也具有與P -cat相互作用的功能。
本發(fā)明還提供了Dvl l-C多肽的編碼基因。所述的編碼基因可以是單鏈的 或是雙鏈的。
優(yōu)選的，為了使得Dvl 1-C被定位到細(xì)胞核中，可將Dvl l-C與核定位 信號(hào)(入核信號(hào))相連接；更優(yōu)選的，可在Dvl 1-C的C末端添加核定位信號(hào)。 因此，本發(fā)明還提供了一種Dvl l-C-NLS蛋白，其能夠與e -cat蛋白相互作用。 在細(xì)胞內(nèi)，所述的Dvl 1-C-NLS被定位到細(xì)胞核中，通過(guò)與P-cat蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié) 合，抑制細(xì)胞核內(nèi)Dvl與P-cat的相互作用。
所述的核定位信號(hào)是一種信號(hào)肽，其可幫助蛋白進(jìn)入細(xì)胞核。本發(fā)明可采 用任何不影響Dvl l-C與P-cat蛋白相互作用的核定位信號(hào)。例如，所述的核定位信號(hào)具有氨基酸序列如下DPKKKRKV DPKKKRKV DPKKKRKV (SEQ ID NO: 7)。 一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法或人工合成法來(lái)大批量地獲得有 關(guān)序列。重組法通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增 殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
e-連環(huán)蛋白及其活性片段
e-連環(huán)蛋白(P-cat)是一種多功能胞內(nèi)蛋白，不僅參與細(xì)胞與細(xì)胞間的 黏附，而且能介導(dǎo)Wnt信號(hào)的胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，Dvl蛋白可與P-cat 蛋白發(fā)生相互作用。
在本發(fā)明中，所用的P-cat蛋白可以是天然存在的，比如其可被純化和分 離自哺乳動(dòng)物。優(yōu)選的，所述天然存在的P -cat蛋白的氨基酸序列可以與SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列基本上相同。此外，所述的e-cat蛋白也可以是重組 制備的，比如可以根據(jù)常規(guī)的基因重組技術(shù)來(lái)生產(chǎn)重組的P-cat蛋白。優(yōu)選的， 本發(fā)明采用重組的P -cat蛋白。
此外，任何不影響e-cat蛋白的生物活性的變化形式都可用于本發(fā)明中， 例如0-cat蛋白的生物活性片段、衍生物，只要其也具有與Dvl蛋白相互作用 的功能，并且不會(huì)帶來(lái)其它不良影響。
應(yīng)用及篩選方法
在研究過(guò)程中，本發(fā)明人通過(guò)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)外、內(nèi)源結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí) 了 Dvl禾叩-cat之間存在相互作用，并分別在真核細(xì)胞和模式生物斑馬魚(yú)中進(jìn) 行各種功能分析實(shí)驗(yàn)，闡明了Dvl蛋白與e-cat蛋白之間存在相互作用，并且 所述的相互作用對(duì)于經(jīng)典Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑產(chǎn)生了影響，抑制所述的相互作用 可抑制經(jīng)典Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑下游的基因轉(zhuǎn)錄。
首先，本發(fā)明人利用免疫組化技術(shù)檢測(cè)結(jié)腸癌組織以及正常組織中Dvl3的 分布情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在很多結(jié)腸癌樣本中Dvl3在細(xì)胞核里有大量的積累， 而在正常的組織細(xì)胞中Dvl在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核都有分布，而胞質(zhì)中的量遠(yuǎn)高于 核內(nèi)。因此，可見(jiàn)，在腫瘤組織中Dvl蛋白可在細(xì)胞核中大量積累。
接著，本發(fā)明人利用免疫沉淀技術(shù)，分析了 Dvl和p-cat蛋白在細(xì)胞核中 的相互作用情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，|3-cat本身不能通過(guò)與Flag抗體結(jié)合免疫沉淀得 到，只有在轉(zhuǎn)染了 Dvl3-NLS-Flag的情況下內(nèi)源的(5-cat才能在免疫沉淀樣品中檢測(cè)到，這提示Dvl在細(xì)胞內(nèi)可以和p-cat發(fā)生蛋白質(zhì)相互作用。進(jìn)一步的 體外Pull Down實(shí)驗(yàn)證明，用myc抗體免疫沉淀His-(3-cat-myc可以共沉淀到 His-Dvl3，這說(shuō)明Dvl禾叩-cat之間蛋白質(zhì)相互作用是直接的。并且，Dvl和 p-catenin在體內(nèi)存在蛋白質(zhì)相互作用受到Wnt信號(hào)的調(diào)節(jié)。
進(jìn)一步地，本發(fā)明人通過(guò)構(gòu)建Dvl缺失突變體，深入研究了 Dvl和p-cat 之間的相互作用在經(jīng)典Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的功能。通過(guò)體外結(jié)合發(fā)現(xiàn) His-C-flag和His-(3-cat-myc之間存在直接相互作用。進(jìn)一步在HEK293T中共 轉(zhuǎn)染含有入核信號(hào)的C-NLS-Flag、 Dvll-NLS-HA和(3-catenin-myc質(zhì)粒，競(jìng)爭(zhēng) 結(jié)合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)C-NLS-Flag能夠阻斷Dvl和p-catenin之間的相互作用。
本發(fā)明人還將帶有入核信號(hào)(NLS)的C片段分別轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞中， 通過(guò)Topflash報(bào)告基因的活性來(lái)檢測(cè)它們對(duì)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄活性的影響。 結(jié)果證實(shí)，Dvl-C-NLS片段是在核里p-cat的下游發(fā)揮作用的，通過(guò)阻斷Dvl 和P-catenin的相互作用來(lái)抑制Wnt3a激活的轉(zhuǎn)錄活性。
本發(fā)明人還利用核染色質(zhì)免疫沉淀的方法(Chip)來(lái)研究Dvl與p-cat之間 的相互作用對(duì)Wnt3a激活前后轉(zhuǎn)錄復(fù)合物形成的影響。結(jié)果表明，Dvl與 卩-catenin之間的相互作用對(duì)于Wnt3a誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的形成是必需的。
本發(fā)明人還利用模式生物斑馬魚(yú)來(lái)檢測(cè)Dvl和(3-catenin之間的相互作用 在生物體中的功能。在斑馬魚(yú)胚胎一至四細(xì)胞的時(shí)期注射Dv1-C-NLS的mRNA， 分別在胚胎發(fā)育的二個(gè)時(shí)期動(dòng)物極細(xì)胞包被40%和胚盾時(shí)期收獲胚胎，利用 原位雜交的技術(shù)來(lái)檢測(cè)Wnt信號(hào)途徑下游基因Ko;f和t&6的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 注射Dvl-C-NLS的raRNA的胚胎中Ko義和";^的表達(dá)明顯地較對(duì)照組胚胎下降。 這一結(jié)果表明，Dvl和(3-cat之間的相互作用在斑馬魚(yú)的發(fā)育過(guò)程中的功能。
基于本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，對(duì)Dvl蛋白或其活性片段與P -cat蛋白或其活性 片段相互作用的研究有著多方面的用途，所述的用途包括(但不限于)篩選抑 制Dvl蛋白或其活性片段與P -cat蛋白或其活性片段相互作用的物質(zhì)，從而抑 制經(jīng)典Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的異常激活，以防治由于經(jīng)典Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的異 常激活導(dǎo)致的疾病，如腫瘤。
因此，本發(fā)明提供了一種篩選調(diào)節(jié)Dvl蛋白與P-cat蛋白相互作用的調(diào)節(jié) 劑方法，通過(guò)向Dvl蛋白與P -cat蛋白相互作用的反應(yīng)體系中添加待篩選的候選物，并觀察Dvl蛋白與P-cat蛋白的相互作用情況來(lái)進(jìn)行篩選。所述方法包
括以下步驟
(a) 將候選物質(zhì)與Dvl蛋白與P-cat蛋白相互作用的體系接觸；和
(b) 檢測(cè)候選物質(zhì)對(duì)Dvl蛋白與e-cat蛋白相互作用的影響；
其中，若所述候選物質(zhì)可抑制或促進(jìn)Dvl蛋白與e-cat蛋白相互作用，則 表明該候選物質(zhì)是調(diào)節(jié)Dvl蛋白與P -cat蛋白相互作用的調(diào)節(jié)劑。
更優(yōu)選的，步驟(a)包括在Dvl蛋白與e-cat蛋白相互作用的體系中添 加候選物質(zhì)；和步驟(b)包括檢測(cè)Dvl蛋白與e-cat蛋白相互作用情況，并 與對(duì)照組比較，其中所述的對(duì)照組是不添加所述候選物質(zhì)的、Dvl蛋白與P-cat 蛋白相互作用的體系。
作為篩選的條件，若測(cè)試組中Dvl蛋白與e -cat蛋白相互作用在統(tǒng)計(jì)學(xué)上 低于(優(yōu)選顯著低于，如低20%;更優(yōu)選的低40%)對(duì)照組，就表明該候選物質(zhì) 是抑制Dvl蛋白與e -cat蛋白相互作用的調(diào)節(jié)劑；若測(cè)試組中Dvl蛋白與P -cat 蛋白相互作用在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于(優(yōu)選顯著低于，如高20%;更優(yōu)選的高40%)對(duì)照 組，就表明該候選物質(zhì)是促進(jìn)Dvl蛋白與e-cat蛋白相互作用的調(diào)節(jié)劑。
如本文所用，所述的"蓬亂蛋白和(或"與")連環(huán)蛋白相互作用的體系" 指一種體系，其中含有蓬亂蛋白和P-連環(huán)蛋白，并且蓬亂蛋白和P-連環(huán)蛋白可發(fā)生相互作用(如相互結(jié)合)。
在本發(fā)明中，所述的體系選自(但不限于)溶液體系、細(xì)胞體系、亞細(xì)胞
體系、組織體系、器官體系、或動(dòng)物體系。
作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述體系中還包含Wnt家族蛋白。例如，所述的 Wnt家族蛋白包括(但不限于)Wntl、 Wnt3a、 Wnt8。
調(diào)節(jié)蓬亂蛋白與0-連環(huán)蛋白相互作用的物質(zhì)及其組合物
通過(guò)上述方法初步篩選出的調(diào)節(jié)劑可構(gòu)成一個(gè)篩選庫(kù)，以便于人們最終可 以從中篩選出能夠?qū)τ谡{(diào)節(jié)Wnt信號(hào)途徑有用的藥物。
本發(fā)明還提供了一種通過(guò)所述的方法篩選獲得的調(diào)節(jié)Dvl蛋白與P -cat蛋白 相互作用的物質(zhì)。例如，所述物質(zhì)是抑制Dvl蛋白與P -cat蛋白相互作用的物質(zhì)， 如抑制劑、拮抗劑、阻滯劑；或者，所述物質(zhì)是促進(jìn)Dvl蛋白與P-cat蛋白相 互作用的物質(zhì)，如促進(jìn)劑、激動(dòng)劑。通常，抑制Dvl蛋白與P-cat蛋白相互作 用的物質(zhì)可抑制Wnt信號(hào)途徑的異常激活，從而可防治Wnt信號(hào)途徑的異常激活導(dǎo)致的疾病，因此，Dvl蛋白與e-cat蛋白相互作用的抑制劑、拮抗劑、阻 滯劑是尤其有用的。
此外，針對(duì)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的Dvl蛋白與P-cat蛋白之間的相互作用特性，還 可設(shè)計(jì)一些通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合或抑制其中一種蛋白而阻止Dvl蛋白與P-cat蛋白結(jié) 合的物質(zhì)。除了作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，提供了一種基于Dvl l設(shè)計(jì)的可 通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合e-cat蛋白來(lái)阻止胞內(nèi)Dvl蛋白與e-cat蛋白相互作用的物 質(zhì)，即Dvl 1-C多肽。更優(yōu)選的，將Dvl l-C多肽與核定位信號(hào)(NLS)相連接， 從而其在被導(dǎo)入細(xì)胞后，可直接被定位到細(xì)胞核中，在細(xì)胞核中阻止Dvl蛋白 與P-cat蛋白的相互作用。
所述的Dvl蛋白與e-cat蛋白相互作用的調(diào)節(jié)劑，可以施用于個(gè)體，用于 調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Wnt信號(hào)途徑的活性。通常，可將這些物質(zhì)配制于無(wú)毒的、惰性的 和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8， 盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥 物組合物可以通過(guò)常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、 或皮下給藥。
本發(fā)明還提供了一種組合物(如藥物組合物)，它含有安全有效量的(a) Dvl 蛋白與e-cat蛋白相互作用的調(diào)節(jié)劑，以及(b)藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。 所述的Dvl蛋白與e-cat蛋白相互作用的調(diào)節(jié)劑優(yōu)選一種抑制劑，如Dvl 1-C 多肽。
目前，已知DNA序列，將該目的DNA序列引入到各種已知DNA分子(如載 體)和細(xì)胞中是本領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)， 一般人員只要根據(jù)本發(fā)明的提示，都可 以方便的進(jìn)行操作。此外，將各種形式的突變引入到各種DNA分子中也是本領(lǐng) 域熟知的技術(shù)。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動(dòng)子、增 強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞也是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)。當(dāng)宿主為 原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用 CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。可供選擇的是用MgCl2。如果需 要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。 獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)目的多肽。
在本發(fā)明中，檢測(cè)蛋白與蛋白之間相互作用以及相互作用的強(qiáng)弱可采用多 種本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)，比如GST沉降技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、酵母雙 雜交系統(tǒng)或免疫共沉淀技術(shù)。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選方式中，采用免疫沉淀技術(shù)來(lái)驗(yàn)證蛋白與蛋白之間的 特異性相互作用。所述的免疫共沉淀技術(shù)的原理是在保持蛋白-蛋白相互作 用的條件下，收獲和裂解細(xì)胞，從細(xì)胞提取液中特異性地免疫沉淀目的蛋白， 然后通過(guò)電泳等方法分離免疫沉淀物。具有已知特性的蛋白的共沉淀，可采用 抗該蛋白的抗體，通過(guò)比如Western印跡來(lái)檢測(cè)。此外，如果細(xì)胞在裂解前已 經(jīng)用標(biāo)記物進(jìn)行過(guò)標(biāo)記，則可通過(guò)放射自顯影或其它免疫學(xué)技術(shù)來(lái)觀察共沉淀 的蛋白。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于
(1) 首次揭示在經(jīng)典Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，Dvl蛋白可與0 -cat蛋白在Wnt 激活的條件下可發(fā)生相互作用，從而促進(jìn)P -cat的積累及Wnt下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 途徑的異常激活。
(2) 由于已知Wnt途徑下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的異常激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切 相關(guān)，因此，依據(jù)本發(fā)明的新發(fā)現(xiàn)，可提供抑制Wnt下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)從而實(shí)現(xiàn) 抑制腫瘤發(fā)生的新的藥物靶點(diǎn)。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō) 明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方 法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠 商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
除非另行定義，文中所使用的所有專(zhuān)業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟 悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于 本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例1
Dvl蛋白質(zhì)在結(jié)腸癌組織中定位到細(xì)胞核中
本發(fā)明人利用常規(guī)的免疫組化技術(shù)檢測(cè)結(jié)腸癌組織芯片，組織芯片經(jīng)過(guò)二 甲苯脫臘、復(fù)水、抗原熱修復(fù)、染色，然后進(jìn)行顯微成像檢測(cè)(所采用的芯片 來(lái)源于上海芯超生物科技有限公司，檢測(cè)方法參照其所附的使用說(shuō)明書(shū))。
結(jié)果如圖l所示，對(duì)比正常的組織細(xì)胞，在93例結(jié)腸癌樣本中有30%左右 的樣本中發(fā)現(xiàn)Dvl3在細(xì)胞核里有大量的積累；而在正常細(xì)胞中Dvl3在細(xì)胞質(zhì) 和細(xì)胞核都有分布，且胞質(zhì)中的量遠(yuǎn)高于核內(nèi)。
實(shí)施例2
Dvl和p-cat相互作用
1. Dvl以及e-cat基因的獲得
Dvll基因的獲得
設(shè)計(jì)引物如下正向5'-CTAGTCTAGAGGCGGAGACCAAAATCA-3， (SEQ ID N0: 9)，反向5，-CTAGCTCGAGCATGATGTCCACAAAGAA-3， (SEQ ID NO: 10)。以常規(guī)方法制備的鼠cDNA庫(kù)為模板，通過(guò)PCR反應(yīng)得到含有全長(zhǎng)Dvll 的序列。
Dvl3基因的獲得
設(shè)計(jì)引物如下正向5，-CTAGTCTAGAGGGCGAGACCAAGAT-3， (SEQ ID NO: 11)，反向5，-CTAGCTCGAGCATCACATCCACAAAGA-3， (SEQ ID NO: 12)。以常規(guī)方法制備的人cDNA庫(kù)為模板，通過(guò)PCR反應(yīng)得到含有全長(zhǎng)Dvl3 的序列。
(3-cat基因的獲得
利用常規(guī)方法分別針對(duì)P-cat蛋白(序列見(jiàn)SEQ ID NO: l)編碼基因的5' 和3，末端設(shè)計(jì)正向和反向引物(在引物中添加X(jué)bal/Xhol酶切位點(diǎn))，利用所 述引物、以常規(guī)方法制備的人cDNA庫(kù)為模板，通過(guò)PCR反應(yīng)得到含有全長(zhǎng) p-cat的序列。2. Dvl在細(xì)胞內(nèi)可以和p-cat發(fā)生蛋白質(zhì)相互作用
為了驗(yàn)證Dvl在細(xì)胞核中的功能，本發(fā)明人采用常規(guī)的方法在Dvl基因的 后面引入了一個(gè)核定位信號(hào)，通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染導(dǎo)入細(xì)胞，進(jìn)行功能分析。 ' 為了證實(shí)這一相互作用，本發(fā)明人首先構(gòu)建了攜帶Dvl3-NLS-Flag的載體 pCMV/Dv13-NLS-Flag,方法如下利用引物退火后二端帶有的Xbal/Notl酶切 位點(diǎn)的粘端，將NLS的基因序列(序列為5， -CTAGACTAGACCTAGCTCGAGGATC
AG-3， (SEQ ID NO: 8))引入pCMV/Flag(購(gòu)自Bioscience,自帶Flag標(biāo)簽)中， 形成pCMV/NLS-Flag;然后再利用Xbal/Xhol酶切Dvl3，將酶切產(chǎn)物克隆入經(jīng) 同樣酶切的pCMV/NLS-Flag中，獲得重組載體pCMV/Dvl3-NLS-Flag。
接著，在人的胚胎腎細(xì)胞HEK293T細(xì)胞(ATCC)中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染該外源的 pCMV/Dvl3-NLS-Flag重組載體，轉(zhuǎn)染后加Wnt3a(Wnt3a通過(guò)收獲wnt3a/NIH3T3 細(xì)胞的培養(yǎng)上清獲得，wnt3a/NIH3T3細(xì)胞及其培養(yǎng)方法參見(jiàn)尹宗生，張輝等， 《第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)》，Vol.26， No.24， p2212-2215， 2006)刺激細(xì)胞，收獲 細(xì)胞，用IX裂解緩沖液(NP40 1%，甘油10%, NaClO. 135M, Tris-CI PH8. 0， PMSF0. 5M, PPi lmM， NaF 10mM, Na3V04 2mM)裂解細(xì)胞，離心(14， OOOrpm/lOmin) 后取上清，加入抗Flag抗體(anti-Flag,購(gòu)自Sigma)和protein A/G Plus agarose珠子，低溫旋轉(zhuǎn)3小時(shí)，離心(5000rpm/lmin)收集珠子，通過(guò)Western 印跡檢測(cè)珠子上所帶的蛋白(上述過(guò)程即Pull Down實(shí)驗(yàn))。結(jié)果見(jiàn)圖2A。
由圖2A所示，cat本身不能通過(guò)與抗Flag抗體(anti-flag)結(jié)合免疫 沉淀得到，只有在轉(zhuǎn)染了 Dvl3-NLS-Flag的情況下內(nèi)源的(5-cat才能在免疫沉 淀樣品中檢測(cè)到。上述結(jié)果提示，Dvl在細(xì)胞內(nèi)可以和(5-cat發(fā)生蛋白質(zhì)相互 作用。
3. Dvl和p-連環(huán)蛋白之間蛋白質(zhì)相互作用是直接的
為了確定Dvl禾叩-cat之間的蛋白質(zhì)相互作用是否為直接作用，本發(fā)明人 首先構(gòu)建了含有His-Dvl3和His-(5-cat-myc的重組載體。含有His-Dvl3的重 組載體構(gòu)建如下以SalI/Notl酶切Dv13，將酶切產(chǎn)物克隆入經(jīng)過(guò)同樣酶切的 pET28c/His (購(gòu)自Novagen，自帶His標(biāo)簽)中，獲得重組載體pET28c/His-Dvl3。 含有His-(5-cat-myc的重組載體構(gòu)建如下在(3-cat基因的C端連接常規(guī)使用 的rayc標(biāo)簽，形成P-cat-myc，然后通過(guò)常規(guī)的引物設(shè)計(jì)和PCR技術(shù)在(5-cat-myc的末端設(shè)置SalI/Notl酶切位點(diǎn)，克隆入經(jīng)同樣酶切的pET28c/His載體(購(gòu)自 Novagen，自帶His標(biāo)簽)中，獲得重組載體pET28c/His-p-cat-myc。
接著，利用大腸桿菌表達(dá)得到了His-Dvl3和His-p-cat-myc(P-cat-myc)。 重組表達(dá)質(zhì)粒pET28c/His-Dvl3和pET28c/His-(3-cat-myc分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21，接種單克隆菌落于LB培養(yǎng)液，37。C培養(yǎng)過(guò)夜；取上述過(guò)夜菌1:100接 種于新鮮的LB培養(yǎng)基中，22'C培養(yǎng)至A600為0.6 0.8，分別加入異丙基硫代 半乳糖苷(IPTG)達(dá)終濃度luM， 22'C培養(yǎng)16 h。離心收集菌體，將菌體溶于 含有0.5mg/ml溶菌酶的破菌緩沖液中，液氮凍融，反復(fù)三次，加入DNaseI至 終濃度為25 mg/ml以及MgS04至終濃度20 mM，冰上消化至不粘，高速離心(16000 rpm/20min)后取上清得到破菌抽提物，進(jìn)行體外Pull Down實(shí)驗(yàn)(實(shí)驗(yàn)方法同 前述)。
由圖2B所示，在體外Pull Down實(shí)驗(yàn)中用抗myc抗體(購(gòu)自Sigma)免疫沉 淀His-p-cat-myc可以共沉淀到His-Dvl3，這說(shuō)明Dvl和(3-cat之間蛋白質(zhì)相 互作用是直接的。
4. Dvl和P-連環(huán)蛋白之間相互作用需要Wnt3a的刺激
為了進(jìn)一步證實(shí)(i-cat和Dvl在內(nèi)源是否存在相互作用，本發(fā)明人分別收 獲Wnt3a刺激或不刺激的HEK293T細(xì)胞(非轉(zhuǎn)染)，分離細(xì)胞核得到核組分上 清，分別用IgG和抗Dvl3抗體(anti-Dvl3，購(gòu)自Santz Cruz)免疫沉淀內(nèi)源 的Dvl3。
由圖2C所示，只有在Wnt3a刺激的條件下Dvl3才能共沉淀到內(nèi)源的p-cat。
綜上，這些實(shí)驗(yàn)一致證明，Dvl和p-cat在體內(nèi)存在蛋白質(zhì)相互作用并且這 種相互作用受到Wnt3a信號(hào)的調(diào)節(jié)。
實(shí)施例3
Dvl和p-連環(huán)蛋白之間的相互作用在經(jīng)典Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的功能
本發(fā)明人通過(guò)常規(guī)的缺失突變技術(shù)對(duì)Dvl l進(jìn)行缺失突變，并驗(yàn)證各突變 體與|3-cat的相互作用情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Dvl l上第496 695位氨基酸是與卩-cat 相互作用的片段(Dvl l-C，簡(jiǎn)稱(chēng)C)。為了便于后續(xù)的克隆，通過(guò)常規(guī)的引物設(shè) 計(jì)和PCR技術(shù)在Dvl 1-C基因片段的末端設(shè)置SalI/Notl(或Xbal/XhoI)酶切位點(diǎn)的序列；另一種情況下，在Dvl 1-C基因片段的C端連接常規(guī)使用的Flag(或 myc)標(biāo)簽，形成Dvll-C-flag(或Dvll-C-myc)，然后在Dvl 1-C-flag(或myc) 的末端設(shè)置Sall/NotI (或Xbal/Xhol)酶切位點(diǎn)。
首先，構(gòu)建含有His-C-flag和His-p-cat-myc的重組載體。含有 His-C-flag的重組載體構(gòu)建如下將C端帶有Flag標(biāo)簽的Dvl 1-C-flag用 Sall/NotI酶切，克隆入經(jīng)同樣酶切的pET28c/His載體中，獲得重組載體 pET28c/His-C-flag 。
含His-p-cat-myc的重組載體構(gòu)建同上(即 pET28c/His-(3-cat-myc)。
接著，將前述構(gòu)建的重組載體分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21，在大腸桿菌BL21 中分別表達(dá)得到His-C-flag蛋白和His-(3-cat-myc(His-P -cat-myc)蛋白，通 過(guò)體外結(jié)合發(fā)現(xiàn)His-C-flag和His-p-cat-rayc之間存在直接相互作用，如圖 3A所示，用抗myc抗體(anti-myc)免疫沉淀His-p-cat-myc時(shí)能夠共沉淀到 His-C-flag。
進(jìn)一步地，本發(fā)明人在HEK293T中共轉(zhuǎn)染含有C-NLS-Flag、 Dvll-NLS-HA 和(3-cat-myc的質(zhì)粒pCMV/C-NLS-Flag、pCMV/Dvll-NLS-HA和pCMV/p-cat-myc。 其中，pCMV/C-NLS-Flag重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法同前pCMV/Dv13-NLS-Flag構(gòu)建方 法，以Dvl 1-C取代Dvl3。 pCMV/Dvll-NLS-HA重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法同前 pCMV/Dvl3-NLS-Flag構(gòu)建方法類(lèi)似，采用pCMV/HA(購(gòu)自購(gòu)自Bioscience,自 帶HA標(biāo)簽)取代pCMV/Flag，且以Dvll取代Dvl3。 pCMV/(3-cat-myc重組質(zhì)粒 的構(gòu)建方法如下將(3-cat基因用Xbal/Xhol酶切，克隆入經(jīng)同樣酶切的 pCMV/myc載體(購(gòu)自Bioscience,自帶rayc標(biāo)簽)中，獲得重組載體 pCMV/(3-cat-myc 。將前述制備的重組載體轉(zhuǎn)染入HEK293T中，分別表達(dá) C-NLS-Flag、 Dvll-NLS-HA和(5-cat-myc。通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，C-NLS-Flag 能夠阻斷Dvl和(3-cat之間的相互作用。
如圖3B所示，在共轉(zhuǎn)染了 C-NLS-Flag的情況下，用抗HA抗體(anti-HA， 購(gòu)自Sigma)免疫沉淀Dvll-NLS-HA不能共沉淀到(3-cat-rayc。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō) 明，Dvl l上的片段C是負(fù)責(zé)和p-cat相互作用的片段。
為了進(jìn)一步研究所述的相互作用在Wnt/(5-cat信號(hào)途徑中的作用，本發(fā)明 人構(gòu)建了帶有入核信號(hào)(NLS)和Dvl 1-C片段的重組載體pCMV/C-NLS (將C-NLS用Xbal/Xhol酶切，克隆入經(jīng)同樣酶切的pCMV載體(購(gòu)自Bioscience)中)，將 該重組載體轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞中，通過(guò)Topflash報(bào)告基因的活性來(lái)檢測(cè)它 們對(duì)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄活性的影響。以常規(guī)的LacZ作為空白質(zhì)粒對(duì)照，并且， Wnt3a為在服K293T細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入Wnt3a的情況，Ctr為不利用Wnt3a
進(jìn)行刺激、其它條件相同的情況。
由圖3C所示，Dvl 1-C-NLS能夠有效地抑制Wnt3a激活的Topflash活性。
此外，本發(fā)明人還將上述重組載體轉(zhuǎn)染SW180細(xì)胞(購(gòu)自ATCC,是APC蛋 白功能缺失的結(jié)腸癌細(xì)胞株)，通過(guò)T叩flash報(bào)告基因的活性來(lái)檢測(cè)它們對(duì)轉(zhuǎn) 錄復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄活性的影響。Topflash報(bào)告基因來(lái)源于Upstate公司；報(bào)告基 因的活性檢測(cè)采用Luciferase Reporter Gene Assay, High Sensitivity, 來(lái)源于Roche公司，檢測(cè)方法參見(jiàn)同時(shí)提供的使用說(shuō)明書(shū)。
結(jié)果如圖3D所示，在SW480細(xì)胞中，Dvl 1-C-NLS對(duì)T叩flash活性的抑 制是劑量依賴(lài)的(其中，"+ "表示含100ngDvl-C-NLS， " +屮"表示含300ng Dvl-C-NLS)。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了 Dvl 1-C-NLS片段是在核里(3-cat的下游發(fā) 揮作用的，通過(guò)阻斷Dvl和(3-cat的相互作用來(lái)抑制Wnt3a激活的轉(zhuǎn)錄活性。
從以上的實(shí)驗(yàn)本發(fā)明人證明了 Dvl和(3-cat之間的相互作用對(duì)于Wnt3a激 活的轉(zhuǎn)錄活性是必需的。進(jìn)一步本發(fā)明人利用核染色質(zhì)免疫沉淀的方法(ChIP) 來(lái)研究Dvl與p-cat之間的相互作用對(duì)Wnt3a激活前后轉(zhuǎn)錄復(fù)合物形成的影響。 HEK293T細(xì)胞加入Wnt3a刺激3小時(shí)，然后通過(guò)甲醛固定細(xì)胞，超聲裂解細(xì)胞， 預(yù)結(jié)合等步驟得到可用于免疫沉淀的上清，分別加入IgG抗體(購(gòu)自sigma)、 P-cat抗體(購(gòu)自BD. Biotech)或TCF-4抗體(購(gòu)自Upstate)和protein A/G Plus agarose珠子進(jìn)行免疫沉淀，然后進(jìn)行洗滌和洗脫得到可用于PCR擴(kuò)增的 樣品，最后通過(guò)Agarose電泳檢測(cè)。
結(jié)果如圖3E所示，在Wnt3a刺激下，(3-cat和TCF-4能夠結(jié)合到Wnt信號(hào) 下游靶基因c-rayc啟動(dòng)子上，在轉(zhuǎn)染Dvl 1-C-NLS片段的細(xì)胞中，p-cat結(jié)合 到下游靶基因c-myc啟動(dòng)子上的能力顯著地降低，而TCF-4基本不受影響。這 表明Dvl與(3-cat之間的相互作用對(duì)于Wnt3a誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的形成是必需 的。最后本發(fā)明人利用模式生物斑馬魚(yú)來(lái)檢測(cè)Dvl和(5-cat之間的相互作用在 生物體中的功能。
本發(fā)明人在斑馬魚(yú)胚胎一至四細(xì)胞的時(shí)期注射Dvl 1-C-NLS的mRNA。然后， 分別在胚胎發(fā)育的二個(gè)時(shí)期動(dòng)物極細(xì)胞包被40%和胚盾時(shí)期(shield phage) 收獲胚胎，利用常規(guī)的原位雜交技術(shù)來(lái)檢測(cè)Wnt信號(hào)途徑下游基因ro;r和 的表達(dá)。并且，以向斑馬魚(yú)胚胎細(xì)胞內(nèi)注射綠色熒光蛋白(GFP)的mRNA來(lái)作 為對(duì)照。
結(jié)果如圖4所示，注射Dvl 1-C-NLS的mRNA的胚胎中rax和t&6的表達(dá) 明顯地較對(duì)照組胚胎下降(圖4A)，對(duì)99個(gè)胚胎統(tǒng)計(jì)后有51%的胚胎中"義6的 表達(dá)有明顯下調(diào)，對(duì)83個(gè)胚胎統(tǒng)計(jì)后有59%的胚胎對(duì)yoy的表達(dá)有明顯下調(diào)(圖 4B)。這一結(jié)果表明了 Dvl和p-cat之間的相互作用在斑馬魚(yú)的發(fā)育過(guò)程中的功 能，它對(duì)于Wnt靶基因的啟動(dòng)子上(5-cat/TCF-4的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的形成是必需的。
本發(fā)明人的上述研究揭示了細(xì)胞核內(nèi)Dvl調(diào)節(jié)經(jīng)典Wnt信號(hào)途徑的分子機(jī) 制，揭示了 Dvl與P-cat之間的相互作用的重要性。并且發(fā)現(xiàn)，片段Dvl 1-C-NLS 可抑制轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的形成，從而抑制腫瘤發(fā)生，該發(fā)現(xiàn)為腫瘤藥物的篩選提供 了很好的篩選模型方案，為設(shè)計(jì)分子藥物提供了作用的靶位點(diǎn)。
實(shí)施例4篩選抑制Dvl與p-cat之間相互作用的物質(zhì)
如實(shí)施例2中"2"所述相同的方法，構(gòu)建帶有pET28c/His-Dvl3和 pET28c/His-(3-cat-myc的重組載體。
測(cè)試組添加候選物且轉(zhuǎn)染有pET28c/His-Dvl3和pET28c/His-p-cat-myc 的大腸桿菌BL21細(xì)胞體系。
對(duì)照組未添加候選物且轉(zhuǎn)染有pET28c/His-Dvl3和pET28c/His-P-cat-myc 的大腸桿菌BL21細(xì)胞體系。
采用如實(shí)施例2的Pu11 Down實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)測(cè)試組以及對(duì)照組中Dvl 3蛋白與 (5-cat蛋白相互作用情況。
如果與不添加候選物質(zhì)的對(duì)照組相比較，添加候選物質(zhì)后Dvl 3蛋白與 P - c at蛋白的相互作用明顯被抑制(如利用抗my c抗體免疫沉淀共轉(zhuǎn)染 His-卩-cat-myc與His-Dvl3的體系無(wú)法共沉淀到His-Dvl3),則說(shuō)明該候選物質(zhì) 是抑制Dvl蛋白與(5-cat蛋白之間相互作用的物質(zhì)，因而是一種預(yù)期可影響Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn) 被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后， 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申 請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。序列表
<110>中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院
<120〉蓬亂蛋白和e-連環(huán)蛋白之間的相互作用在經(jīng)典Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的新功能 <130〉 071528 <160> 12
<170〉 Patentln version 3.3
<210> 1 <211〉 781 <212> PRT
<213〉 智人(Homo sapiens) <400> 1
Met Ala Thr Gin Ala Asp Leu Met Glu Leu Asp Met Ala Met Glu Pro
15 10 15
Asp Arg Lys Ala Ala Val Ser His Trp Gin Gin Gin Ser Tyr Leu Asp
20 25 30
Ser Gly lie His Ser Gly Ala Thr Thr Thr Ala Pro Ser Leu Ser Gly
35 40 45
Lys Gly Asn Pro Glu Glu Glu Asp Val Asp Thr Ser Gin Val Leu Tyr
50 55 60
Glu Trp Glu Gin Gly Phe Ser Gin Ser Phe Thr Gin Glu Gin Val Ala 65 70 75 80
Asp lie Asp Gly Gin Tyr Ala Met Thr Arg Ala Gin Arg Val Arg Ala
85 90 95
Ala Met Phe Pro Glu Thr Leu Asp Glu Gly Met Gin lie Pro Ser Thr
100 105 110
Gin Phe Asp Ala Ala His Pro Thr Asn Val Gin Arg Leu Ala Glu Pro
115 120 125
Ser Gin Met Leu Lys His Ala Val Val Asn Leu lie Asn Tyr Gin Asp
130 135 140
Asp Ala Glu Leu Ala Thr Arg Ala lie Pro Glu Uu Thr Lys Leu Uu 145 150 155 160
Asn Asp Glu Asp Gin Val Val Val Asn Lys Ala AI3 Val Met V3I His
165 170 175
Gin Leu Ser Lys Lys Glu Ala Ser Arg His Ala lie Met Arg Ser Pro
180 185 190
Gin Met Val Ser Ala lie Val Arg Thr Met Gin Asn Thr Asn Asp Val
195 200 205
Glu Thr Ala Arg Cys Thr Ala Gly Thr Leu His Asn Leu Ser His His
210 215 220
Arg Glu Gly Leu Leu Ala lie Phe Lys Ser Gly Gly lie Pro Ala Leu 225 230 235 240
Val Lys Met Leu Gly Ser Pro Val Asp Ser Val Uu Phe Tyr Ala lie
245 250 255
Thr Thr Uu His Asn Leu Uu Leu His Gin Glu Gly Ala Lys Met Ala
260 265 270
Val Arg Leu Ala Gly Gly Leu Gin Lys Met Val Ala Leu Leu Asn Lys 275 280 285Thr Asn Val Lys Phe Leu Ala lie Thr Thr Asp Cys Leu Gin lie Leu
2卯 295 300
Ala Tyr Gly Asn Gin Glu Ser Lys Leu lie lie Leu Ala Ser Gly Gly 305 310 315 320
Pro Gin Ala Leu Val Asn lie Met Arg Thr Tyr Thr Tyr Glu Lys Leu
325 330 335
Leu Trp Thr Thr Ser Arg Val Leu Lys Val Leu Ser Val Cys Ser Ser
340 345 350
Asn Lys Pro Ala lie Val Glu Ala Gly Gly Met Gin Ala Leu Gly Leu
355 360 365
His Leu Thr Asp Pro Ser Gin Arg Leu Val Gin Asn Cys Leu Trp Thr
370 375 380
Leu Arg Asn Leu Ser Asp Ala Ala Thr Lys Gin Glu Gly Met Glu Gly 385 390 395 400
Leu Leu Gly Thr Leu Val Gin Leu Leu Gly Ser Asp Asp lie Asn Val
405 410 415
Val Thr Cys Ala Ala Gly lie Leu Ser Asn Leu Thr Cys Asn Asn Tyr
420 425 430
Lys Asn Lys Met Met Val Cys Gin Val Gly Gly lie Glu Ala Leu Val
435 440 445
Arg Thr Val Leu Arg Ala Gly Asp Arg Glu Asp lie Thr Glu Pro Ala
450 455 460
lie Cys Ala Leu Arg His Leu Thr Ser Arg His Gin Glu Ala Glu Met 465 470 475 480
Ala Gin Asn Ala Val Arg Leu His Tyr Gly Leu Pro Val Val Val Lys
485 490 495
Leu Leu His Pro Pro Ser His Trp Pro Leu lie Lys Ala Thr Val Gly
500 505 510
Leu lie Arg Asn Leu Ala Leu Cys Pro Ala Asn His Ala Pro Leu Arg
515 520 525
Glu Gin Gly Ala lie Pro Arg Leu Val Gin Uu Leu Val Arg Ala His
530 535 540
Gin Asp Thr Gin Arg Arg Thr Ser Met Gly Gly Thr Gin Gin Gin Phe 545 550 555 560
Val Glu Gly Val Arg Met Glu Glu lie Val Glu Gly Cys Thr Gly Ala
565 570 575
Leu His lie Leu Ala Arg Asp Val His Asn Arg lie Val lie Arg Gly
580 585 590
Leu Asn Thr lie Pro Leu Phe Val Gin Leu Leu Tyr Ser Pro lie Glu
595 600 605
Asn lie Gin Arg Val Ala Ala Gly Val Leu Cys Glu Leu Ala Gin Asp
610 615 620
Lys Glu Ala Ala Glu Ala lie Glu Ala Glu Gly Ala Thr Ala Pro Leu 625 630 635 640
Thr Glu Leu Leu His Ser Arg Asn Glu Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ala
645 650 655
Ala Val Leu Phe Arg Met Ser Glu Asp Lys Pro Gin Asp Tyr Lys Lys
660 665 670
Arg Leu Ser Val Glu Uu Thr Ser Ser Uu Phe Arg Thr Glu Pro Met
675 680 685
Ala Trp Asn Glu Thr Ala Asp Leu Gly Uu Asp lie Gly Ala Gin Gly
690 695 700
Glu Ala Leu Gly Tyr Arg Gin Asp Asp Pro Ser Tyr Arg Ser Phe His 705 710 715 720
Ser Gly Gly Tyr Gly Gin Asp Ala Leu Gly Met Asp Pro Met Met GluHis Glu Met
Leu Pro Asp 755
Gly Asp Ser 770
725
Gly Gly His His Pro 740
Leu Gly His Ala
Asn Gin Leu Ala 775
Gin 760 Trp
Gly 745 Asp
Phe
730 Ala
Leu
Asp
Asp Met Thr
Tyr
Asp
Asp 780
Pro
Gly 765 Leu
Val 750 Leu
735 Asp
Pro
Gly Pro
<210〉 2
<211> 690
<212〉 PRT
<213〉 鼠(Mus musculus)
<400〉 2
Met 1
Tyr
Phe
Phe
Asp
65
Leu
Asp
Gly
Asn
Arg 145 Gly
Val
Glu
Ser
Arg 225 Met
Phe
Gly
Gly
Phe
Ala
Leu
Lys
Lys
50
Asp
Val
Ser
Asp
Glu 130 Arg
Asp
Leu
Asp
Arg 210 Gin
Ser
Leu
lie
Arg 290 Glu
Glu
Val
Asn
35
Ser
Asn
Leu
His
Ser 115 Thr
Arg
Arg
Ser
Asn 195 Leu
Thr
Leu
Gly
Tyr 275 lie
Asn
Thr
Lys
20
Val
Met
Ala
Ala
Thr 100 Arg
Gly
Asn
Arg
Ser 180 Thr
Val
Asp
Asn
lie 260 lie
Glu
Met
Lys 5
Leu
Leu
Asp
Lys
Glu
85
Asp
Pro
Thr
Arg
Arg 165 Glu
Ser
Arg
Arg
lie 245 Ser
Gly
Pro
Ser
lie
Pro
Ser
Gin
leu
70
Gly
Leu
Pro
Glu
Asp 150 Asp
Leu
Arg
Lys
lie
Val
Asn
Asp
55
Pro
Ala
Pro
Ser
Ser 135 Glu
Leu
Glu
teu
His 215 Ala Ser 230
lie Thr
lie Val
Ser lie
Gly Asp 295 Asn Asp
Tyr
Ala
Arg
40
Phe
Cys
His
Pro
Phe 120 Met
Ala
Gly
Ser
Ser 200 Lys
Ser
Val
Gly
Met 280 Met
Asp
His
Pro
25
Pro
Gly
Phe
Ser
Pro 105 Gin
Val
Ala
Leu
Ser 185 Ser
Cys
Phe
Thr
Gin 265 Lys
Met
10
Glu
Val
Val
Asn
Asp
90
Leu
Ser
Ser
Arg
Pro 170 Ser
Ser
Arg
Ser
Leu 250 Ser
Gly Leu Leu Ala Val
Asp Glu Glu Glu Thr Pro 15
Arg Val Thr Leu Ala Asp 30
His Ala Tyr Lys Phe Phe 45
Val Lys Glu Glu lie Phe 60
Gly Arg Val Val Ser Trp 75 80 Ala Gly Ser Gin Gly Thr 95
Glu Arg Thr Gly Gly lie 110
Ser Arg Asp Gly Met Asp 125
His Arg Arg Glu Arg Ala 140
Thr Asn Gly His Pro Arg 155 160 Pro Asp Ser Ala Ser Thr 175
Phe lie Asp Ser Asp Glu 190
Thr Glu Gin Ser Asn Ser 205
Arg Arg Lys Gin Arg Leu 220
Ser lie Thr Asp Ser Thr 235 240 Asn Met Glu Arg His His 255
Asn Asp Arg Gly Asp Gly 270
Gly Ala Val Ala Ala Asp 285
Gin Val Asn Asp Vsl Asn 300
Arg Val Leu Arg Glu lieVal Ser Gin Thr Gly Pro lie Ser Leu Thr Val Ala Lys Cys Trp Asp
325 330 335
Pro Thr Pro Arg Ser Tyr Phe Thr lie Pro Arg Ala Asp Pro Val Arg
340 345 350
Pro lie Asp Pro Ala Ala Trp Leu Ser His Thr Ala Ala Leu Thr Gly
355 360 365
Ala Leu Pro Arg Tyr Gly Thr Ser Pro Cys Ser Ser Ala lie Thr Arg
370 375 380
Thr Ser Ser Ser Ser Leu Thr Ser Ser Val Pro Gly Ala Pro Gin Leu 385 390 395 400
Glu Glu Ala Pro Leu Thr Val Lys Ser Asp Met Ser Ala lie Val Arg
405 410 415
Val Met Gin Leu Pro Asp Ser Gly Leu Glu lie Arg Asp Arg Met Trp
420 425 430
Leu Lys lie Thr lie Ala Asn Ala Val lie Gly Ala Asp Val Val Asp
435 440 445
Trp Leu Tyr Thr His Val Glu Gly Phe Lys Glu Arg Arg Glu Ala Arg
450 455 460
Lys Tyr Ala Ser Ser Met Leu Lys His Gly Phe Leu Arg His Thr Val 465 470 475 480
Asn Lys lie Thr Phe Ser Glu Gin Cys Tyr Tyr Val Phe Gly Asp Leu
485 490 495
Cys Ser Asn Leu Ala Ser Leu Asn Leu Asn Ser Gly Ser Ser Gly Ala
500 505 510
Ser Asp Gin Asp Thr Leu Ala Pro Leu Pro His Pro Ser Val Pro Trp
515 520 525
Pro Leu Gly Gin Gly Tyr Pro Tyr Gin Tyr Pro Gly Pro Pro Pro Cys
530 535 540
Phe Pro Pro Ala Tyr Gin Asp Pro Gly Phe Ser Cys Gly Ser Gly Ser 545 550 555 560
Ala Gly Ser Gin Gin Ser Glu Gly Ser Lys Ser Ser Gly Ser Thr Arg
565 570 575
Ser Ser His Arg Thr Pro Gly Arg Glu Glu Arg Arg Ala Thr Gly Ala
580 585 590
Gly Gly Ser Gly Ser Glu Ser Asp His Thr Val Pro Ser Gly Ser Gly
595 600 605
Ser Thr Gly Trp Trp Glu Arg Pro Val Ser Gin Leu Ser Arg Gly Ser
610 615 620
Ser Pro Arg Ser Gin Ala Ser Ala Val Ala Pro Gly Leu Pro Pro Uu 625 630 635 640
His Pro Leu Thr Lys Ala Tyr Ala Val Val Gly Gly Pro Pro Gly Gly
645 650 655
Pro Pro Val Arg Glu Leu Ala Ala Val Pro Pro Glu Leu Thr Gly Ser
660 665 670
Arg Gin Ser Phe Gin Lys Ala Met Gly Asn Pro Cys Glu Phe Phe Val 675 680 685
Asp lie 690
說(shuō)明書(shū)第22/28頁(yè)
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Gly
Met Ala 1
lie Tyr
Val Pro
Arg Pro 50
Gly Val 65
Phe Asn
Pro Glu
Pro Ala
Gly Asp 130 Glu Asn 145
Arg Glu
His Arg
Glu Ser
Gly Asp 210 Glu Gin 225
Lys Gin
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Glu Lys
Arg Gly 290 Vsl Ala 305
Asn Asp
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Glu Pro 370 Als Leu 385
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His
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35
Ala
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Gly
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Leu
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Ser 195 Ser
Ser
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Ala
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Gly
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Arg
Glu
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Gly 180 Ser
Asp
Ser
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Glu
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Pro
Pro
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Pro
Leu
Glu
Ser 230 Arg
Ser
Leu
lie
Arg 310 Glu
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Ser
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Gly
Glu
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Tyr
55
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Val
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Ser 135 Thr
Arg
Ser
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Leu
Gly
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Gly
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Glu
Asp
Arg
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Leu
Glu
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Glu
Met
Pro
Gin 360 Pro
Ala
Leu
Gly
Thr
25
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Leu
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Ser
I>eu 185 Ser
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Leu
Arg
lie 265 Ser
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Pro
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Pro
Gly
10
Pro
Asp
Lys
Asp
Val
90
Pro
Pro
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Glu
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Glu
Ser
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lie
Ser
Gly
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Tyr
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Val
Tyr
Phe
Ser
Asn
75
Ser
Arg
Glu
Asn
Ser 155 Glu
Arg
Leu
Arg
Arg 235 Ser
Thr
Val
lie
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lie
Phe
Trp
Gly 395 Gly
Gly
Leu
Lys
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60
Ala
Ser
Ala
Arg
Val
Val
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His
Glu
Phe 220 His
Ser
Val
Gly
Met 300 Met
Asp
Val
Thr
Val 380 Ser
Cys
Glu
Val
Ser
45
Asp
Arg
Asp
Glu
Thr 125 Ser
Val
Gly
Leu
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Arg
Phe
Thr
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Ala
Leu
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Gly
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His
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Leu Arg 160 Gly Gly 175
Gly Tyr
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Arg Arg 240 Ser Val 255
Asn Met
Asn Glu
Gly Ala
Gin Val 320 Arg Val 335
Val Ala
Arg Asn
Ser Ala
Met Ser 400 Arg Gly 415Leu
Pro
lie
His 465 Gly
Phe
Glu
Gly
Trp 545 Tyr
Gly
Gly
Glu
Ser 625 Ser
Asn
Met
Pro
Arg 705 Phe
Ser
Glu
Pro 頓 Val
Leu
Ser
Ser
Ala 530 Pro
Ser
Gly
Ser
Arg 610 Ser
Asp
Leu
Ala
Pro 690 Asp
His
Val His 420 Ser Gly 435
Asn Ala
Glu Gly
Leu Lys
Glu Gin 500 Tyr Leu 515
Ser Asp
Leu Leu
Pro Gin
Gly Ser 580 Thr Arg 595
Ala Pro
Arg Gly
Gly Gly
Arg Als 660 Leu Pro 675
Pro Val Leu Gly Met Ala
Thr
Leu
Phe
Phe
Ala 485 Cys
Val
Gin
Pro
Pro 565 Ala
Ser
Glu
Gly
Pro 645 His
Tyr
Pro
Ser
Met 725
Asp
Glu
Leu
Pro 470 Gly
Tyr
Asn
Asp
Thr 550 Pro
Ser
Asp
Ser
Ser 630 Pro
Pro
Asn
Pro
Val 710 Gly
Met
Val
Gly 455 Glu
Leu
Tyr
Leu
Thr 535 Phe
Pro
Ser
Gly
Lys 615 Leu
Pro
Gly
Pro
Ala 695 Pro
Asn
Ala Ser 425 Arg Asp 440
Ser Asp
Arg Arg
lie Arg
Val Phe 505 Ser Leu 520
Leu Ala
Ser Tyr
Tyr His
Gin His 585 Gly Ala 600
Ser Gly
Arg Arg
Ser Arg
Leu His 665 Met Met 680
Val Gin Pro Glu Pro Ser
Val
Arg
Val
Glu
His 490 Gly
Asn
Pro
Gin
Glu 570 Ser
Gly
Ser
Gly
Gly 650 Pro
Val
Pro
Leu
Glu 730
Thr
Met
Val
Ala 475 Thr
Asp
Asp
Leu
Tyr 555 Leu
Glu
Arg
Gly
Gly 635 Ser
Tyr
Val
Pro
Thr 715 Phe
Lys
Trp
Asp 柳 Arg
Val
Leu
Asn
Pro 540 Pro
Ser
Gly
Thr
Ser 620 Glu
Thr
Gly
Met
Gly 700 Ala
Phe
Ala
Leu 445 Trp
I>ys
Asn
Ser
Asp 525 Gly
Ala
Ser
Ser
Gly 605 Glu
Ala
Gly
Pro
Met 685 Ala
Ser
Val
Met 430 乙ys
Leu
Tyr
Lys
Gly 510 Gly
Ala
Pro
Tyr
Arg 590 Arg
Ser
Ser
Gly
Pro 670 Pro
Pro
Arg
Asp
Ala Al3
lie Thr
Tyr His
Ala Ser 480 lie Thr 495
Gly Cys
Ser Ser
Thr Pro
His Pro 560 Thr Tyr 575
Ser Ser
Pro Glu
Glu Pro
Gly Thr 640 Ala Pro 655
Pro Gly
Pro Pro
Pro Val
Gin Ser 720 Val Met 735
<210〉 4 <211> 716 <212〉 PRT
<213> 智人(Homo sapiens) <400> 4
Met Gly Glu Thr Lys lie lie Tyr His Leu Asp Gly Gin Glu Thr Pro
15 10 15
Tyr Leu Val Lys Leu Pro Leu Pro Ala Glu Arg Val Thr Leu Ala Asp
20 25 30
Phe Lys Gly Val Leu Gin Arg Pro Ser Tyr Lys Phe Phe Phe Lys Ser 35 40 45Met Asp Asp Asp Phe Gly Val Val Lys Glu Glu lie Ser Asp Asp Asn
50 55 60
Ala Lys Leu Pro Cys Phe Asn Gly Arg Val Val Tyr Trp Uu Val Ser 65 70 75 80
Ala Glu Gly Ser His Pro Asp Pro Ala Pro Phe Cys Ala Asp Asn Pro
85 90 95
Ser Glu Leu Pro Pro Pro Met Glu Arg Thr Gly Gly lie Gly Asp Ser
100 105 110
Arg Pro Pro Ser Phe His Pro His Ala Gly Gly Gly Ser Gin Glu Asn
115 120 125
Leu Asp Asn Asp Thr Glu Thr Asp Ser Leu Val Ser Ala Gin Arg Glu
130 135 140
Arg Pro Arg Arg Arg Asp Gly Pro Glu His Ala Thr Arg Leu Asn Gly 145 150 155 160
Thr Ala Lys Gly Glu Arg Arg Arg Glu Pro Gly Gly Tyr Asp Ser Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Met Ser Ser Glu Leu Glu Thr Thr Ser Phe Phe Asp Ser
180 185 190
Asp Glu Asp Asp Ser Thr Ser Arg Phe Ser Ser Ser Thr Glu Gin Ser
195 200 205
Ser Ala Ser Arg Leu Met Arg Arg His Lys Arg Arg Arg Arg Lys Gin
210 215 220
Lys Val Ser Arg lie Glu Arg Ser Ser Ser Phe Ser Ser lie Thr Asp 225 230 235 240
Ser Thr Met Ser Leu Asn lie lie Thr Val Thr Leu Asn Met Glu Lys
245 250 255
Tyr Asn Phe Leu Gly lie Ser lie Val Gly Gin Ser Asn Glu Arg Gly
260 265 270
Asp Gly Gly lie Tyr lie Gly Ser lie Met Lys Gly Gly Ala Val Ala
275 280 285
Ala Asp Gly Arg lie Glu Pro Gly Asp Met Leu Leu Gin Val Asn Glu
290 295 300
lie Asn Phe Glu Asn Met Ser Asn Asp Asp Ala Val Arg Val Leu Arg 305 310 315 320
Glu lie Val His Lys Pro Gly Pro lie Thr Leu Thr Val Ala Lys Cys
325 330 335
Trp Asp Pro Ser Pro Arg Gly Cys Phe Thr Leu Pro Arg Ser Glu Pro
340 345 350
lie Arg Pro lie Asp Pro Ala Ala Trp Val Ser His Thr Ala Ala Met
355 360 365
Thr Gly Thr Phe Pro Ala Tyr Gly Met Ser Pro Ser Leu Ser Thr lie
370 375 380
Thr Ser Thr Ser Ser Ser lie Thr Ser Ser lie Pro Asp Thr Glu Arg 385 390 395 400
Leu Asp Asp Phe His Leu Ser lie His Ser Asp Met Ala Ala lie Val
405 410 415
Lys Ala Met Ala Ser Pro Glu Ser Gly Leu Glu Val Arg Asp Arg Met
420 425 430
Trp Leu Lys lie Thr lie Pro Asn Ala Phe lie Gly Ser Asp Val Val
435 440 445
Asp Trp Leu Tyr His Asn Val Glu Gly Phe Thr Asp Arg Arg Glu Ala
450 455 460
Arg Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Leu Lys Ala Gly Phe lie Arg His Thr 465 470 475 480
Val Asn Lys lie Thr Phe Ser Glu Gin Cys Tyr Tyr lie Phe Gly Asp<formula>formula see original document page 29</formula>130 Leu His Pro 145
Gly Pro Pro
Ser Arg Gin
Val Asp lie 195
135
Leu Thr Lys Ala Tyr Ala Val Val 150 155 Val Arg Glu Leu Ala Ala Val Pro
165 170 Ser Phe Gin Lys Ala Met Gly Asn 180 185
140
Gly Gly Pro Pro Gly 160
Pro Glu Leu Thr Gly 175
Pro Cys Glu Phe Phe 190
<210〉 6
<211〉 588
<212> DNA
<213〉 鼠(Mus musculus)
<400〉 6
ctgtgcagtaacctcgcatccctgaacctc朋cagtggctccagtggagcctcagatcag60
gacacactggccccactgccCC￡lCCC3tCElgtaccctggcccttgggtca aggctacccc120
taccagtacccaggacccccgccctgcttcccacctgcttaccaggaccctggcttcagc180
tgcggcagcggcagtgctgggagccagcagagtg卿ggagcaagagcagtgggtccaca240
cggagcagccatcggaccccaggccg卿ggagcgccgggcaactggagctgggggtagt300
ggC3gtg犯tC3g3CC3C3Cgggtctggt3gcaccggctg gtgggagcgg360
cctgtcagccagcttagccgtggcagtagccctcgaagtcaggcttcagctgttgcccca420
gggctccccccactgcacccccttacaaaggcctatgcagtagtgggtgggccacctgga480
gggccacctgtccgggagctggctgctgtccctccagaacttacaggtagccgccagtcc540
ttcc犯犯ggccatgggaaacccctgtgagttctttgtggacatcatg588
〈210〉 7
<211> 24
<212> PRT <213〉人工序列
<220〉
<221> MISC—FEATURE <223>核定T立信號(hào)
<400> 7
Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 15 10 15
Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 20
<210〉 8
<211〉 94
<212〉 DNA <213〉人工序列
〈220〉
<221> misc_feature
30<223>核定位信號(hào)
<400> 8
Ct3g3Ctag3 CCt3gCtCg3 gg3tCC3333 33g33g3g33 3ggt3g3tCC 333333gaag
ag貼aggtag atccaaaaaa g犯gagaaag gtag
60 94
<210> 9
<211〉 27
<212〉 DNA
<213〉 人工序列
<220〉
<221〉 misc一feature
<223> 引物
<400〉 9
ctagtctaga ggcggagacc aaaatca 27
<210〉 10
<211〉 28
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<221〉 misc一feature
<223> 引物
<210> 11
<211> 25
<212〉 DNA
<213>人工序列 4 <220〉
<221> misc一feature
<223〉 引物
<400> 11
ctagtctaga gggcgagacc aagat 25
<210〉 12
〈211> 27
<212〉 腿 <213〉人工序列
<220〉
<221〉 misc_feature
<223〉 引物
<■> 10
ctagctcgag catgatgtcc acaaagaa
<400〉 12
ctagctcgag catcacatcc acaaaga
權(quán)利要求
1.一種篩選調(diào)節(jié)蓬亂蛋白與β-連環(huán)蛋白相互作用的調(diào)節(jié)劑的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(a)將候選物質(zhì)與蓬亂蛋白和β-連環(huán)蛋白相互作用的體系接觸；和(b)檢測(cè)候選物質(zhì)對(duì)蓬亂蛋白和β-連環(huán)蛋白之間相互作用的影響；其中，若所述候選物質(zhì)可抑制或促進(jìn)蓬亂蛋白和β-連環(huán)蛋白之間的相互作用，則表明該候選物質(zhì)是調(diào)節(jié)蓬亂蛋白和β-連環(huán)蛋白相互作用的調(diào)節(jié)劑。
2. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，步驟(a)包括向蓬亂蛋白 和e-連環(huán)蛋白相互作用的體系中添加候選物質(zhì)；和步驟(b)包括檢測(cè)蓬亂蛋白和e-連環(huán)蛋白相互作用情況，并與對(duì)照組比較， 其中所述的對(duì)照組是不添加所述候選物質(zhì)的、蓬亂蛋白和P-連環(huán)蛋白相互作用的 體系；若測(cè)試組中蓬亂蛋白和e-連環(huán)蛋白相互作用在統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于對(duì)照組，就表明該候選物質(zhì)是抑制蓬亂蛋白和e-連環(huán)蛋白相互作用的調(diào)節(jié)劑；若測(cè)試組中蓬亂蛋白和e-連環(huán)蛋白相互作用在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于對(duì)照組，就表 明該候選物質(zhì)是促進(jìn)蓬亂蛋白和e-連環(huán)蛋白相互作用的調(diào)節(jié)劑。
3. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述體系選自溶液體系、細(xì)胞 體系、或組織體系。
4. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述體系中還包含Wnt蛋白。
5. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述方法還包括對(duì)于篩選出的調(diào)節(jié)劑，進(jìn)一步測(cè)試其對(duì)于Wnt信號(hào)途徑下游基因的影響；如果其可上調(diào)Wnt 信號(hào)途徑下游基因的表達(dá)，則表明該調(diào)節(jié)劑是促進(jìn)蓬亂蛋白和P-連環(huán)蛋白之間 的相互作用的促進(jìn)劑；如果其可下調(diào)Wnt信號(hào)途徑下游基因的表達(dá)，則表明該調(diào)節(jié)劑是抑制蓬亂蛋白和e-連環(huán)蛋白之間的相互作用的抑制劑。
6. —種通過(guò)權(quán)利要求1所述的方法獲得的調(diào)節(jié)蓬亂蛋白與P-連環(huán)蛋白相互 作用的調(diào)節(jié)劑。
7. 如權(quán)利要求6所述的調(diào)節(jié)劑，其特征在于，它是抑制劑，所述的抑制劑為 一種多肽，含有SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列。
8. 如權(quán)利要求7所述的多肽，其特征在于，該多肽還含有核定位信號(hào)蛋白的 氨基酸序列。
9. 如權(quán)利要求6所述的調(diào)節(jié)劑，其特征在于，所述的調(diào)節(jié)劑是一種核酸分子或其轉(zhuǎn)錄本，所述核酸分子含有SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列。
10. —種蓬亂蛋白的用途，其特征在于，用于篩選調(diào)節(jié)蓬亂蛋白與e-連環(huán)蛋白相互作用的調(diào)節(jié)劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種篩選調(diào)節(jié)蓬亂蛋白與β-連環(huán)蛋白之間相互作用的調(diào)節(jié)劑的方法。本發(fā)明還公開(kāi)了一種可抑制蓬亂蛋白與β-連環(huán)蛋白相互作用的物質(zhì)，即Dvl 1-C多肽。本發(fā)明首次揭示在Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，蓬亂蛋白可與β-連環(huán)蛋白發(fā)生相互作用，從而影響Wnt下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。由于Wnt途徑下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的異常激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因此本發(fā)明為篩選抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的藥物提供了新靶點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/00GK101308142SQ200710040600
公開(kāi)日2008年11月19日 申請(qǐng)日期2007年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月14日
發(fā)明者瑩 席, 林 李, 偉 王, 王計(jì)勇, 甘肖箐 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院