專利名稱：與Bcl－2家族抗凋亡蛋白相互作用的新肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與Bcl-XL和/或Bcl-2和/或Bcl-W相互作用的新肽，并且也涉及允許鑒定能夠調(diào)節(jié)該相互作用的化合物的篩選方法。
背景技術(shù)：
大多數(shù)生物過程涉及蛋白-蛋白相互作用。蛋白質(zhì)組學(xué)設(shè)立的目標(biāo)之一就是制得這些相互作用的圖譜。由于它們參與多數(shù)信號傳導(dǎo)機制，這些相互作用是藥物研發(fā)中優(yōu)選的靶標(biāo)。
存在著許多方法學(xué)使得蛋白的相互作用得以鑒定。最普遍的一種是由Fields等(US 5,283,173；US 5,468,614；US 5,667,973)最初描述和發(fā)展的雙雜合系統(tǒng)。
這個系統(tǒng)基本上是由兩個重組蛋白質(zhì)之間的體外試驗組成的。其中第一，通常稱為“誘餌”蛋白，是融合于能夠結(jié)合報告基因上游的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)的嵌合蛋白。常用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域為Gal4或大腸桿菌LexA的結(jié)構(gòu)域。
第二個蛋白質(zhì)還是嵌合蛋白，一般稱之為“捕獲”蛋白，含有激活結(jié)構(gòu)域(AD)，一般來自Gal4。
然而，這些傳統(tǒng)方法有其局限性。眾所周知的，例如，這些篩選方法可造成假陽性和/或假陰性，從而所得結(jié)果的生化確認(rèn)是必須的。
專利申請WO9942612中描述了一種更有效的技術(shù)使得假陽性或陰性降到最低，并使用含有“誘餌”和“捕獲”蛋白的重組單倍體酵母。與本領(lǐng)域中使用的傳統(tǒng)方法相比，這個系統(tǒng)允許以更精確、更可再現(xiàn)和更靈敏的方式使用一個“誘餌”蛋白檢測大量的“捕獲”蛋白。
細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的過程，其在多細(xì)胞生物體中起到關(guān)鍵的作用。實際上，細(xì)胞死亡有兩種形式細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡。細(xì)胞壞死發(fā)生在組織病變的情況中細(xì)胞腫脹，導(dǎo)致釋放細(xì)胞內(nèi)容物，然后細(xì)胞裂解，引起周圍組織的炎癥。
另一方面，細(xì)胞凋亡是一個程序性的和受調(diào)控的生理過程，由于每天我們的細(xì)胞有大約109個因這種機制死亡，其重要性不可低估。許多病理學(xué)與解除存在于細(xì)胞生長、存活和死亡之間的平衡的調(diào)控有關(guān)。
這里尤其要提及的是自身免疫病、某些神經(jīng)紊亂和癌癥。
保持細(xì)胞存活或編程其死亡需要至少十個家族的不同蛋白質(zhì)，其中Bcl-2家族起到主要的作用。該家族包括大約20種蛋白質(zhì)，有Bcl-2、Bcl-XL和Bcl-W，是抗凋亡蛋白，利于細(xì)胞存活，相反的Bax、Bak和Bid是促凋亡蛋白。在細(xì)胞凋亡過程中將看到Bcl-2家族成員調(diào)節(jié)它們與其配偶體之間的相互作用，由此在細(xì)胞中產(chǎn)生不可逆的變化導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
因此能鑒定能夠調(diào)節(jié)這些相互作用的化合物，以得到在涉及解除凋亡、特別是自身免疫病、某些神經(jīng)退形性變的紊亂和癌癥的調(diào)控的病理學(xué)方面有效的真正候選藥物是必需的。

發(fā)明內(nèi)容
本申請人現(xiàn)在鑒定到一種新肽，其與Bcl-2家族抗凋亡蛋白、更特別是Bcl-2、Bcl-XL和Bcl-W相互作用。
這個具有22個氨基酸的肽對應(yīng)于與Bcl-2家族抗凋亡蛋白、更特別是Bcl-2和/或Bcl-XL和/或Bcl-W的精確相互作用結(jié)構(gòu)域，并具有“BH3”基序的典型結(jié)構(gòu)特征，相互作用結(jié)構(gòu)域允許同源或異源二聚體的形成。
這個肽的小尺寸使其成為理想的候選物，以建立允許高效篩選能夠調(diào)節(jié)這些蛋白質(zhì)之間相互作用的化合物的測試。
文獻(xiàn)中可見到許多篩選蛋白-蛋白相互作用的調(diào)節(jié)劑的測試，但是它們通常在靈敏度和高通量可行性方面具有局限性。傳統(tǒng)上所采用的方法必需要求使用復(fù)雜的工具(融合蛋白質(zhì)之間、重組蛋白質(zhì)之間等的相互作用)，這不十分適合高通量篩選。它們非常頻繁地產(chǎn)生高水平的背景噪音，并且從定量的觀點看具有低可信性它們提供減少了的閱讀窗口，不允許測試化合物的最佳篩選。
然而，本申請人建立了一種基于熒光偏振的高效篩選測試(Owicki J.C.等，《生物分子篩雜志》5，2000，297-306)。這個技術(shù)使得，例如，熒光基團(tuán)標(biāo)記的配體和受體之間的相互作用得以測量。原理在于測量與游離配體相比當(dāng)配體為受體所結(jié)合時發(fā)射的熒光偏振的增加。游離配體的熒光偏振取決于其分子量，并且上述配體分子量越高，則熒光偏振將越大。因此，當(dāng)使用有固有的高水平熒光偏振的高分子量配體進(jìn)行測試時，難于可信地評價游離配體與結(jié)合配體之間熒光偏振的差別。另一方面，使用減少尺寸的配體，將可以使得差別明顯，因此使得測定的精確性得以提高。從而可以更好的評價化合物的真實活性并進(jìn)行高通量篩選。
更具體的，本發(fā)明涉及包含SEQ.ID.NO.1所述的氨基酸序列的肽，并涉及其功能性變體。。
“功能性變體”應(yīng)理解為SEQ.ID.NO.1所述肽的任何片段或點突變體，其能與Bcl-2家族抗凋亡蛋白、更特別是Bcl-2和/或Bcl-XL和/或Bcl-W相互作用。
通過雙雜合方法用Bcl-XL、Bcl-W和Bcl-2作為“誘餌”蛋白鑒定到這個肽。篩選了三個人cDNA庫(胎盤、腦、細(xì)胞系CEMC7)，并允許鑒定了與序列HC21ORF80(登錄號NM-015227)的部分序列對應(yīng)的“捕獲”片段。
然后通過雙雜合技術(shù)經(jīng)實驗確定該序列上的一個片斷是實現(xiàn)與Bcl-XL和/或Bcl-2和/或Bcl-W相互作用所必須的并且也是足夠的，其對應(yīng)于SEQ.ID.NO.1所述的22個氨基酸片段。
與Bcl-2、Bcl-XL和Bcl-W蛋白的相互作用由生化技術(shù)(共免疫沉淀、GST沉降)證實，并且有可能通過轉(zhuǎn)染和/或顯微注射進(jìn)細(xì)胞中在顯示發(fā)生凋亡的情況下證實這個肽的生物活性。
本發(fā)明還涉及依照遺傳密碼由SEQ.ID.NO.1所述的氨基酸序列推導(dǎo)的核酸序列，并且還涉及從上文描述的功能性變體推導(dǎo)出的那些核酸序列。
更具體的，發(fā)明涉及核酸序列SEQ.ID.NO.2，其編碼SEQ.ID.NO.1所述的肽。
“核酸序列”應(yīng)理解為從其自然環(huán)境中分離的核酸序列，并且特別意味著已經(jīng)被分離、擴(kuò)增和/或純化、以及視情況而定經(jīng)遺傳工程修飾的序列。
本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本發(fā)明的核酸序列的重組載體。
“載體”應(yīng)理解為允許將核酸序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞并表達(dá)多肽的任何類型的載體。
根據(jù)本發(fā)明的重組載體特征在于其包含表達(dá)照根據(jù)本發(fā)明的肽，更具體的，SEQ.ID.NO.1所述的肽所必須的DNA序列。
尤其要提及的是衍生自細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒和染色體、病毒等的載體。
本發(fā)明還涉及由重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。這些細(xì)胞優(yōu)選為細(xì)菌或真核細(xì)胞。作為舉例可提及的有大腸桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及篩選能夠調(diào)節(jié)根據(jù)發(fā)明的肽，更具體地，SEQ.ID.NO.1所述的肽，和Bcl-2家族抗凋亡蛋白，更具體地Bcl-2、Bcl-XL和Bcl-W之間的相互作用的試劑的方法。調(diào)節(jié)這些相互作用的試劑將有利地是業(yè)已被化學(xué)合成或得自化合物庫的化合物。
根據(jù)本發(fā)明所述的篩選方法包括下列步驟a)制備根據(jù)本發(fā)明用熒光標(biāo)記標(biāo)記的肽；b)與待測化合物一起孵育；c)添加包括抗凋亡蛋白的融合蛋白；d)測量熒光偏振。
本發(fā)明尤其涉及篩選能夠抑制所述肽和所述抗凋亡蛋白之間的相互作用的化合物的方法，包括下列步驟a)制備根據(jù)本發(fā)明用熒光標(biāo)記標(biāo)記的肽；b)與或不與待測化合物一起孵育；c)添加包括抗凋亡蛋白的融合蛋白；
d)測量有或無待測化合物的熒光偏振；e)選擇與無待測化合物的觀測結(jié)果相比，有待測化合物時觀察到的熒光偏振增高顯著較低的化合物。
本發(fā)明還涉及篩選能夠增強所述肽和抗調(diào)亡蛋白之間的相互作用的化合物的方法，包括下列步驟a)制備根據(jù)本發(fā)明用熒光標(biāo)記標(biāo)記的肽；b)與或不與待測化合物一起孵育；c)添加包括抗凋亡蛋白的融合蛋白；d)測量有或無待測化合物的熒光偏振；e)選擇與無待測化合物的觀測結(jié)果相比，有待測化合物時觀察到的熒光偏振顯著更高的化合物。
根據(jù)上文描述的方法的優(yōu)選實施方案，所述熒光標(biāo)記將是，例如，俄勒岡綠(oregon green)、bodipy或熒光素，更特別是熒光素。
根據(jù)發(fā)明在篩選方法中使用的肽優(yōu)選SEQ.ID.NO.1所述的肽。
根據(jù)發(fā)明的方法有利地使用Bcl-2家族抗凋亡蛋白進(jìn)行，更特別地是Bcl-2、Bcl-XL和Bcl-W。
因此，本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的肽在根據(jù)本發(fā)明的方法中篩選能夠調(diào)節(jié)凋亡的活性化合物的用途。
更具體地，本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的肽在根據(jù)本發(fā)明的方法中篩選用于治療涉及解除凋亡調(diào)節(jié)的病理的化合物的用途。
本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的肽在根據(jù)本發(fā)明的方法中篩選用于治療自身免疫病、某些神經(jīng)紊亂和癌癥的化合物的用途。


圖1.“GST沉降”與SEQ.ID.NO.1所述的肽競爭的GST-Bcl-XL+TBid。
圖2.測定SEQ.ID.NO.1所述的肽對Bcl-XL的Kd。
圖3.測定SEQ.ID.NO.1所述的肽對Bcl-W的Kd。
如下實施例闡釋而不以任何方式限制本發(fā)明實施例1SEQ.ID.NO.1所述肽的鑒定在酵母中利用接合方案(Legrain等，Nature Genetics，1997，16，277-282)通過雙雜合技術(shù)(Fields等)對三個人類cDNA庫(胎盤、腦、細(xì)胞系CEMC7)進(jìn)行了篩選。
1)“誘餌”和“捕獲”蛋白的制備a)所用“誘餌”為-融合于LexA DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Bcl-XL(1-209)C-末端截短物-融合于LexA DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Bcl-2(1-211)C-末端截短物-融合于LexA DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Bcl-XL(1-209)C末端截短物將它們在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(CG1945或L40ΔGal4)中表達(dá)，并于30℃在缺乏色氨酸的合成培養(yǎng)基(DO-Trp)中預(yù)培養(yǎng)，直至DO600nm達(dá)到包括端值在內(nèi)的0.1到0.5之間。將50ml預(yù)培養(yǎng)物稀釋液(DO600nm＝0.006)于30℃過夜孵育。
b)含有表達(dá)融合于Gal4轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的cDNA庫的質(zhì)粒的酵母集合是通過轉(zhuǎn)化繼之以在缺乏亮氨酸的培養(yǎng)基(DO-Leu)中選擇獲得的。將酵母等分成小份并貯存于-80℃。
2)接合使用比率為2的“誘餌”/“捕獲”比進(jìn)行接合。
將得自步驟1)a)相當(dāng)于50單位DO600nm的量的“誘餌酵母”細(xì)胞與得自步驟1)b)的“捕獲酵母”混合。離心后，將沉淀物重懸于YPGlu培養(yǎng)基中，涂布在YPGlu培養(yǎng)板上并在30℃孵育4小時30分鐘。在DO-Leu-Trp-His培養(yǎng)基中進(jìn)行含有彼此能夠相互作用的“誘餌”和“捕獲”的接合酵母的選擇培養(yǎng)基中缺少亮氨酸和色氨酸使得有可能維持選擇壓力，只允許含有兩種類型質(zhì)粒(“誘餌”/“捕獲”)的這些酵母生長；培養(yǎng)基中缺少組氨酸使得有可能選擇含有彼此能夠相互作用的“誘餌”質(zhì)粒和“捕獲”質(zhì)粒的接合酵母這種相互作用使得有可能激活HIS3基因，其編碼參與組氨酸生物合成的酶。
3)陽性克隆的鑒定通過PCR使用“捕獲”載體的特異引物自2)選擇的酵母克隆的粗裂解液擴(kuò)增該克隆的“捕獲”片段。
ABS1 5’-GCTTTGGAATCACTACAGG-3’(SEQ.ID.NO.3)，ABS2 5’-CACGATGCACGTTGAAGTG-3’(SEQ.ID.NO.4)。
接著對PCR產(chǎn)物測序，并與數(shù)據(jù)庫對照以鑒定得到的序列。
在得到的陽性克隆中，有可能鑒定大約300個氨基酸的片段是序列HC21ORF80(登錄號NM-015227)的部分序列。
4)SEO.ID.NO.1所述肽的鑒定對HC21ORF80序列更小的片段依照上述步驟1)、2)和3)進(jìn)行雙雜合實驗，允許鑒定到實現(xiàn)與Bcl-XL和/或Bcl-W和/或Bcl-2相互作用所必須且足夠的22個氨基酸的短肽Asp-Thr-Arg--Arg-Ser-Met-Val-Phe-Ala-Arg-His-Leu-Arg-Glu-Val-Gly-Asp-Glu-Phe-Arg-Ser-Arg(SEQ.ID.NO.1)。
實施例2實施例1中所述的肽與Bcl-W和/或Bcl-XL和/或Bcl-2之間相互作用的鑒定1)GST“沉降”通過測定有“BH3”基序的Bid蛋白與融合蛋白GST-Bcl-W、GST-Bcl-XL或GST-Bcl-2之間相互作用的變化來驗證得自實施例1中所述的肽與Bcl-W和/或Bcl-XL和/或Bcl-2之間的相互作用。
a)合成放射性標(biāo)記的Bid使用TNT quick master試劑盒(Promega)得到標(biāo)記蛋白。將40μl TNT混合物與2μl(相當(dāng)于20μCi)35S-甲硫氨酸(Amersham)、1μg編碼Bid的質(zhì)粒DNA和使體積達(dá)到50μl的足量水一起在30℃孵育90分鐘。
基于蛋白中的甲硫氨酸數(shù)目計算產(chǎn)生的放射性蛋白的fmole/μl數(shù)。
b)GST“沉降”
將4fmole的放射性Bid蛋白與3μg融合蛋白谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶-Bcl-XL(GST-Bcl-XL)或谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶-Bcl-2(GST-Bcl-2)或谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶-Bcl-W(GST-Bcl-W)或僅僅GST一起在300μl結(jié)合緩沖液(142mM KCl、5mM MgCl2、10mM Hepes緩沖液、0.5mM DTT、1mMEDTA、蛋白酶抑制劑、pH7.4)和0.4％Triton X100中4℃孵育3小時。“谷胱甘肽瓊脂糖4速流”珠(Amersham)用所述結(jié)合緩沖液洗滌3遍，并用所述緩沖液重懸從而得到50％的溶液。向每個樣品加入20μl并在4℃旋轉(zhuǎn)孵育1小時。接著用結(jié)合緩沖液洗滌所述珠3次，然后加入25μl 2xSDS緩沖液Laemmli(Sigma)。然后將樣品保持在95℃5分鐘并接著施加到12％Tris-甘氨酸凝膠(Invitrogen)上。電泳后，隨后將凝膠在干燥液(Invitrogen)中孵育30分鐘，然后在70℃干燥150分鐘。經(jīng)由KodakBioMax MS-1膜(Sigma)曝光顯示熒光蛋白。為進(jìn)行待測肽的競爭測試，其向初始溶液添加的濃度范圍從5到20μM。
c)結(jié)果當(dāng)?shù)米詫嵤├?的肽加入到初始溶液中時，Bid的放射自顯影信號消失。這個結(jié)果顯示得自實施例1的肽抑制Bcl-W和Bid之間、Bcl-XL和Bid之間以及Bcl-2和Bid之間的相互作用。
作為舉例，得自Bcl-XL和Bid之間的結(jié)果示于圖1。
2)熒光偏振實施例1得到的肽和抗凋亡蛋白質(zhì)之間相互作用的Kd的測定在包括Na2HPO420mM pH 4，EDTA 1mM，NaCl 50mM和pluronicacid F-680.05％的緩沖液中，將15nM得自實施例1用熒光素標(biāo)記N-末端的肽溶液與濃度范圍從1nM到5μM變動含有融合蛋白GST-Bcl-XL或GST-Bcl-W的溶液混合。然后用En顯示儀(Packard Perkin-Elmer)測量熒光偏振。
得到的結(jié)果示于圖2和3。
結(jié)果在得自實施例1的肽與含有Bcl-XL和Bcl-W的融合蛋白孵育時，觀察到熒光偏振顯著提高，證明其已與這些蛋白質(zhì)結(jié)合。
Bcl-XL得到的Kd是2.15×10-7M(圖2)，而Bcl-W得到的Kd是4.11×10-7M(圖3)。
實施例3能夠抑制Bcl-W和/或Bcl-XL和/或Bcl-2與實施例1中所獲得的肽之間的相互作用的化合物的篩選試驗將待測化合物以10μg/ml的終濃度分配到384孔板(Corning平底)中。在一個孔中裝滿不含待測化合物的等量緩沖液/溶劑以形成對照。向各孔添加由熒光素標(biāo)記的實施例1中所獲得的肽，從而得到15nM的終濃度。然后添加融合蛋白GST-Bcl-XL、GST-Bcl-W或GST-Bcl-2，從而在含Na2HPO420mM pH 4，EDTA 1mM，NaCl 50mM和pluronic acid F-680.05％的緩沖液中得到500nM(Bcl-XL、Bcl-2)和1μM(Bcl-W)的終濃度。然后通過En顯示儀(Packard Perkin-Elmer)測量熒光偏振。與無測試化合物(對照孔)所獲得的相比，在有測試化合物所進(jìn)行的試驗中記錄到的熒光偏振顯著下降，則允許得出所述化合物具有抑制活性的結(jié)論。相反，測試化合物試驗中的熒光偏振與對照相比顯著升高，則允許得出所述化合物具有激活活性的結(jié)論。
序列表<110>瑟維爾實驗室哈伯里健尼克斯公司<120>與Bcl-2家族抗凋亡蛋白相互作用的新肽<130>肽-1<150>FR 03.09697<151>2003-08-06<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>22<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>1Asp Thr Arg Arg Ser Met Val Phe Ala Arg His Leu Arg Glu Val Gly1 5 10 15Asp Glu Phe Arg Ser Arg20<210>2<211>66<212>DNA<213>智人<400>2gatacccgtc gcagcatggt gtttgccagg cacctgcggg aggtgggaga cgagttcagg 60agcaga66
<210>3<211>19<212>DNA<213>人工<400>3gctttggaat cactacagg 19<210>4<211>19<212>DNA<213>人工<400>4cacgatgcac gttgaagtg 19
權(quán)利要求
1.與Bcl-2家族抗凋亡蛋白相互作用的肽，特征在于其為序列SEQ.ID.NO.1Asp-Thr-Arg-Arg-Ser-Met-Val-Phe-Ala-Arg-His-Leu-Arg-Glu-Val-Gly-Asp-Glu-Phe-Arg-Ser-Arg。
2.如權(quán)利要求1所述的肽，其與抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL和/或Bcl-W相互作用。
3.如權(quán)利要求1或2所述的肽，特征在于其對應(yīng)于SEQ.ID.NO.1所述肽的片段或點突變體。
4.核酸序列，其編碼如權(quán)利要求1所述的肽，特征在于其為序列SEQ.ID.NO.25’-GATACCCGTCGCAGCATGGTGTTTGCCAGGCACCTGCGGGAGGTGGGAGACGAGTTCAGGAGCAGA-3’。
5.核酸序列，其是由如權(quán)利要求1或2所述的氨基酸序列根據(jù)遺傳密碼推斷出來的。
6.核酸序列，其是由如權(quán)利要求3所述的氨基酸序列根據(jù)遺傳密碼推斷出來的。
7.重組載體，特征在于其包含如權(quán)利要求4至6中任一項所述的核酸序列。
8.如權(quán)利要求7所述的重組載體，特征在于所述載體為質(zhì)粒，其中所述質(zhì)粒包含為在宿主細(xì)胞中表達(dá)肽所必需的序列。
9.宿主細(xì)胞，特征在于其已被如權(quán)利要求7或8中任一項所述的重組載體轉(zhuǎn)化。
10.鑒定能夠調(diào)節(jié)如權(quán)利要求1、2或3中任一項所述的肽與Bcl-2家族抗凋亡蛋白之間的相互作用的化合物的方法，特征在于其包括如下步驟a)制備用熒光標(biāo)記標(biāo)記了的如權(quán)利要求1、2或3中任一項所述的肽；b)與待測化合物一起孵育；c)添加包含Bcl-2家族抗凋亡蛋白的融合蛋白；d)測量熒光偏振。
11.鑒定能夠抑制如權(quán)利要求1、2或3中任一項所述的肽與Bcl-2家族抗凋亡蛋白之間的相互作用的化合物的方法，特征在于其包括如下步驟a)制備用熒光標(biāo)記標(biāo)記了的如權(quán)利要求1或2中任一項所述的肽；b)與或不與待測化合物一起孵育；c)添加包含Bcl-2家族抗凋亡蛋白的融合蛋白；d)測量熒光偏振；e)選擇與無待測化合物所觀察到的相比，有待測化合物所觀察到的熒光偏振的增加顯著更低的化合物。
12.鑒定能夠增強如權(quán)利要求1、2或3中任一項所述的肽與Bcl-2家族抗凋亡蛋白之間的相互作用的化合物的方法，特征在于其包括如下步驟a)制備用熒光標(biāo)記標(biāo)記了的如權(quán)利要求1或2中任一項所述的肽；b)與或不與待測化合物一起孵育；c)添加包含Bcl-2家族抗凋亡蛋白的融合蛋白；d)測量熒光偏振；e)選擇與無待測化合物所觀察到的相比，有待測化合物所觀察到的熒光偏振的增加顯著更高的化合物。
13.如權(quán)利要求10至12中任一項所述的方法，其中抗凋亡蛋白為Bcl-2。
14.如權(quán)利要求10至12中任一項所述的方法，其中抗凋亡蛋白為Bcl-XL。
15.如權(quán)利要求10至12中任一項所述的方法，其中抗凋亡蛋白為Bcl-W。
16.如權(quán)利要求10至12中任一項所述的方法，其中所用的肽特征在于其為序列SEQ.ID.NO.1。
17.如權(quán)利要求10至12中任一項所述的方法，其中所用的熒光標(biāo)記為熒光素。
18.如權(quán)利要求1、2或3中任一項所述的肽在如權(quán)利要求10至17中任一項所述的方法中在鑒定凋亡調(diào)節(jié)化合物中的用途。
19.如權(quán)利要求1、2或3中任一項所述的肽在如權(quán)利要求10至17中任一項所述的方法中在鑒定可用于治療涉及解除凋亡調(diào)控的病理的化合物中的用途。
20.如權(quán)利要求1、2或3中任一項所述的肽在如權(quán)利要求10至17中任一項所述的方法中在鑒定可用于治療自身免疫病、某些神經(jīng)紊亂和癌癥的化合物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及與抗凋亡蛋白Bcl－2、Bcl－W和/或Bcl－XL相互作用的新肽的鑒定，并且也涉及允許鑒定那些相互作用的調(diào)節(jié)劑的篩選方法。
文檔編號G01N33/50GK1829737SQ200480021799
公開日2006年9月6日 申請日期2004年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月6日
發(fā)明者O·熱內(nèi)斯特, J·希克曼, R·貝內(nèi)特, J-C·雷恩 申請人:瑟維爾實驗室, 哈伯里健尼克斯公司