一種基于褪黑素受體2分子探針的藥物活性成分篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是一種基于褪黑素受體2分子探針的藥物活性成分篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002]常規(guī)的細胞水平、動物水平的藥物篩選方法不僅費時、費力，而且容易受到多重因素的干擾，假陽性、假陰性率較高，也很難確定藥物作用的靶點，并且需要大量的被篩選化合物。近十年來，隨著生物檢測技術(shù)和計算機技術(shù)的快速發(fā)展，分子水平的藥物篩選方法不斷涌現(xiàn)，如:表面等離子體共振法、核磁共振法、下游信號分子檢測法、熒光偏振法、虛擬篩選法等等，每種方法有自己的優(yōu)缺點，都屬于間接的篩選方法。至今還沒有以受體空間構(gòu)象變化為指針，可以直接、實時監(jiān)測受體對藥物反應(yīng)的高靈敏度的篩選法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種基于褪黑素受體2分子探針的藥物活性成分篩選方法，根據(jù)受體空間構(gòu)象變化為指針，可以直接、實時監(jiān)測受體對藥物反應(yīng)的高靈敏度的篩選法。
[0004]為實現(xiàn)上述技術(shù)目的，達到上述技術(shù)效果，本發(fā)明公開了一種基于褪黑素受體2分子探針的藥物活性成分篩選方法，篩選方法包括了以下步驟:
[0005]步驟I:構(gòu)建的褪黑素受體2分子探針:
[0006]A.用PCR的方法將VSV-G tag及限制性內(nèi)切酶位點分別引入人褪黑素的cDNA的5 ’端，并用Over lapping PCR法將eCFP的cDNA連接到受體cDNA的3 ’端，將“受體-eCFP”連接到pcDNA5/FRT/T0 載體，從而得到 pcDNA5/FRT/T0_VSV-受體-eCFP 質(zhì)粒；
[0007]B.用突變法將eYFP熒光基團的cDNA接入質(zhì)粒中受體第三內(nèi)環(huán)中，從而得原始的分子探針質(zhì)粒；
[0008]C.用探針質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞48小時，以表達受體分子探針，并用市售的受體激動劑激活探針，用Olympus高速熒光顯微鏡監(jiān)測探針的靈敏度；
[0009]D.根據(jù)探針靈敏度的監(jiān)測結(jié)果，對探針進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化；
[0010]步驟2:建立誘導(dǎo)表達G蛋白偶聯(lián)受體分子探針的Flp-1n T-Rex HEK293細胞系:
[0011]A.將優(yōu)化后的分子探針質(zhì)粒和pOG44載體共轉(zhuǎn)染Flp-1n T-Rex HEK293細胞，并用200ug/ml Hygromycin篩選陽性細胞克??；
[0012]B.用lug/ml Doxycycline誘導(dǎo)細胞表達相應(yīng)的G蛋白偶聯(lián)受體分子探針，用VSV抗體檢測探針蛋白的表達，用熒光顯微鏡監(jiān)測分子探針的細胞定位；
[0013]C.用受體激動劑處理已經(jīng)表達的受體分子探針Flp-1nT-Rex HEK293細胞，得到不同激動劑劑量的受體激活的FRET曲線，并在停止給藥后繼續(xù)用生理鹽水洗脫激動劑。
[0014]其中，步驟I中對探針進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化具體如下:
[0015]褪黑素受體共有363個氨基酸殘基，將CFP熒光基團接于五羥色胺受體C端第363氨基酸之后，調(diào)整eYFP基團在受體第三內(nèi)環(huán)的位置:將eYFP基團置于第238-239位氨基酸之間。
[0016]本發(fā)明具有以下有益效果:
[0017]1.本發(fā)明采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方法建立了褪黑素受體2分子探針，該分子探針具有高靈敏度，低噪音，高通量的特點，不僅能篩選受體激動劑也能篩選拮抗劑/反向激動劑，并且篩選過程不受下游信號的干擾。
[0018]2.經(jīng)過合理設(shè)計的分子探針能夠?qū)χ兴幓旌衔镞M行篩選，能一步到位的在受體水平上篩選到分子作用靶點明確的先導(dǎo)化合物。
【附圖說明】
[0019]圖1為本發(fā)明分子探針的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0020]圖2為本發(fā)明實施例2的結(jié)果示意圖。
【具體實施方式】
[0021]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。
[0022]實施例1
[0023]如圖1所示，本發(fā)明公開了一種基于褪黑素受體2分子探針的藥物活性成分篩選方法，篩選方法包括了以下步驟:
[0024]步驟I:構(gòu)建的褪黑素受體2分子探針:
[0025]A.用PCR的方法將VSV-G tag及限制性內(nèi)切酶位點分別引入人褪黑素的cDNA的5 ’端，并用Over lapping PCR法將eCFP的cDNA連接到受體cDNA的3 ’端，將“受體-eCFP”連接到pcDNA5/FRT/T0 載體，從而得到 pcDNA5/FRT/T0_VSV-受體-eCFP 質(zhì)粒；
[0026]B.用突變法將eYFP熒光基團的cDNA接入質(zhì)粒中受體第三內(nèi)環(huán)中，從而得原始的分子探針質(zhì)粒；
[0027]C.用探針質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞48小時，以表達受體分子探針，并用市售的受體激動劑激活探針，用Olympus高速熒光顯微鏡監(jiān)測探針的靈敏度；
[0028]D.根據(jù)探針靈敏度的監(jiān)測結(jié)果，對探針進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，褪黑素受體共有363個氨基酸殘基，將CFP熒光基團接于五羥色胺受體C端第363氨基酸之后，調(diào)整eYFP基團在受體第三內(nèi)環(huán)的位置:將eYFP基團置于第238-239位氨基酸之間。
[0029]步驟2:建立誘導(dǎo)表達G蛋白偶聯(lián)受體分子探針的Flp-1n T-Rex HEK293細胞系:
[0030]A.將優(yōu)化后的分子探針質(zhì)粒和pOG44載體共轉(zhuǎn)染Flp-1n T-Rex HEK293細胞，并用200ug/ml Hygromycin篩選陽性細胞克?。?br>[0031]B.用lug/ml Doxycycline誘導(dǎo)細胞表達相應(yīng)的G蛋白偶聯(lián)受體分子探針，用VSV抗體檢測探針蛋白的表達，用熒光顯微鏡監(jiān)測分子探針的細胞定位；
[0032]C.用受體激動劑處理已經(jīng)表達的受體分子探針Flp-1nT-Rex HEK293細胞，得到不同激動劑劑量的受體激活的FRET曲線，并在停止給藥后繼續(xù)用生理鹽水洗脫激動劑。
[0033]實施例2
[0034]實驗?zāi)康募胺椒?為了驗證本發(fā)明制備分子探針的可行性和有效性，本實施例分別以生理鹽水、陽性對照藥物Rame Iteon和人參粗提物分別研究三者對褪黑素受體2分子探針熒光共振能量轉(zhuǎn)移變化，具體的實驗方法如實施例1所述，此處不再贅述。
[0035]實驗結(jié)果:如圖2所示，將表達褪黑素受體2分子探針的細胞置于高速熒光顯微鏡下，分別用生理鹽水、陽性對照藥物Rame Iteon和人參粗提物處理細胞，監(jiān)測褪黑素受體2分子探針的熒光共振能量轉(zhuǎn)移變化，實驗證明褪黑素受體2分子探針能對生理鹽水并無明顯反應(yīng)、對陽性對照藥物Rame Iteon發(fā)生高靈敏度的反應(yīng)，對人參粗提物也有與陽性對照藥物Rame Iteon相似的反應(yīng)，可以初步證明人參粗提物含有作用于褪黑素受體2分子探針的活性成分。當(dāng)陽性藥物Rame Iteon作用于探針時(第15s開始)，F(xiàn)RET信號值降低(第15s至30s)，當(dāng)撤去藥物(31s后)FRET信號值恢復(fù)，說明激動劑Rame Iteon與褪黑素受體2分子探針的結(jié)合使探針的兩個熒光基團空間距離增大，降低了能量轉(zhuǎn)移。當(dāng)人參粗提物作用于探針時(第15s開始)，F(xiàn)RET信號值升高(第15s至30s)，當(dāng)撤去藥物(31s后)FRET信號值得到一定恢復(fù)，說明人參粗提物中的成分與褪黑素受體2分子探針的結(jié)合使探針的兩個熒光基團空間距尚減小，提尚了能量轉(zhuǎn)移。
[0036]以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實施方式】，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種基于褪黑素受體2分子探針的藥物活性成分篩選方法，其特征在于，所述的篩選方法包括了以下步驟: 步驟I:構(gòu)建的褪黑素受體2分子探針: A.用PCR的方法將VSV-Gtag及限制性內(nèi)切酶位點分別弓丨入人褪黑素的cDNA的5 ’端，并用Overlapping PCR法將eCFP的cDNA連接到受體cDNA的3 ’端，將“受體-eCFP”連接到pcDNA5/FRT/T0 載體，從而得到 pcDNA5/FRT/T0_VSV-受體-eCFP 質(zhì)粒； B.用突變法將eYFP熒光基團的cDNA接入質(zhì)粒中受體第三內(nèi)環(huán)中，從而得原始的分子探針質(zhì)粒； C.用探針質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞48小時，以表達受體分子探針，并用市售的受體激動劑激活探針，用Olympus高速熒光顯微鏡監(jiān)測探針的靈敏度； D.根據(jù)探針靈敏度的監(jiān)測結(jié)果，對探針進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化； 步驟2:建立誘導(dǎo)表達G蛋白偶聯(lián)受體分子探針的Flp-1nT-Rex HEK293細胞系: A.將優(yōu)化后的分子探針質(zhì)粒和pOG44載體共轉(zhuǎn)染Flp-1nT-RexHEK293細胞，并用200ug/mlHygromycin篩選陽性細胞克??； B.用lug/mlDoxycycline誘導(dǎo)細胞表達相應(yīng)的G蛋白偶聯(lián)受體分子探針，用VSV抗體檢測探針蛋白的表達，用熒光顯微鏡監(jiān)測分子探針的細胞定位； C.用受體激動劑處理已經(jīng)表達的受體分子探針Flp-1nT-RexHEK293細胞，得到不同激動劑劑量的受體激活的FRET曲線，并在停止給藥后繼續(xù)用生理鹽水洗脫激動劑。2.如權(quán)利要求1所述的一種基于褪黑素受體2分子探針的藥物活性成分篩選方法，其特征在于:所述的步驟I中對探針進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化具體如下: 褪黑素受體共有363個氨基酸殘基，將CFP熒光基團接于五羥色胺受體C端第363氨基酸之后，調(diào)整eYFP基團在受體第三內(nèi)環(huán)的位置:將eYFP基團置于第238-239位氨基酸之間。
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，公開了一種基于褪黑素受體2分子探針的藥物活性成分篩選方法，包括了構(gòu)建的褪黑素受體2分子探針和建立誘導(dǎo)表達G蛋白偶聯(lián)受體分子探針的Flp-In？T-Rex？HEK293細胞系，采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方法建立了褪黑素受體2分子探針，該分子探針具有高靈敏度，低噪音，高通量的特點，不僅能篩選受體激動劑也能篩選拮抗劑/反向激動劑，并且篩選過程不收下游信號的干擾；經(jīng)過合理設(shè)計的分子探針能夠?qū)χ兴幓旌衔镞M行篩選，能一步到位的在受體水平上篩選到分子作用靶點明確的先導(dǎo)化合物。
【IPC分類】C12N15/62, C12Q1/02, C12N5/10, C12N15/85
【公開號】CN105648025
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】徐天瑞, 楊洋, 劉瑩, 王珍
【申請人】昆明理工大學(xué)
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月2日