本發(fā)明涉及干細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)液及其應(yīng)用和誘導(dǎo)骨骼肌干細(xì)胞向骨細(xì)胞分化的方法。

背景技術(shù)：

骨骼移植(植骨)是治療骨缺損、骨折不連接和進(jìn)行脊柱融合術(shù)的必需手段。傳統(tǒng)植骨材料為自體骨骼、異體骨骼和人工骨材料，這些中除自體松質(zhì)骨有少許成骨細(xì)胞外，均只能提供充填和支架作用；需肌體將其逐步吸收、成骨替代，過程緩慢，再出現(xiàn)骨不連、骨缺損或脊椎間假關(guān)節(jié)發(fā)生率高，影響了植骨效果。近年來組織工程技術(shù)的迅猛發(fā)展，為解決傳統(tǒng)植骨術(shù)后骨形成緩慢和新骨形成不良等技術(shù)難點(diǎn)提供了一種有效解決途徑。骨組織工程技術(shù)主要包括成骨支架、成骨細(xì)胞和調(diào)控成骨分化的細(xì)胞因子三個方面。目前研究表明，各類已發(fā)現(xiàn)的間充質(zhì)干細(xì)胞等干細(xì)胞的研究和應(yīng)用從很大程度上解決了骨組織工程人工骨的種子細(xì)胞來源問題。進(jìn)而，如何促進(jìn)細(xì)胞的增殖和成骨分化成為組織工程技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和研究熱點(diǎn)。

骨骼肌源性干細(xì)胞(muscle-derived stem cells)是成年動物或人肌肉組織中特有的干細(xì)做為中胚層起源的一種成體間充質(zhì)干細(xì)胞，具有自我更新能力和多項(xiàng)分化的潛能，可在體外分化為血細(xì)胞、骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等系的細(xì)胞。骨骼肌干細(xì)胞這種功能特性極大地吸引了來自基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的研究者，給基礎(chǔ)科學(xué)的研究者們提供了一種研究發(fā)展生物學(xué)的模式，骨骼肌干細(xì)胞所具有的修復(fù)、替代和再生能力也為臨床醫(yī)學(xué)提供了一個發(fā)展新療法的機(jī)會。

目前，對于MDSCs成骨分化誘導(dǎo)的研究主要集中于不同細(xì)胞因子對其生物學(xué)行為產(chǎn)生的不同影響，其誘導(dǎo)效果并不理想。因此，進(jìn)一步開發(fā)MDSCs成骨分化的方法，能夠進(jìn)一步促進(jìn)骨骼移植技術(shù)的發(fā)展。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種細(xì)胞培養(yǎng)液及其應(yīng)用 和誘導(dǎo)骨骼肌干細(xì)胞向骨細(xì)胞分化的方法，本發(fā)明提供的細(xì)胞培養(yǎng)液能夠促進(jìn)骨骼肌干細(xì)胞向骨細(xì)胞分化，其分化周期短，分化效率高。

本發(fā)明提供的細(xì)胞培養(yǎng)液，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)液、維生素C、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、IGF-1、BMP-2、PRP和FBS。

胎牛血清(fetal calf serum，簡稱FBS)是血清中的一種，能夠提供維持細(xì)胞指數(shù)生長的激素，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中沒有或量很少的營養(yǎng)物，以及主要的低分子營養(yǎng)物。

富血小板血漿(PRP)是血液經(jīng)過離心得到的血小板濃縮物，富含各種生長因子，經(jīng)激活后釋放大量的生長因子，如血小板源性生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、胰島素樣生長因子等。這些生長因子已被證實(shí)，在單獨(dú)應(yīng)用或聯(lián)合應(yīng)用時能刺激細(xì)胞增殖、分化，對軟組織和骨組織的愈合有促進(jìn)作用。

骨成形蛋白(BMP)能誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)的間充質(zhì)細(xì)胞不可逆地分化為軟骨和骨細(xì)胞。將BMP植入軟組織內(nèi)，可異位誘導(dǎo)新骨的形成。

類胰島素一號增長因子(IGF-1)也被稱作“促生長因子”，對維持與細(xì)胞分化有關(guān)蛋白質(zhì)水平十分重要，與一些生長因子合用能促進(jìn)細(xì)胞分化成熟。

維生素C、地塞米松、β-甘油磷酸鈉是目前干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)或稱軟骨誘導(dǎo)液中常見組分，其中，地塞米松通過促進(jìn)Cbfal mRNA和Osterix mRNA的表達(dá)而促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。β-甘油磷酸鈉可以為成骨細(xì)胞提供磷酸離子，同時促進(jìn)生理性鈣鹽的沉積和鈣化，是骨髓基質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)生礦化結(jié)節(jié)的必要條件。維生素C(抗壞血酸)在體外能增加鈣鹽的沉積，促進(jìn)礦化結(jié)節(jié)的形成，并通過間充質(zhì)細(xì)胞間接調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化。

本發(fā)明以維生素C、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、IGF-1、BMP-2、PRP、FBS添加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，作為骨骼肌干細(xì)胞成骨分化的誘導(dǎo)培養(yǎng)液。提高了骨骼肌干細(xì)胞向骨細(xì)胞分化的數(shù)量并縮短分化的時間。實(shí)驗(yàn)表明，以本發(fā)明提供的培養(yǎng)液誘導(dǎo)骨骼肌干細(xì)胞，能夠在7d內(nèi)即出現(xiàn)骨細(xì)胞的特性，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變且茜素紅染色細(xì)胞數(shù)目增多。誘導(dǎo)21天后，細(xì)胞中OPN和Col-I基因的表達(dá)量增加，且顯著(p<0.05)高于對比例中的OPN和Col-I基因的表達(dá)量。

在本發(fā)明的實(shí)施例中，PRP的體積分?jǐn)?shù)為8％～12％；FBS的體積分?jǐn)?shù)為8％～12％。

在一些實(shí)施例中，PRP的體積分?jǐn)?shù)為10％；FBS的體積分?jǐn)?shù)為10％。

在一些實(shí)施例中，PRP的體積分?jǐn)?shù)為12％；FBS的體積分?jǐn)?shù)為8％。

在一些實(shí)施例中，PRP的體積分?jǐn)?shù)為8％；FBS的體積分?jǐn)?shù)為12％。

在本發(fā)明的實(shí)施例中，IGF-1的濃度為20μg/L～30μg/L；BMP-2的濃度為80μg/L～120μg/L。

在一些實(shí)施例中，IGF-1的濃度為20μg/L；BMP-2的濃度為120μg/L。

在一些實(shí)施例中，IGF-1的濃度為30μg/L；BMP-2的濃度為80μg/L。

在一些實(shí)施例中，IGF-1的濃度為25μg/L；BMP-2的濃度為100μg/L。

在本發(fā)明的實(shí)施例中，維生素C的濃度為40μg/L～60μg/L；地塞米松的濃度為1×10^-7mol/L～1×10^-9mol/L；β-甘油磷酸鈉的濃度為8mol/L～12mol/L。

在一些實(shí)施例中，維生素C的濃度為40μg/L；地塞米松的濃度為1×10^-7mol/L；β-甘油磷酸鈉的濃度為12mol/L。

在一些實(shí)施例中，維生素C的濃度為60μg/L；地塞米松的濃度為1×10^-9mol/L；β-甘油磷酸鈉的濃度為8mol/L；

在一些實(shí)施例中，維生素C的濃度為50μg/L；地塞米松的濃度為1×10^-8mol/L；β-甘油磷酸鈉的濃度為10mol/L；

在一些實(shí)施例中，維生素C的濃度為50μg/L；

地塞米松的濃度為1×10^-8mol/L；

β-甘油磷酸鈉的濃度為10mol/L；

IGF-1的濃度為25μg/L；

BMP-2的濃度為100μg/L。

在一些實(shí)施例中，維生素C的濃度為40μg/L；

地塞米松的濃度為1×10^-7mol/L；

β-甘油磷酸鈉的濃度為12mol/L；

IGF-1的濃度為20μg/L；

BMP-2的濃度為120μg/L。

在一些實(shí)施例中，維生素C的濃度為50μg/L；

地塞米松的濃度為1×10^-8mol/L；

β-甘油磷酸鈉的濃度為10mol/L；

IGF-1的濃度為25μg/L；

BMP-2的濃度為100μg/L；

PRP的體積分?jǐn)?shù)為10％；

FBS的體積分?jǐn)?shù)為10％。

在本發(fā)明的實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)液為DMEM/F12無血清培養(yǎng)液。

本發(fā)明所用的基礎(chǔ)培養(yǎng)液可為自制也可為購買獲得，本發(fā)明對此不做限定，其實(shí)施皆在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明采用的人干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基為DMEM/F12無血清培養(yǎng)液。本發(fā)明提供的培養(yǎng)液中不含有抗生素，而是通過更加適宜的培養(yǎng)條件，促進(jìn)骨骼肌干細(xì)胞向骨細(xì)胞的分化，增強(qiáng)目標(biāo)細(xì)胞的生長勢，降低感染風(fēng)險(xiǎn)。

本發(fā)明提供的培養(yǎng)液能夠誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞相骨細(xì)胞的分化，分化效率高，速度快。實(shí)驗(yàn)表明，誘導(dǎo)培養(yǎng)14d后，堿性磷酸酶活性增高，成骨細(xì)胞標(biāo)志性基因OPN、Col-I表達(dá)量增高，茜素紅染色細(xì)胞數(shù)量增多。

本發(fā)明提供的細(xì)胞培養(yǎng)液在誘導(dǎo)骨骼肌干細(xì)胞向骨細(xì)胞分化中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種誘導(dǎo)骨骼肌干細(xì)胞向骨細(xì)胞分化的方法，骨骼肌干細(xì)胞以基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)至70％～80％融合后以本發(fā)明提供的細(xì)胞培養(yǎng)液誘導(dǎo)。

在本發(fā)明的實(shí)施例中，誘導(dǎo)的時間為7d～21d。

在本發(fā)明的實(shí)施例中，骨骼肌干細(xì)胞為3～5代的骨骼肌干細(xì)胞。

一些實(shí)施例中，骨骼肌干細(xì)胞為第3代的骨骼肌干細(xì)胞。

本發(fā)明中，骨骼肌干細(xì)胞的分離方法包括：

步驟1：將骨骼肌破碎后，經(jīng)Dispase II和I型膠原酶消化后，以胰蛋白酶消化，獲得細(xì)胞以培養(yǎng)基重懸；

步驟2：差速貼壁法對步驟1中所得細(xì)胞進(jìn)行分離，獲得骨骼肌干細(xì)胞。

在本發(fā)明中，骨骼肌為顳肌。

差速貼壁具體為：將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶中，放置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％的CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2h后的貼壁細(xì)胞記為PP1，其中未貼壁細(xì)胞吸出后移入新的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，并記為PP2。24h后將PP2中未貼壁的細(xì)胞吸出后移入新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，標(biāo)記為PP3。以后每24h進(jìn)行差速貼壁培養(yǎng)，直到獲得PP6，記為骨骼肌干細(xì)胞。

骨骼肌干細(xì)胞培養(yǎng)3天后換液，以后每2-3天換液，待細(xì)胞生長融合至70-80％后傳代培養(yǎng)。

骨骼肌干細(xì)胞(MDSCs)原代培養(yǎng)8-10天，待細(xì)胞長滿80-90％，用吸管吸棄舊培養(yǎng)液，加入0.25％胰蛋白酶-EDTA，消化1-3分鐘，鏡下觀察細(xì)胞收縮變圓時，加入含20％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，收集細(xì)胞，1000r/min離心5min，棄上清。加入適量含20％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，進(jìn)行細(xì)胞記數(shù)，按8×10⁴cell/mL密度接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，5％CO₂培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，每隔2-3天換液一次。

在本發(fā)明中，誘導(dǎo)骨骼肌干細(xì)胞向骨細(xì)胞分化前，骨骼肌細(xì)胞以基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)的接種密度為1×10⁴cell/mL。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)液。

本發(fā)明提供的培養(yǎng)液中包括基礎(chǔ)培養(yǎng)液、維生素C、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、IGF-1、BMP-2、PRP和FBS。本發(fā)明提供的培養(yǎng)液能夠作為骨骼肌干細(xì)胞成骨分化的誘導(dǎo)培養(yǎng)液。提高了骨骼肌干細(xì)胞向骨細(xì)胞分化的數(shù)量并縮短分化的時間。實(shí)驗(yàn)表明，以本發(fā)明提供的培養(yǎng)液誘導(dǎo)骨骼肌干細(xì)胞，能夠在7d內(nèi)即出現(xiàn)骨細(xì)胞的特性，14d細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變且茜素紅染色細(xì)胞數(shù)目增多。誘導(dǎo)21天后，細(xì)胞中OPN和Col-I基因的表達(dá)量增加，且顯著(p<0.05)高于對比例中的OPN和Col-I基因的表達(dá)量。

附圖說明

圖1示MDSCs P2代形態(tài)；其中，圖1-a的放大倍數(shù)為40×；圖1-b的放大倍數(shù)為100×；

圖2示各組細(xì)胞染色效果；其中，圖2-a-1示對照組1細(xì)胞誘導(dǎo)14天放大40倍效果；圖2-a-2示對照組1細(xì)胞誘導(dǎo)14天放大100倍效果；圖2-a-3示對照組1細(xì)胞誘導(dǎo)21天放大40倍效果；圖2-a-4示對照組1細(xì)胞誘導(dǎo)21天放大100倍效果；圖2-b-1示對照組2細(xì)胞誘導(dǎo)14天放大40倍效果；圖 2-b-2示對照組2細(xì)胞誘導(dǎo)14天放大100倍效果；圖2-b-3示對照組2細(xì)胞誘導(dǎo)21天放大40倍效果；圖2-b-4示對照組2細(xì)胞誘導(dǎo)21天放大100倍效果；圖2-c-1示對照組3細(xì)胞誘導(dǎo)14天放大40倍效果；圖2-c-2示對照組3細(xì)胞誘導(dǎo)14天放大100倍效果；圖2-c-3示對照組3細(xì)胞誘導(dǎo)21天放大40倍效果；圖2-c-4示對照組3細(xì)胞誘導(dǎo)21天放大100倍效果；圖2-d-1示對照組4細(xì)胞誘導(dǎo)14天放大40倍效果；圖2-d-2示對照組4細(xì)胞誘導(dǎo)14天放大100倍效果；圖2-d-3示對照組4細(xì)胞誘導(dǎo)21天放大40倍效果；圖2-d-4示對照組4細(xì)胞誘導(dǎo)21天放大100倍效果；圖2-e-1示對照組5細(xì)胞誘導(dǎo)14天放大40倍效果；圖2-e-2示對照組5細(xì)胞誘導(dǎo)14天放大100倍效果；圖2-e-3示對照組5細(xì)胞誘導(dǎo)21天放大40倍效果；圖2-e-4示對照組5細(xì)胞誘導(dǎo)21天放大100倍效果；圖2-f-1示實(shí)驗(yàn)組1細(xì)胞誘導(dǎo)14天放大40倍效果；圖2-f-2示實(shí)驗(yàn)組1細(xì)胞誘導(dǎo)14天放大100倍效果；圖2-f-3示實(shí)驗(yàn)組1細(xì)胞誘導(dǎo)21天放大40倍效果；圖2-f-4示實(shí)驗(yàn)組1細(xì)胞誘導(dǎo)21天放大100倍效果；圖2-g-1示實(shí)驗(yàn)組2細(xì)胞誘導(dǎo)14天放大40倍效果；圖2-g-2示實(shí)驗(yàn)組2細(xì)胞誘導(dǎo)14天放大100倍效果；圖2-g-3示實(shí)驗(yàn)組2細(xì)胞誘導(dǎo)21天放大40倍效果；圖2-g-4示實(shí)驗(yàn)組2細(xì)胞誘導(dǎo)21天放大100倍效果；圖2-h-1示實(shí)驗(yàn)組3細(xì)胞誘導(dǎo)14天放大40倍效果；圖2-h-2示實(shí)驗(yàn)組3細(xì)胞誘導(dǎo)14天放大100倍效果；圖2-h-3示實(shí)驗(yàn)組3細(xì)胞誘導(dǎo)21天放大40倍效果；圖2-h-4示實(shí)驗(yàn)組3細(xì)胞誘導(dǎo)21天放大100倍效果；

圖3示各組細(xì)胞OCN基因、Col-I基因、Runx2基因表達(dá)水平比較；柱子從左至右依次示對照組1、對照組2、對照組3、對照組4、對照組5、實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2、實(shí)驗(yàn)組3；*示與對照組1存在顯著性差異，p<0.05；**示與對照組1存在極顯著性差異，p<0.01。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了一種細(xì)胞培養(yǎng)液及其應(yīng)用和誘導(dǎo)骨骼肌干細(xì)胞向骨細(xì)胞分化的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

本發(fā)明采用的材料和儀器皆為普通市售品，皆可于市場購得。

下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：

實(shí)施例1 MDSCs的分離和傳代

1、取材：

取成人正常顳肌標(biāo)本(取自于開顱手術(shù)患者)，用含雙抗的PBS緩沖液沖洗后轉(zhuǎn)入無菌培養(yǎng)皿中，用眼科剪剪成1mm³左右大小的碎塊，然后移入50mL離心管中，PBS緩沖液吹打沖洗3次，靜置1分鐘后棄上層液及漂浮組織。

2、酶解：

向上述獲得的肌肉碎塊加入2倍的體積的混合酶，包括2.4u/mLDispase II、1％I型膠原酶，2.5mmol/L CaCl2，混勻后置37℃恒溫?fù)u床中消化60min左右，直到試管中的肌肉碎塊消化為肌糜，肉眼看不到肌塊。消化結(jié)束后，1000r/min離心5min，棄上清。加入2～3倍體積的0.25％胰蛋白酶-EDTA，混勻后置37℃恒溫?fù)u床中消化15min，消化結(jié)束后，1000r/min離心5min，棄上清。加入適量PBS重懸，1000r/min離心5min，棄上清。加入約3倍肌糜體積的PBS反復(fù)吹打后經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾，收集的濾液1000r/min離心5min，棄上清。生長培養(yǎng)基(含20％FBS的DMEM/F12)重懸細(xì)胞。

3、分離與純化：

采用差速貼壁分離技術(shù)對MDSCs進(jìn)行分離。將細(xì)胞懸液接種于25mL培養(yǎng)瓶中，放置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2h后的貼壁細(xì)胞記為PP1，其中未貼壁細(xì)胞吸出后移入新的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，并記為PP2。24h后將PP2中未貼壁的細(xì)胞吸出后移入新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，標(biāo)記為PP3。以后每24h進(jìn)行差速貼壁培養(yǎng)，直到獲得PP6，期間根據(jù)細(xì)胞的生長情況進(jìn)行換液。PP6培養(yǎng)3天后換液，以后每2-3天換液，倒置顯微鏡下觀察記錄細(xì)胞生長以及形成集落后每日擴(kuò)增情況，待細(xì)胞生長融合至70-80％后傳代培養(yǎng)。

4、MDSCs的傳代培養(yǎng)：

MDSCs原代培養(yǎng)8-10天，待細(xì)胞長滿80-90％，用吸管吸棄舊培養(yǎng)液，加入適量0.25％胰蛋白酶-EDTA，消化1-3分鐘，鏡下觀察細(xì)胞收縮變圓時，立即加入適量含20％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，收集細(xì)胞，1000r/min離心5min，棄上清。加入適量含20％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，進(jìn)行細(xì)胞記數(shù)，按8×10⁴cell/mL密度接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，5％CO₂培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，每隔2-3天換液一次。

5、MDSCs的鑒定:

1)細(xì)胞爬片制作：將無菌蓋玻片放置于6孔培養(yǎng)板中，對數(shù)生長期細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，按5×10⁴cell/mL密度接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔2mL，生長培養(yǎng)基為含20％FBS的DMEM/F12，培養(yǎng)24-48小時，使細(xì)胞生長于蓋玻片上。

2)Desmin、Sca-1免疫細(xì)胞化學(xué)染色:將放有蓋玻片6孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)液吸出，PBS緩沖液漂洗細(xì)胞鋪片5分鐘，重復(fù)3次。用4％多聚甲醛固定15分鐘，PBS緩沖液漂洗后甩干，中性樹膠粘附于載玻片上，4℃冰箱過夜。滴加3％過氧化氫孵育15分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS緩沖液漂洗5分鐘，重復(fù)3次。分別滴加一抗兔抗人結(jié)蛋白(Desmin)抗體(1:200稀釋)、兔抗人Sca-1抗體(1:100稀釋)，37℃濕盒內(nèi)孵育1小時，4℃過夜。次日取出后PBS緩沖液漂洗5分鐘，滴加二抗，37℃濕盒內(nèi)孵育40分鐘，PBS緩沖液漂洗5分鐘，重復(fù)3次，滴加新鮮配制的DAB溶液顯色5-10分鐘，在光鏡下觀察，用自來水進(jìn)行沖洗終止顯色。將甩干片子后，蘇木素復(fù)染1分鐘，分化返藍(lán)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在鏡下觀察，胞膜和/或胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，說明成功分離獲得MDSCs(圖1為MDSCsP2代形態(tài)圖)。

實(shí)施例2 MDSCs的分化

富血小板血漿(PRP)的制備：采集志愿者外周血，于超凈臺內(nèi)把血樣轉(zhuǎn)入15mL離心管，10mL每管，2500rpm/min，離心10min。離心結(jié)束后血樣分為淡黃色上清層，中間白細(xì)胞層和紅色細(xì)胞底層。吸取全部上清、白色細(xì)胞層及紅色細(xì)胞層上部1-2mm，移入新15ml離心管，2500rpm/min，離心5min。離心結(jié)束后吸取上清層和白細(xì)胞層，移入新15mL離心管，1200g/min，離心5min。離心結(jié)束后棄上清，保留最下面的2.5mL，即富血小板血漿。移入含氯化鈣的促凝管，4℃過夜，待血凝塊充分收縮后，4000rpm/min，離心12min，吸取出促凝管內(nèi)的全部上清，上清液即為激活的PRP，0.22μm過濾，濾液-20℃保存待用。

各受試組培養(yǎng)液的配方如表1：

表1實(shí)施例2～4

取實(shí)施例1制備的第3代MDSCs，按1×10⁴cell/mL密度接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)到60％～70％融合以上時，各受試組分別更換表1所示成骨誘導(dǎo)液。誘導(dǎo)分化培養(yǎng)14～21d后，檢測各受試組細(xì)胞分化情況。

1、茜素紅染色

對各組細(xì)胞進(jìn)行茜素紅染色，具體方法為：

棄培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞2到3次；加入4％多聚甲醛固定10-15min；吸棄多聚甲醛，PBS清洗3次；加入2％茜素紅，37℃孵育30min。孵育結(jié)束后吸棄殘液，用37℃預(yù)熱的去離子水清洗2到3次，每次20s；晾干后在倒置顯微鏡下觀察并采集圖像。各組細(xì)胞染色效果如圖2。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組1～3的培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞成為骨細(xì)胞的數(shù)量更多。

2、礦化結(jié)節(jié)面積

使用圖像分析軟件Image-Pro-Plus 5.0(Media Cybernetics,美國)對各組3個復(fù)孔中的細(xì)胞進(jìn)行礦化結(jié)節(jié)面積計(jì)算。礦化結(jié)節(jié)面積如表2所示。

表2礦化面積計(jì)算結(jié)果

注：**表示與各對照組相比，P<0.01。

由表2可知，對照組1不含誘導(dǎo)因子，不對細(xì)胞進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo)，因此，沒有著色，礦化面積為零。實(shí)驗(yàn)組1與其他各組均有顯著性差異(p<0.01)；其他各對照組之間無顯著性差異。實(shí)驗(yàn)組1中的礦化面積均值為90.45±0.78％，是對照組2礦化面積的2倍以上。其他實(shí)驗(yàn)組的效果也均顯著優(yōu)于對照組(p<0.01)。

3、堿性磷酸酶活性(ALP)測定

對各組MDSCs分別于誘導(dǎo)分化培養(yǎng)0d、7d、14d和21d對細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶活性定量測定。具體測定方法為：

棄原培養(yǎng)液，PBS洗3次，每孔加200μL 0.2％TritonX-100，37℃孵育1h，鏡下可見細(xì)胞裂解完全，吸出裂解液至新離心管，離心后取上清，留作備用。

對上述裂解液進(jìn)行蛋白含量測定，于96孔板中進(jìn)行。按BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書要求設(shè)置測定孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和空白孔，每組設(shè)3個復(fù)孔，每孔液體20μL，37℃孵育30min后檢測562nmOD值，空白孔調(diào)零。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)孔OD值繪制蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，代入各孔OD值，算出各組的蛋白濃度。

對上述裂解液進(jìn)行堿性磷酸酶活性測定，于96孔板中進(jìn)行。按堿性磷酸酶測定試劑盒說明書要求設(shè)置測定孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和空白孔，37℃孵育15min，每組設(shè)3個復(fù)孔，每孔加150μL顯色液，輕輕震蕩孔板混勻。檢測520nmOD值，空白孔調(diào)零。根據(jù)以下公式計(jì)算堿性磷酸酶活性：

堿性磷酸酶活性(U/gprot)＝(測定孔吸光度-空白孔吸光度)÷(標(biāo)準(zhǔn)孔吸光度-空白孔吸光度)×酚標(biāo)準(zhǔn)品濃度÷待測樣本蛋白濃度(gprot/mL)。

表3不同時間點(diǎn)各組細(xì)胞堿性磷酸酶活性

注：*表示與各對照組相比，P<0.05；

**表示與各對照組相比，P<0.01；

如表3所示，細(xì)胞培養(yǎng)7d、14d、21d后，在同一時間內(nèi)，各誘導(dǎo)組與未誘導(dǎo)組(對照組1)堿性磷酸酶的活性均有顯著性差異(p﹤0.01，*)，實(shí)驗(yàn)組1與對照組2-5均有顯著性差異(p﹤0.01，**)。堿性磷酸酶活性隨細(xì)胞培養(yǎng)時間增加而升高，但未誘導(dǎo)組(對照組1)上升不明顯，實(shí)驗(yàn)組1顯著升高。

4、效果實(shí)施例3成骨基因OCN、Col-I、Runx2的檢測

各組MDSCs分別于誘導(dǎo)分化培養(yǎng)21d后，RT-PCR法檢測成骨細(xì)胞標(biāo)志性基因OCN、Col-I、Runx2的表達(dá)。按TRIzol試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞總RNA提取，M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。按SYBR Green定量PCR試劑盒說明書對成骨細(xì)胞標(biāo)志性基因OCN、Col-I、Runx2表達(dá)水平進(jìn)行檢測。β-actin作為內(nèi)參基因。2-^△△Ct法定量分析。

表4引物序列

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，細(xì)胞培養(yǎng)21d后，各誘導(dǎo)組與未誘導(dǎo)組(對照組1)比較，成骨細(xì)胞標(biāo)志性基因OCN、Col-I、Runx2表達(dá)水平均有顯著性差異(*，p<0.01)，實(shí)驗(yàn)組1與其他各誘導(dǎo)組均有顯著性差異(**，p<0.05)。

以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。