一種哺乳動(dòng)物肌內(nèi)脂肪細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞分層共培養(yǎng)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種哺乳動(dòng)物肌內(nèi)脂肪細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞分層共培養(yǎng)方法。采取屠宰后動(dòng)物背最長(zhǎng)肌組織，沖洗剪碎后Ⅰ型膠原酶消化，消化后的混和液過(guò)篩；收集濾液，離心，分別收集上層成熟脂肪細(xì)胞液和下層肌細(xì)胞，分別加適量無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋洗滌，離心；取上層離心液和下層肌細(xì)胞液加入25cm2培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。成熟脂肪細(xì)胞由于浮力小將漂浮貼壁到上層“天花板”面，而肌細(xì)胞下沉到培養(yǎng)瓶底面生長(zhǎng)。該細(xì)胞培養(yǎng)模型可以將動(dòng)物同一肌肉組織的肌內(nèi)脂肪細(xì)胞和肌細(xì)胞在同一培養(yǎng)液中分層并共培養(yǎng)，從而為研究成熟脂肪細(xì)胞分泌物對(duì)肌細(xì)胞分化的影響或肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的相互作用提供新的體外細(xì)胞研究模型。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種晡乳動(dòng)物肌內(nèi)脂肪細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞分層共培養(yǎng)方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種哺乳動(dòng)物肌內(nèi)脂肪細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞分層共培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]動(dòng)物胴體肌肉和脂肪組織的比例及其結(jié)構(gòu)與分布，是決定肉用動(dòng)物生產(chǎn)性能和肉品質(zhì)的主要因素。一般來(lái)說(shuō)肌肉組織主要由骨骼肌細(xì)胞組成。脂肪組織又可分為皮下脂肪、內(nèi)臟脂肪和肌內(nèi)脂肪，不同部位脂肪沉積主要依賴(lài)于脂肪前體細(xì)胞的增殖、分化和聚脂成熟。其中肌內(nèi)脂肪是有益脂肪，是形成大理石紋肉的物質(zhì)基礎(chǔ)，直接參與了肉質(zhì)嫩度、多汁性和肉品風(fēng)味的形成，是影響肉質(zhì)風(fēng)味的重要因素。過(guò)去20年里，國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用細(xì)胞系如3T3-L1前脂肪細(xì)胞系和不同動(dòng)物如鼠、人、豬等皮下脂肪在細(xì)胞水平上對(duì)脂肪細(xì)胞分化過(guò)程進(jìn)行了研究并已取得了一定成果。但由于肌內(nèi)脂肪是夾雜在肌肉組織中的少量組織，以難和肌肉組織分離，數(shù)量少等原因而很少得到分離和研究。而有關(guān)骨骼肌細(xì)胞的研究則主要以小鼠肌細(xì)胞系C2C12為實(shí)驗(yàn)材料，大型哺乳類(lèi)動(dòng)物骨骼肌細(xì)胞的分離和研究也相對(duì)較少。
[0003]隨著對(duì)動(dòng)物發(fā)育規(guī)律的不斷研究和認(rèn)識(shí)，人們發(fā)現(xiàn)動(dòng)物體內(nèi)的肌肉和脂肪其實(shí)在動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。前體脂肪細(xì)胞可以分化為成熟脂肪，而成熟脂肪也可以去分化為前體脂肪甚至可以向肌肉細(xì)胞轉(zhuǎn)分化；同樣，在某些特殊的條件下肌肉祖細(xì)胞也可以分化為脂肪細(xì)胞。另外，脂肪細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子可以通過(guò)旁分泌和自分泌作用影響肌細(xì)胞的成長(zhǎng)，而肌細(xì)胞分泌因子也影響脂肪細(xì)胞。因此，將脂肪細(xì)胞和肌細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)只能觀察到各自的獨(dú)立事件，而無(wú)法研究它們之間的相互作用。
[0004]以上闡述可以得出，和皮下脂肪相比，肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的分子事件更值得研究，這就需要一個(gè)純度高的肌內(nèi)脂肪細(xì)胞模型，同時(shí)，要想了解肌內(nèi)脂肪細(xì)胞和肌細(xì)胞之間的關(guān)系，則需要將兩種細(xì)胞在相同環(huán)境條件下同培養(yǎng)，使其分泌的細(xì)胞因子相互作用，這樣，才能更好的模擬動(dòng)物體內(nèi)環(huán)境。所以本發(fā)明創(chuàng)新的將動(dòng)物同一肌肉組織的肌內(nèi)脂肪細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞在同一培養(yǎng)液中單獨(dú)而又共培養(yǎng)，既可以單獨(dú)分析脂肪細(xì)胞分化去分化事件，或肌細(xì)胞發(fā)育機(jī)制，又可以研究?jī)煞N細(xì)胞之間的相互作用，加之方法簡(jiǎn)單可操作，培養(yǎng)設(shè)備要求低，是一種很好的細(xì)胞培養(yǎng)模型，具有一定的研究推廣價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是解決哺乳動(dòng)物肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞難分離、雜細(xì)胞多等問(wèn)題，同時(shí)解決兩種細(xì)胞分層獨(dú)立而又共培養(yǎng)的難題，提供一種哺乳動(dòng)物肌內(nèi)脂肪細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞分層共培養(yǎng)方法，為研究細(xì)胞間的相互作用提供細(xì)胞模型。
[0006]一種哺乳動(dòng)物肌內(nèi)脂肪細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞分層共培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
[0007]1)取動(dòng)物背最長(zhǎng)肌，肌內(nèi)脂肪豐富的肌肉樣組織，除去可見(jiàn)的血管和結(jié)締組織，用PBS緩沖液沖洗；[0008]2)在無(wú)菌條件下將組織剪成小塊，加入濃度為lg/L I型膠原酶消化液消化；
[0009]3)消化結(jié)束后，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基等體積中和消化液，用孔徑為250 μ m的尼龍網(wǎng)篩過(guò)濾細(xì)胞懸液；
[0010]4)步驟3)的濾液經(jīng)900~1200r/m離心8~15min,取離心后的頂層懸浮成熟脂肪細(xì)胞液加入25cm2培養(yǎng)瓶中，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)；所述的25cm2培養(yǎng)瓶需預(yù)先灌滿(mǎn)含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置孵育4~6小時(shí)，使培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)保持均衡；
[0011]5)取上一步離心的下層細(xì)胞加紅細(xì)胞裂解液洗滌，輕輕吹打以裂解紅細(xì)胞，作用3~8min后900~1200r/m離心3~8min ;倒掉上層離心液,加無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋洗漆下層細(xì)胞，再用孔徑為80 μ m的尼龍網(wǎng)篩過(guò)濾,收集濾液，1000r/min離心5min ;倒掉上層離心液，加入500 μ L含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，吹打分散細(xì)胞后接種于裝有含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基的直徑為3.5cm培養(yǎng)皿中，置含37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)；
[0012]6)接種后2~3小時(shí)，取出細(xì)胞培養(yǎng)皿，輕輕吹打培養(yǎng)皿的底部，吸出含肌細(xì)胞的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移到步驟入4)中的25cm2培養(yǎng)瓶中，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞；這一步驟的原理是脂肪前體細(xì)胞貼壁比骨骼肌細(xì)胞快，所以2~3小時(shí)后脂肪前體細(xì)胞會(huì)貼壁在培養(yǎng)皿底部生長(zhǎng)，不用胰酶消化是不會(huì)下來(lái)的，而輕輕吹打培養(yǎng)皿的底部，吸出來(lái)的培養(yǎng)液中幾乎只含骨骼肌細(xì)胞；
[0013]7)成熟脂肪細(xì)胞由于浮力小將漂浮貼壁到“天花板”面，而骨骼肌細(xì)胞會(huì)下沉到瓶底生長(zhǎng)，從而24小時(shí)后就能夠?qū)崿F(xiàn)在同一培養(yǎng)瓶中獲得來(lái)自同一動(dòng)物同一組織的分層共培養(yǎng)的骨骼肌細(xì)胞和肌內(nèi)脂肪細(xì)胞。
[0014]本發(fā)明所述的哺乳動(dòng)物肌內(nèi)脂肪細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞分層共培養(yǎng)方法，優(yōu)選包括以下步驟:
[0015]I)取動(dòng)物背最長(zhǎng)肌，肌內(nèi)脂肪豐富的肌肉樣組織，剪去可見(jiàn)的血管和結(jié)締組織，用PBS緩沖液沖洗三次；
[0016]2)在無(wú)菌條件下將組織剪成Imm3左右的小塊，加入lg/L I型膠原酶消化液37°C，水浴鍋中振蕩消化90min ;
[0017]3)消化結(jié)束后，用含10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基等體積中和消化液，用孔徑為250 μ m的尼龍網(wǎng)篩過(guò)濾細(xì)胞懸液；
[0018]4) 1000r/m離心lOmin，取500 μ L4X105頂層懸浮成熟脂肪細(xì)胞液加入25cm2培養(yǎng)瓶中，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)；所述的25cm2培養(yǎng)瓶需預(yù)先灌滿(mǎn)含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置孵育4~6小時(shí)，使培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)保持均衡；
[0019]5)倒掉上一步離心的上層離心液，取下層細(xì)胞加紅細(xì)胞裂解液洗滌，輕輕吹打作用3~5min以裂解紅細(xì)胞，1000r/min離心5min ；
[0020]6)倒掉上層離心液，加適量無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋洗滌下層細(xì)胞，再用孔徑為80 μ m的尼龍網(wǎng)篩過(guò)濾，收集濾液，1000r/min離心5min ；
[0021]7)倒掉上層離心液，加入500 μ L含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，吹打分散細(xì)胞后接種于直徑為3.5cm培養(yǎng)皿中，置含37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)；[0022]8)接種后2~3小時(shí)，取出細(xì)胞培養(yǎng)皿，輕輕吹打培養(yǎng)皿的底部，吸出含肌細(xì)胞的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移到步驟入4)中的25cm2培養(yǎng)瓶中，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞；
[0023]9)成熟脂肪細(xì)胞由于浮力小將漂浮貼壁到“天花板”面，而骨骼肌細(xì)胞會(huì)下沉到瓶底生長(zhǎng)，從而24小時(shí)后就能夠?qū)崿F(xiàn)在同一培養(yǎng)瓶中獲得來(lái)自同一動(dòng)物同一組織的分層共培養(yǎng)的骨骼肌細(xì)胞和肌內(nèi)脂肪細(xì)胞。
[0024]所述的濃度為lg/L I型膠原酶消化液為在無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液中加入20g/L牛血清白蛋白和lg/L膠原酶I型制得。
[0025]按照本發(fā)明所述的方法獲得的分層共培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物肌內(nèi)脂肪細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞。
[0026]有益效果:
[0027]本發(fā)明與現(xiàn)有的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)相比，其優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在:
[0028](I)本發(fā)明相比膠原酶消化法單獨(dú)培養(yǎng)骨骼肌細(xì)胞和單獨(dú)培養(yǎng)前體脂肪細(xì)胞，步驟更少、技術(shù)更簡(jiǎn)單，可一次性獲得兩種細(xì)胞。
[0029](2)本發(fā)明與獨(dú)立培養(yǎng)肌細(xì)胞和獨(dú)立培養(yǎng)前體脂肪細(xì)胞相比，可節(jié)省試驗(yàn)花費(fèi)一半。
[0030](3)本發(fā)明利用成熟脂肪細(xì)胞浮力小的特點(diǎn)，獲得99%以上純度的去分化前體脂肪細(xì)胞，解決了哺乳動(dòng)物肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞難分離、細(xì)胞純度不高等問(wèn)題。
[0031](4)本發(fā)明解決了同一動(dòng)物同一組織兩種細(xì)胞(脂肪細(xì)胞和肌細(xì)胞)分層獨(dú)立而又共培養(yǎng)的技術(shù)難題。
[0032](5)本發(fā)明培養(yǎng)的細(xì)胞成活`效率高，經(jīng)多次觀察證實(shí)用這種方法培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞活力好、細(xì)胞特征明顯，與兩種獨(dú)立培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)一致，并且均表達(dá)各自的標(biāo)志基因。同時(shí)，可以用來(lái)研究共同培養(yǎng)時(shí)不同細(xì)胞分泌因子對(duì)細(xì)胞分化、發(fā)育、基因表達(dá)的改變和影響，是一種很好的研究脂肪細(xì)胞和肌細(xì)胞間互作的細(xì)胞模型，彌補(bǔ)了體外不能很好模擬動(dòng)物機(jī)體脂肪組織和肌肉組織相互影響的試驗(yàn)缺陷，為進(jìn)一步探索哺乳動(dòng)物脂肪和肌肉平衡發(fā)育機(jī)制提供了有益的試驗(yàn)材料。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0033]圖1成熟脂肪細(xì)胞漂浮到培養(yǎng)瓶“頂部”貼壁生長(zhǎng)并逐漸去分化為前體脂肪細(xì)胞
[0034]圖2去分化的肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞再分化為脂肪細(xì)胞
[0035]圖3分化中的前體脂肪細(xì)胞表達(dá)脂肪標(biāo)志基因
[0036]注:1，2，3，4分別表示分化第2天，第4天，第6天，第8天PPAR Y表達(dá)情況；5，6，7，8分別表示分化第2天，第4天，第6天，第8天C/ΕΒΡ α表達(dá)情況。
[0037]圖4前體脂肪細(xì)胞標(biāo)志基因Pref -1瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果
[0038]圖5培養(yǎng)瓶“底部“骨骼肌細(xì)胞形態(tài)
[0039]圖6骨骼肌細(xì)胞標(biāo)志基因MyoD和Myf5的RT - PCR電泳圖
[0040]注:1，2分別表示頂部脂肪細(xì)胞組和底部成纖維細(xì)胞組。
[0041 ] 圖7本發(fā)明方法示意圖。
圖8肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞和肌細(xì)胞細(xì)胞總RNA提取圖【具體實(shí)施方式】
[0042]實(shí)施例1:
[0043]肉品質(zhì)主要取決于肌細(xì)胞類(lèi)型和肌內(nèi)脂肪含量。3T3 - LI前體脂肪細(xì)胞系及原代培養(yǎng)的各種動(dòng)物的脂肪基質(zhì)微管細(xì)胞(SVF)是目前研究脂肪細(xì)胞增殖、分化的主要細(xì)胞模型。但這些細(xì)胞模型各有缺點(diǎn):如3T3 -LI細(xì)胞系來(lái)源于17~19日齡小鼠胚胎細(xì)胞，染色體非整倍體，不能很好的反映動(dòng)物體內(nèi)環(huán)境；原代培養(yǎng)的SVF雖然能夠較好的模擬動(dòng)物體內(nèi)環(huán)境，但這種細(xì)胞純度不高，不利于精細(xì)研究。鑒于以上問(wèn)題，人們正在尋找一種能夠較準(zhǔn)確的反映肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化過(guò)程的前體脂肪細(xì)胞模型。而骨骼肌占動(dòng)物體重的40% - 50%,是重要的畜產(chǎn)品，建立骨骼肌細(xì)胞模型對(duì)了解肌細(xì)胞類(lèi)型的形成有至關(guān)重要的作用。
[0044]豬在中國(guó)是最主要的肉用哺乳類(lèi)家畜之一，其肉品質(zhì)的形成機(jī)理一直是眾多學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。另外，豬的各種生理過(guò)程與人類(lèi)較相近，并且其蓄積脂肪的能力最強(qiáng)，是一種很好的研究人類(lèi)肥胖和畜禽體脂過(guò)渡沉積的模式動(dòng)物。為此，我們用“天花板”培養(yǎng)法建立了豬肌內(nèi)脂肪細(xì)胞和肌細(xì)胞體外分層共培養(yǎng)模型。 [0045]I試驗(yàn)材料
[0046]1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和組織
[0047]實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為肥育出欄豬，經(jīng)臨床檢查健康無(wú)病，屠宰后30min內(nèi)取背最長(zhǎng)肌肌肉。
[0048]1.2儀器與器械
[0049]空氣層流過(guò)濾室、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、倒置相差顯微鏡、超凈工作臺(tái)、電子分析天平、普通冰箱、自動(dòng)雙重純水蒸餾器、全自動(dòng)壓力蒸汽消毒器、DK - 8D電熱恒溫水槽、普通離心機(jī)、燒杯，量筒，酒精燈，眼科彎鑷，不銹鋼細(xì)胞篩及尼龍篩網(wǎng)，離心管，移液器，細(xì)胞計(jì)數(shù)板，培養(yǎng)板及培養(yǎng)皿等。
[0050]1.3試劑及配制
[0051]DMEM/F12培養(yǎng)基、10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基、I型膠原酶、胎牛血清、TRIzol總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR反應(yīng)試劑盒、Oil Red - O染液等。
[0052]I型膠原酶消化液:無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基，20g/L牛血清白蛋白，lg/L膠原酶I型(臨用時(shí)加入，過(guò)濾后使用)。
[0053]紅細(xì)胞裂解液:154mmol/LNH4Cl, IOmmoI/L KHCO3,0.lmmol/L EDTA，三蒸水。
[0054]油紅O染液:0.5g油紅0，加入100mL98%的異丙醇，置60°C恒溫箱中過(guò)夜，使油紅O充分溶解。臨用時(shí)取4mL雙蒸水加6mL原液，靜置30min后過(guò)濾使用。
[0055]本發(fā)明使用的DMEM/F12培養(yǎng)基可以通過(guò)市售途徑購(gòu)買(mǎi)，也可以自行配制，為DMEM培養(yǎng)基和F12培養(yǎng)基1:1混合而成。含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基是在DMEM/F12培養(yǎng)基中添加10%的胎牛血清。
[0056]2試驗(yàn)方法
[0057]2.1操作流程
[0058]I)取動(dòng)物背最長(zhǎng)肌，肌內(nèi)脂肪豐富的肌肉樣組織，剪去可見(jiàn)的血管和結(jié)締組織，用PBS緩沖液沖洗三次；
[0059]2)在無(wú)菌條件下將組織剪成Imm3左右的小塊，加入I型膠原酶(lg/L)消化液消化90min (37 °C，水浴鍋中振蕩)；
[0060]3)消化結(jié)束后，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基等體積中和消化液，用孔徑為250 μ m的尼龍網(wǎng)篩過(guò)濾細(xì)胞懸液；
[0061]4) 1000r/m離心lOmin，取500 μ L4X105頂層懸浮成熟脂肪細(xì)胞液加入25cm2培養(yǎng)瓶中，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)；所述的25cm2培養(yǎng)瓶需預(yù)先灌滿(mǎn)含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置孵育4~6小時(shí)，使培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)保持均衡；
[0062]5)倒掉上一步離心的上層離心液，取下層細(xì)胞加紅細(xì)胞裂解液洗滌，輕輕吹打作用3~5min以裂解紅細(xì)胞，1000r/min離心5min ；
[0063]6)倒掉上層離心液，加適量無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋洗滌下層細(xì)胞，再用孔徑為80 μ m的尼龍網(wǎng)篩過(guò)濾,收集濾液，1000r/min離心5min ；
[0064]7)倒掉上層離心液，加入500 μ L含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，吹打分散細(xì)胞后接種于裝有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基的直徑為3.5cm培養(yǎng)皿中，置含37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)；
[0065]8)由于脂肪前體細(xì)胞貼壁速度比骨骼肌細(xì)胞快，接種后3小時(shí)，取出細(xì)胞培養(yǎng)皿，輕輕吹打培養(yǎng)皿的底部，利用差速貼壁原理吸出含骨骼肌細(xì)胞的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移到步驟入4)中的25cm2培養(yǎng)瓶中，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞；
[0066]9)成熟脂肪細(xì)胞由于浮力小將漂浮貼壁到“天花板”面，而骨骼肌細(xì)胞會(huì)下沉到瓶底生長(zhǎng)，24小時(shí)后就能夠?qū)崿F(xiàn)在同一培養(yǎng)瓶中獲得來(lái)自同一動(dòng)物同一組織的骨骼肌細(xì)胞和肌內(nèi)脂肪細(xì)胞，并能夠分層共培養(yǎng)。這樣為研究肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分泌物對(duì)骨骼肌細(xì)胞分化的影響或骨骼肌細(xì)胞和肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的相互作用提供模型。
[0067]2.2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和鑒定
[0068]2.2.1形態(tài)學(xué)觀察
`[0069]每天在倒置顯微鏡下，分別觀察培養(yǎng)瓶“頂部”和“底部”細(xì)胞，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，特別注意其形態(tài)的改變，記錄可見(jiàn)變化特征及其出現(xiàn)時(shí)間，拍照。
[0070]2.2.2油紅O染色鑒定肌內(nèi)成熟脂肪細(xì)胞
[0071]PBS洗滌細(xì)胞2次，10%甲醛固定30min，PBS洗2次，油紅O染色20min，PBS洗I次，顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)呈紅色。
[0072]2.2.3去分化肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞鑒定
[0073]觀察細(xì)胞，待成熟脂肪細(xì)胞完全去分化后，用RT -PCR技術(shù)分別檢測(cè)前體脂肪細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞標(biāo)志基因，具體操作步驟如下:
[0074](I)肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞和肌細(xì)胞細(xì)胞總RNA提取，步驟見(jiàn)圖8。
[0075](2)細(xì)胞總RNA檢測(cè)
[0076]
[0077]
[0078]
[0079]提取的RNA溶解在適量無(wú)RNAse的DEPC水中。1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外光下觀察RNA完整性和有無(wú)降解及基因組DNA污染；以500倍DEPC水稀釋?zhuān)米贤夥止夤舛扔?jì)測(cè)定波長(zhǎng)260、280處OD值，計(jì)算0D260/0D280值和RNA濃度。提取的無(wú)污染、無(wú)降解RNA 0D260/0D280 值為 1.8 ~2.0。如有 DNA 污染，用 DNAse I 處理。
[0080](3) PCR 引物[0081]應(yīng)用Primer Premier5.0軟件,按照引物設(shè)計(jì)的基本要求,設(shè)計(jì)脂肪細(xì)胞標(biāo)志基因C/EBP α和PPAR Y，骨骼肌標(biāo)志基因MyoD和Myf 5，β -actin基因PCR擴(kuò)增引物，引物長(zhǎng)度18~22bp。由上海生工合成。
[0082]表1脂肪細(xì)胞和肌細(xì)胞標(biāo)志基因RT - PCR引物
[0083]
【權(quán)利要求】
1.一種哺乳動(dòng)物肌內(nèi)脂肪細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞分層共培養(yǎng)方法，其特征在于包括以下步驟: 1)取動(dòng)物背最長(zhǎng)肌，肌內(nèi)脂肪豐富的肌肉樣組織，除去可見(jiàn)的血管和結(jié)締組織，用PBS緩沖液沖洗； 2)在無(wú)菌條件下將組織剪成小塊，加入濃度為lg/LI型膠原酶消化液消化； 3)消化結(jié)束后，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基等體積中和消化液，用孔徑為.250 μ m的尼龍網(wǎng)篩過(guò)濾細(xì)胞懸液； 4)步驟3)的濾液經(jīng)900~1200r/m離心8~15min,取離心后的頂層懸浮成熟脂肪細(xì)胞液加入25cm2培養(yǎng)瓶中，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)；所述的25cm2培養(yǎng)瓶需預(yù)先灌滿(mǎn)含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置孵育4~6小時(shí)，使培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)保持均衡； 5)取上一步離心的下層細(xì)胞加紅細(xì)胞裂解液洗滌，輕輕吹打以裂解紅細(xì)胞，作用3~8min后900~1200r/m離心3~8min ;倒掉上層離心液,加無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋洗滌下層細(xì)胞，再用孔徑為80 μ m的尼龍網(wǎng)篩過(guò)濾，收集濾液，1000r/min離心5min ;倒掉上層離心液，加入500μ L含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，吹打分散細(xì)胞后接種于裝有含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基的直徑為3.5cm培養(yǎng)皿中，置含37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)； 6)接種后2~3小時(shí)，取出細(xì)胞培養(yǎng)皿，輕輕吹打培養(yǎng)皿的底部，吸出含肌細(xì)胞的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移到步驟入4)中的25cm2培養(yǎng)瓶中，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞； 7)成熟脂肪細(xì)胞由于浮力小將漂浮貼壁到“天花板”面，而骨骼肌細(xì)胞會(huì)下沉到瓶底生長(zhǎng)，從而24小時(shí)后就能夠?qū)崿F(xiàn)在同一培養(yǎng)瓶中獲得來(lái)自同一動(dòng)物同一組織的分層共培養(yǎng)的骨骼肌細(xì)胞和肌內(nèi)脂肪細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的哺乳動(dòng)物肌內(nèi)脂肪細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞分層共培養(yǎng)方法，其特征在于包括以下步驟: 1)取動(dòng)物背最長(zhǎng)肌，肌內(nèi)脂肪豐富的肌肉樣組織，剪去可見(jiàn)的血管和結(jié)締組織，用PBS緩沖液沖洗三次； 2)在無(wú)菌條件下將組織剪成Imm3左右的小塊，加入lg/LI型膠原酶消化液37°C，水浴鍋中振蕩消化90min ； 3)消化結(jié)束后，用含10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基等體積中和消化液，用孔徑為.250 μ m的尼龍網(wǎng)篩過(guò)濾細(xì)胞懸液； 4)1000r/m離心lOmin，取500 μ L4X IO5頂層懸浮成熟脂肪細(xì)胞液加入25cm2培養(yǎng)瓶中，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)；所述的25cm2培養(yǎng)瓶需預(yù)先灌滿(mǎn)含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置孵育4~6小時(shí)，使培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)保持均衡； 5)倒掉上一步離心的上層離心液，取下層細(xì)胞加紅細(xì)胞裂解液洗滌，輕輕吹打作用.3~5min以裂解紅細(xì)胞，1000r/min離心5min ； 6)倒掉上層離心液，加適量無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋洗滌下層細(xì)胞，再用孔徑為80μ m的尼龍網(wǎng)篩過(guò)濾，收集濾液，1000r/min離心5min ； 7)倒掉上層離心液，加入500μL含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，吹打分散細(xì)胞后接種于直徑為3.5cm培養(yǎng)皿中，置含37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)；8)接種后2~3小時(shí)，取出細(xì)胞培養(yǎng)皿，輕輕吹打培養(yǎng)皿的底部，吸出含肌細(xì)胞的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移到步驟入4)中的25cm2培養(yǎng)瓶中，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞； 9)成熟脂肪細(xì)胞由于浮力小將漂浮貼壁到“天花板”面，而骨骼肌細(xì)胞會(huì)下沉到瓶底生長(zhǎng)，從而24小時(shí)后就能夠?qū)崿F(xiàn)在同一培養(yǎng)瓶中獲得來(lái)自同一動(dòng)物同一組織的分層共培養(yǎng)的骨骼肌細(xì)胞和肌內(nèi)脂肪細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求 1或2所述的哺乳動(dòng)物肌內(nèi)脂肪細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞分層共培養(yǎng)方法，其特征在于所述的濃度為lg/L I型膠原酶消化液為在無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基中加入20g/L牛血清白蛋白和lg/L膠原酶I型制得。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法獲得的分層共培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物肌內(nèi)脂肪細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12N5/077GK103773733SQ201310665450
【公開(kāi)日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2013年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月9日
【發(fā)明者】李惠俠, 周光宏 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)