專利名稱：一種高純度小鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的簡(jiǎn)易提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)單易行、高純度的小鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的提取方法，為骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染、骨骼肌及心肌再生提供種子細(xì)胞。
背景技術(shù)：
隨著顯微外科技術(shù)的發(fā)展和人們對(duì)小鼠模型優(yōu)越性的認(rèn)識(shí)，如繁殖快(只需21 天)、胎仔數(shù)多、維持消耗少及基因、信號(hào)通道與人類相似度高等，小鼠模型在目前的科研中應(yīng)用廣泛。小鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞是骨骼肌中具有分化增殖潛能的肌源性干細(xì)胞。作為成體干細(xì)胞的一種，高純度骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞作為成體種子細(xì)胞及基因治療工程細(xì)胞在缺血性心臟病的治療中展示了良好的臨床應(yīng)用前景。然而，肌衛(wèi)星細(xì)胞在成年骨骼肌中含量較低， 約1%-5%，而其數(shù)量在個(gè)體的生命過(guò)程中由于各種因素的影響而逐漸減少，且在一般情況下處于細(xì)胞周期的GO期，這就決定了通過(guò)原代細(xì)胞分離技術(shù)所能獲取的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量必然是有限的。因此，其分離和培養(yǎng)技術(shù)一直在不斷地摸索和改進(jìn)中。傳統(tǒng)方法多采用膠原酶和胰酶分步消化及差速貼壁的方式進(jìn)行提取純化，或者通過(guò)包有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒(Percoll)梯度離心法分離衛(wèi)星細(xì)胞，這些方法中，由于對(duì)消化及差速貼壁時(shí)間較難把握，且未形成統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，因而得到的衛(wèi)星細(xì)胞依然含有大量的成纖維細(xì)胞等雜質(zhì)細(xì)胞，純度較低；而流式細(xì)胞分選術(shù)、免疫磁珠分選術(shù)和平面黏附分離法等方法可獲得高純度衛(wèi)星細(xì)胞，但部分單位缺乏相應(yīng)的設(shè)備條件，且實(shí)驗(yàn)所需抗體等試劑價(jià)格昂貴，所使用抗體也有相應(yīng)的物種特異性，使這種方法的廣泛應(yīng)用受限。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速、高效、經(jīng)濟(jì)地獲得高純度的小鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的方法。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種高純度小鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的簡(jiǎn)易提取方法，其特征在于，具體步驟為
第一步取5 7周齡C57BL/6小鼠，于小鼠四肢肌注射0. 75%鹽酸布比卡因0. 05
0.15mL ；
第二步36 60小時(shí)后，處死小鼠，用75vd%酒精浸泡10 20min，在超凈工作臺(tái)內(nèi)剔出四肢肌肉0. 5 1. 5g，去除血管、脂肪及筋膜，無(wú)菌PBS液沖洗，將肌肉剪成0. 5
1.5mm3小粒，加入PBS液靜置3 7min，離心，棄上清液；
第三步加入1 5mL混合消化酶，置于37°C、CO2體積濃度為5%的孵箱中孵化，每隔 10 20min用吸管吹打震蕩3 7min，重復(fù)3次，加入3 7mL含15vol%胎牛血清的F12/ DMEM培養(yǎng)基中止消化，過(guò)濾細(xì)胞懸液，將所得濾液離心，棄上清，細(xì)胞沉淀用生長(zhǎng)培養(yǎng)基重懸至2 4mL待用；
第四步以胎牛血清潤(rùn)濕離心管管壁后，依次將60%Percoll分離液2 4mL、 20%Percoll分離液2 4mL、細(xì)胞懸液2 4mL沿管壁注入，離心，用長(zhǎng)頭吸管小心吸出20%Percoll分離液與60% Percoll分離液分界面的細(xì)胞懸液0. 5 1. 5mL，離心，得細(xì)胞沉淀； 第五步細(xì)胞沉淀用生長(zhǎng)培養(yǎng)基重懸后移入鼠尾膠包被的培養(yǎng)瓶中，于CO2溫箱中培養(yǎng) 0.證，命名為PP1，后將培養(yǎng)基連同非貼壁細(xì)胞一同轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶中再培養(yǎng)0.證，命名為PP2，之后將培養(yǎng)基連同未貼壁的細(xì)胞轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)Mh，命名為PP3，將PP3繼續(xù)培養(yǎng)7 后全量換液，得到小鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞。優(yōu)選地，所述的混合消化酶配制方法為將II型膠原酶0. llg, II型dispease酶 0. 124g, CaCl2Hmg 以及 PBS50mL 混合。本發(fā)明的原理是
骨骼肌中的肌衛(wèi)星細(xì)胞存在于肌纖維的肌膜層與基底膜之間，成體骨骼肌中衛(wèi)星細(xì)胞含量極少，當(dāng)骨骼肌組織受到損傷時(shí)，這些靜息期的肌衛(wèi)星細(xì)胞才會(huì)被激活，大量分裂、增殖、分化。因此，當(dāng)以鹽酸布比卡因預(yù)處理骨骼肌后，能引起肌組織損傷，伴有大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，從而激活衛(wèi)星細(xì)胞并使其大量增殖。具體機(jī)制可能為，肌組織損傷后產(chǎn)生的大量單核及巨噬細(xì)胞能通過(guò)釋放某些具有有絲分裂活性的細(xì)胞因子如IL-6等和生長(zhǎng)因子促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞的活化增殖和分化。此外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，肌衛(wèi)星細(xì)胞與存活的肌纖維之間的相互接觸之間的接觸會(huì)抑制肌衛(wèi)星細(xì)胞的活化、增殖和分化，布比卡因能選擇性損傷肌纖維而對(duì)肌衛(wèi)星細(xì)胞沒(méi)有損傷作用，肌纖維溶解壞死可導(dǎo)致這種抑制關(guān)系的削弱，引起肌衛(wèi)星細(xì)胞的活化增殖。本實(shí)驗(yàn)中以布比卡因預(yù)處理后，所收獲的細(xì)胞量明顯增高，為純化后保持足量的衛(wèi)星細(xì)胞提供了保障。傳統(tǒng)方法多采用膠原酶和胰酶分步消化、多次離心的方式進(jìn)行衛(wèi)星細(xì)胞的提取。 本發(fā)明在傳統(tǒng)分離方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了優(yōu)化和改進(jìn)，通過(guò)采用自配的混合酶消化液對(duì)骨骼肌組織進(jìn)行一次性消化，僅需一次低速離心便可獲得細(xì)胞。此種改良方法避免了傳統(tǒng)方法中多次消化離心的繁瑣操作，節(jié)省了細(xì)胞提取的時(shí)間，從而減輕了消化酶對(duì)細(xì)胞的損傷，減少了細(xì)胞的丟失，增加了細(xì)胞的收獲。在衛(wèi)星細(xì)胞分離擴(kuò)增培養(yǎng)過(guò)程中，骨骼肌組織中的成纖維細(xì)胞會(huì)影響衛(wèi)星細(xì)胞的純度和生長(zhǎng)狀態(tài)，兩者之間存在著一種此消彼長(zhǎng)的競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)特征，因此，如何去除夾雜其中的成纖維細(xì)胞的污染是純化方式不斷改良的主要目標(biāo)。流式細(xì)胞分選術(shù)、免疫磁珠分選術(shù)和平面黏附分離法等方法可獲得高純度衛(wèi)星細(xì)胞，但部分單位缺乏相應(yīng)的設(shè)備條件，且實(shí)驗(yàn)所需抗體等試劑價(jià)格昂貴，所使用抗體也有相應(yīng)的物種特異性，使這種方法的廣泛應(yīng)用受限。因此，目前研究的重點(diǎn)集中在如何快速、高效、經(jīng)濟(jì)地獲得高純度的衛(wèi)星細(xì)胞。大部分成纖維細(xì)胞于10-30min內(nèi)貼壁，而衛(wèi)星細(xì)胞30min左右開(kāi)始貼壁，但附著不牢，輕輕晃動(dòng)即浮起。普通的差速貼壁無(wú)法使一部分成纖維細(xì)胞貼壁，衛(wèi)星細(xì)胞純度較低；而多次反復(fù)差速貼壁純化的最佳差速時(shí)間仍然不能確定，因此造成提取衛(wèi)星細(xì)胞的純度無(wú)法保證；Percoll是一種包有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒，不穿透生物膜，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，其擴(kuò)散常數(shù)低，預(yù)先鋪設(shè)的60%和20%的兩個(gè)非連續(xù)密度梯度比較穩(wěn)定，在低速離心力下在數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘內(nèi)即可達(dá)到滿意的細(xì)胞分離效果，因此廣泛應(yīng)用于分離細(xì)胞、亞細(xì)胞成分、細(xì)菌及病毒的實(shí)驗(yàn)中。然而，雖然Percoll分離法來(lái)分離細(xì)胞收獲的衛(wèi)星細(xì)胞純度高于單純差速貼壁法，但也不能完全避免非肌源性細(xì)胞的混入。因此，為進(jìn)一步減少非肌源性細(xì)胞污染，本發(fā)明通過(guò)反復(fù)對(duì)比研究，優(yōu)化了一系列差速貼壁時(shí)間，并將Percoll分離法與之相結(jié)合，其獲得的PP3純度明顯高于其他純化方法，且提純時(shí)間跨度僅為兩天，避免了反復(fù)差速貼壁法長(zhǎng)久的耗時(shí)。細(xì)胞傳代后，其混雜的成纖維細(xì)胞將因?yàn)檩^快的增殖速度形成生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，從而造成衛(wèi)星細(xì)胞純度迅速下降。故在每次傳代時(shí)仍應(yīng)通過(guò)預(yù)貼壁30min盡可能去除成纖維細(xì)胞，以維持傳代衛(wèi)星細(xì)胞一定的純度。本發(fā)明方法簡(jiǎn)易、快速，骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞純化率及產(chǎn)率高，經(jīng)本方法提取、純化的小鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞體外培養(yǎng)具有較高的增殖及分化能力，可進(jìn)行體外基因修飾或體內(nèi)移植。本方法通過(guò)預(yù)處理肌肉組織，一步法混合酶消化，結(jié)合Percoll不等密度梯度離心，并通過(guò)優(yōu)化差速貼壁時(shí)間，提取了高純度的小鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，為進(jìn)一步的基因轉(zhuǎn)染及細(xì)胞移植提供了基礎(chǔ)。


圖1為Percoll不等密度梯度離心后示意圖骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞為20%及 60%Percoll液交界處。圖2為提純后骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞desmin免疫熒光染色圖deSmin表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性。圖3為小鼠成纖維細(xì)胞desmin免疫染色(陰性對(duì)照)圖無(wú)desmin表達(dá)。圖4為流式細(xì)胞儀衛(wèi)星細(xì)胞純度鑒定圖紅色曲線為骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞desmin陽(yáng)性純度(92. 59 士 1.29%)，綠色曲線為陰性對(duì)照的小鼠成纖維細(xì)胞。圖5為提純后第4天圖骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞呈梭形，形態(tài)均一。圖6為肌管形成圖用馬血清誘導(dǎo)分化后，多個(gè)相鄰衛(wèi)星細(xì)胞可融合可形成肌管。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例來(lái)具體說(shuō)明本發(fā)明。本發(fā)明中所述的？85185液皆為？!1值為7.4 的磷酸鹽緩沖溶液。本發(fā)明中所有的濃度均為體積濃度。
實(shí)施例1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6周齡C57BL/6小鼠，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。2.取材部位預(yù)處理以100 μ L微量注射器于小鼠四肢肌注射0.75%鹽酸布比卡因 0. lmL。3.取材48小時(shí)后，頸椎脫臼法處死小鼠，將整個(gè)小鼠以75%酒精浸泡15min，在超凈工作臺(tái)內(nèi)剔出四肢肌肉約lg，仔細(xì)去除肌肉上附著的血管、脂肪及筋膜，無(wú)菌PBS液沖洗3遍，將肌肉剪成約Imm3肉糜小粒，加入無(wú)菌PBS液浸泡，靜置5min，離心，棄上清液。4. 一步法混合消化酶消化加入3mL混合消化酶(配制方法為將II型膠原酶(Sigma Aldrich, Catalog No. :C6885)0. llg, II 型 dispease 酶(Roche, Catalog No. :4942078001)0. 124g, CaCl2Hmg, PBS50mL 混合)，置于 37°C、5%C02 孵箱中孵化，每隔 15min用吸管吹打震蕩5min重復(fù)3次，一小時(shí)后，加入5mL含15%胎牛血清的F12/DMEM培養(yǎng)基中止消化，200目過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液2次，1400r/min離心lOmin，棄上清，細(xì)胞沉淀用 DMEM/F12 生長(zhǎng)培養(yǎng)基(Gibco, Catalog No. 11330032)重懸至 3mL 待用。5. Percoll非連續(xù)密度梯度離心以2mL胎牛血清(Gibco, Catalog No. 10099141)潤(rùn)濕 15mL 離心管管壁后，依次將 60%Percoll 分離液(GE Healthcare, CatalogNo. 17-0891-01) 3mL、20%Percoll分離液3mL、步驟4中的細(xì)胞懸液3mL沿管壁緩緩注入， 1800r/min離心20min。長(zhǎng)頭吸管小心吸出20% Percoll分離液與60% Percoll分離液分界面的細(xì)胞懸液約lmL，1000r/min離心5min，得細(xì)胞沉淀。6.優(yōu)化差速貼壁時(shí)間細(xì)胞沉淀用含15%胎牛血清的DMEM/F12生長(zhǎng)培養(yǎng)基重懸至5mL后移入鼠尾膠包被的培養(yǎng)瓶中，于(X)2溫箱37°C中培養(yǎng)0. (第一次貼壁)，命名為 PP1，后將培養(yǎng)基連同非貼壁細(xì)胞一同轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶中再在37°C培養(yǎng)0. (第二次貼壁)，命名為PP2，之后將培養(yǎng)基連同未貼壁的細(xì)胞轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)瓶中37°C培養(yǎng)24h(第三次貼壁)，獲得PP3。PP3繼續(xù)培養(yǎng)7 后全量換液。7.骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞鑒定取PP3細(xì)胞，4g/L臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞。用4%多聚甲醛固定，按常規(guī)免疫熒光染色方法鑒定成肌細(xì)胞的純度。一抗主要采用肌衛(wèi)星細(xì)胞特異性標(biāo)志物結(jié)蛋白(desmin) (abeam, Catalog No. abl5200), Cy3 標(biāo)記二抗(Beyotime, Catalog No. :A0516)，并采用 hoechst33258 (Beyotime, Catalog No. :C1017)復(fù)染細(xì)胞核，觀察免疫熒光結(jié)果，流式細(xì)胞儀檢測(cè)衛(wèi)星細(xì)胞純度(以不表達(dá)desmin的小鼠成纖維細(xì)胞系做陰性對(duì)照)。8.骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞培養(yǎng)增殖、分化將步驟6所得的提純后細(xì)胞以含15%胎牛血清的F12/DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞形態(tài)與生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%接觸后傳代，每次傳代均預(yù)貼壁30min，預(yù)貼壁步驟與上述的第一次貼壁相同，之后將培養(yǎng)基連同未貼壁的細(xì)胞轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)瓶中37°C培養(yǎng)完成細(xì)胞貼壁，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)貼壁后，將培養(yǎng)基更換為分化液(配制方法為在DMEM/F12培養(yǎng)基中按體積比100 :2加入馬血清，再按體積比 100 1加入青鏈霉素)進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，觀察分化形成肌管的狀態(tài)。9.結(jié)果改良本方法提取、純化方式中Percoll不等密度梯度離心后見(jiàn)圖1，純化后最終所獲得的細(xì)胞經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，約有95%以上的細(xì)胞不著色，提示該方法所得的細(xì)胞存活率較高。經(jīng)免疫熒光染色后，desmin呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(圖2，3)，流式細(xì)胞儀鑒定其純度為92. 59 士 1. 29% (圖 4)。原代骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞傳代后貼壁速度明顯加快，0. 5h開(kāi)始貼壁，2h內(nèi)90%以上的衛(wèi)星細(xì)胞完成貼壁。骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)潛伏期為l-2d，從第3d起進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，5-6d開(kāi)始進(jìn)入細(xì)胞增殖的平臺(tái)期。進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，隨著細(xì)胞的增殖，形成散在分布的細(xì)胞集落(圖5);細(xì)胞常常拉長(zhǎng)變細(xì)，同時(shí)趨向于平行排列。當(dāng)細(xì)胞匯合超過(guò)60%-70%后， 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞之間出現(xiàn)融合現(xiàn)象，有散在的肌管細(xì)胞形成。至7-8d可見(jiàn)大片肌管細(xì)胞形成，肌管細(xì)胞之間亦可相互融合。培養(yǎng)條件良好時(shí)，倒置相差顯微鏡下可觀察到肌管細(xì)胞自發(fā)性收縮。細(xì)胞貼壁后更換為分化培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的分裂、增殖速度顯著下降，細(xì)胞維持在較低的密度水平。24h后開(kāi)始有少量骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞相互融合，散在的肌管細(xì)胞開(kāi)始形成(圖6)，7 后可見(jiàn)絕大多數(shù)的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞融合，培養(yǎng)皿內(nèi)以肌管細(xì)胞為主。
權(quán)利要求
1.一種高純度小鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的簡(jiǎn)易提取方法，其特征在于，具體步驟為 第一步取5 7周齡C57BL/6小鼠，于小鼠四肢肌注射0. 75%鹽酸布比卡因0. 05 0.15mL ；第二步36 60小時(shí)后，處死小鼠，用75vd%酒精浸泡10 20min，在超凈工作臺(tái)內(nèi)剔出四肢肌肉0. 5 1. 5g，去除血管、脂肪及筋膜，無(wú)菌PBS液沖洗，將肌肉剪成0. 5 1.5mm3小粒，加入PBS液靜置3 7min，離心，棄上清液；第三步加入1 5mL混合消化酶，置于37°C、CO2體積濃度為5%的孵箱中孵化，每隔 10 20min用吸管吹打震蕩3 7min，重復(fù)3次，加入3 7mL含15vol%胎牛血清的F12/ DMEM培養(yǎng)基中止消化，過(guò)濾細(xì)胞懸液，將所得濾液離心，棄上清，細(xì)胞沉淀用生長(zhǎng)培養(yǎng)基重懸至2 4mL待用；第四步以胎牛血清潤(rùn)濕離心管管壁后，依次將60%Percoll分離液2 4mL、 20%Percoll分離液2 4mL、細(xì)胞懸液2 4mL沿管壁注入，離心，用長(zhǎng)頭吸管小心吸出20% Percoll分離液與60% Percoll分離液分界面的細(xì)胞懸液0. 5 1. 5mL，離心，得細(xì)胞沉淀； 第五步細(xì)胞沉淀用生長(zhǎng)培養(yǎng)基重懸后移入鼠尾膠包被的培養(yǎng)瓶中，于CO2溫箱中培養(yǎng) 0.證，命名為PP1，后將培養(yǎng)基連同非貼壁細(xì)胞一同轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶中再培養(yǎng)0.證，命名為PP2，之后將培養(yǎng)基連同未貼壁的細(xì)胞轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)Mh，命名為PP3，將PP3繼續(xù)培養(yǎng)7 后全量換液，得到小鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的高純度小鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的簡(jiǎn)易提取方法，其特征在于，所述的混合消化酶配制方法為將II型膠原酶0. llg, II型dispease酶0. 124g, CaCl2Hmg以及PBS50mL混合。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種高純度小鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的簡(jiǎn)易提取方法,其特征在于,具體步驟為第一步于小鼠四肢肌注射鹽酸布比卡因；第二步處死小鼠，剔出四肢肌肉，去除血管、脂肪及筋膜，將肌肉剪成0.5～1.5mm3小粒；第三步加入混合消化酶孵化，過(guò)濾細(xì)胞懸液，將所得濾液離心，棄上清，細(xì)胞沉淀用生長(zhǎng)培養(yǎng)基重懸；第四步依次將60%Percoll分離液、20%Percoll分離液、細(xì)胞懸液沿管壁注入，用長(zhǎng)頭吸管小心吸出20%Percoll分離液與60%Percoll分離液分界面的細(xì)胞懸液，離心，得細(xì)胞沉淀；第五步將細(xì)胞沉淀培養(yǎng),得到小鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞。本發(fā)明方法簡(jiǎn)易、快速，骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞純化率及產(chǎn)率高，具有較高的增殖及分化能力，可進(jìn)行體外基因修飾或體內(nèi)移植。
文檔編號(hào)C12N5/074GK102424813SQ20111043864
公開(kāi)日2012年4月25日 申請(qǐng)日期2011年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月25日
發(fā)明者徐德民, 朱鎧, 王春生, 賴顥, 過(guò)常發(fā) 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院