專利名稱：人PON2基因多態(tài)性(rs12026)檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及鑒定單核苷酸多態(tài)性的方法。更具體地，本發(fā)明涉及鑒定人P0N2基因多態(tài)性rsl2026的方法。
背景技術：
SNP(單核苷酸多態(tài)性)是指單個核苷酸的改變引起的DNA序列變異，包括單堿基的置換、插入和缺失等形式。SNP現(xiàn)已廣泛用于簡單和復雜疾病的遺傳連鎖分析、關聯(lián)分析及疾病易感基因的定位，指導易感基因克隆。聚合酶鏈式反應-限制性片斷長度多態(tài) (PCR-RFLP)技術是一種快速、簡便、準確、低成本檢測SNP基因型的經(jīng)典方法。該方法原理是限制性內(nèi)切酶是一類識別DNA特異位點(通常4 6bp)，并在特異位點進行切割的酶類。酶切位點的特異性意味著對特定DNA等位基因的完全消化會產(chǎn)生同樣的片段序列。而堿基的替換或插入、缺失可以產(chǎn)生或消除一個特定酶切位點，從而改變酶切割后產(chǎn)生片段的大小和數(shù)目。這些酶切片段帶型的不同稱為限制性片段長度多態(tài)性。如果SNP產(chǎn)生和消除了某個限制性內(nèi)切酶位點，則可以通過對PCR產(chǎn)物進行酶切、電泳加以檢測。該方法主要優(yōu)點在于操作簡便，快速，終點判斷準確。主要缺點在于酶切位點的選擇，并不是所有的SNP 位點都可以使用該方法來鑒別，且部分內(nèi)切酶價格昂貴。對氧磷酶(paraoxonase，PON)是由肝臟合成的一類與高密度脂蛋白結(jié)合的芳香醇。早在1953年就被發(fā)現(xiàn)，因其能水解神經(jīng)毒殺蟲劑對氧磷(paraoxon)而被命名為對氧磷酶。目前發(fā)現(xiàn)哺乳動物對氧磷酶基因家族有3個成員P0N1、P0N2和P0N3，它們具有結(jié)構(gòu)同源性和相似的酶活性。這三個基因具有高度結(jié)構(gòu)同源性，在氨基酸水平和核苷酸的水平上分別有大約65%和70%的同一性。人P0N2基因位于7號染色體，該基因第5外顯子多態(tài)即C/G堿基變異可引起第 148位氨基酸變異(Gly/Ala)，常記為G148A多態(tài)，該多態(tài)可能影響P0N2的功能。美國國立衛(wèi)生研究院國立醫(yī)學圖書館生物信息技術中心(http://www.ncbi.nlm.nih. gov)可查閱 P0N2基因及其多態(tài)序列和相關信息，該多態(tài)在SNP數(shù)據(jù)庫中編號為rsl2026。因此，通常該多態(tài)在人群中存在三種P0N2基因的基因型GG型(人體基因組rsl2(^6多態(tài)位點的兩個等位基因堿基均為G)，CG型(人體基因組rsl2026多態(tài)位點的兩個等位基因堿基分別為C 和G)和CC型(人體基因組rsl2(^6多態(tài)位點的兩個等位基因堿基均為C)。目前人P0N2基因多態(tài)rsl2026的鑒定常采用PCR-RFLP方法。目前鑒定人P0N2 基因多態(tài)rsl2(^6時常使用內(nèi)切酶i^nU4H I進行鑒定，，該內(nèi)切酶的價格昂貴(關于部分內(nèi)切酶的參考價格可以參考后面的表1)，影響了實驗的費用，難以在實驗室中普及使用。并且由于傳統(tǒng)PCR-RFLP方法的固有缺陷，本領域技術人員通常難以選擇其他限制性內(nèi)切酶對人P0N2基因多態(tài)rsl2(^6進行鑒定。
3
因此，本領域存在對操作簡」 求。
i，成本低，使用范圍廣的新型檢測SNP的方法的需

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種操作簡單，成本低，使用范圍廣的鑒定人P0N2基因多態(tài)性 rsl2026的方法，其包括以下步驟a)提供待測人基因組DNA ；b)使用擴增人P0N2基因多態(tài)性rsl2(^6位點附近序列的正向引物和反向引物，以所述待測人基因組DNA為模板，進行PCR擴增反應，獲得擴增產(chǎn)物；c)使用限制性內(nèi)切酶對所述擴增產(chǎn)物進行酶切，獲得酶切產(chǎn)物；以及d)對所述酶切產(chǎn)物進行電泳，以鑒定人P0N2基因多態(tài)性rsl2026，其中，所述反向引物3’末端與多態(tài)位點相鄰，反向引物中與多態(tài)位點下游第四個堿基A相配的堿基由原始序列中的T更改為錯配后的堿基G，以便在擴增產(chǎn)物中與多態(tài)G等位基因形成GAGAC結(jié)構(gòu)， 錯配后原序列CAGAA或GAGAA更改為CAGAC或GAGAC (其中第一個堿基為rsl2(^6多態(tài)，第五個堿基為引物中錯配堿基G所配對的堿基C)，其中當多態(tài)等位基因為G時形成GAGAC序列(與GTCTC互補)可被識別該序列的內(nèi)切酶BsmAI或Alw26I識別，進而，可以根據(jù)片段切開情況來判斷多態(tài)基因型，更具體地，經(jīng)序列分析和文獻查閱可知，原有檢測該C/G多態(tài)的方法可使用表1中前四種內(nèi)切酶，如通過堿基錯配PCR將多態(tài)位點后面第四位堿基A替換為C，則該多態(tài)可由BsmAI內(nèi)切酶及其同裂酶(isoschizomer，來源于不同物種但能識別相同DNA序列的限制性內(nèi)切酶)識別，即G等位基因可被BsmAI內(nèi)切酶及其同裂酶識別并切開，而C等位基因不能切開。下表1中提供了 NEB公司內(nèi)切酶價格信息(從http://WWW. neb-china, com獲取) 作為限制性內(nèi)切酶識別位點和價格的參考。表INEB公司幾種內(nèi)切酶識別序列及其價格
內(nèi)切酶識別序列價格HpyAVccttcn6a3,339 元/500uFnu4HIgcangc2,789 元/1000 uApeKIgacwgc1250 元/1000 uTseIgacwgc3079 元/3 75 uBsmAIGTCTCNa679 元/1000 u 在本發(fā)明的一個實施方案中，正向引物由選自下列的核苷酸序列構(gòu)成SEQ ID NO :1 (AGGTCCCGTAGTTATGTCTTGT)、SEQ NO 7 (TGCCCAGAGGTCCCGTAG)禾口 SEQ NO: 12 (GTCCCGTAGTTATGTCTTGTAAA)，在本發(fā)明的另一個實施方案中，反向引物由選自下列的核苷酸序列構(gòu)成SEQ ID NO 2 (TCAGATGCAACAGAGAATTGTCT)、SEQ ID NO 8 (TTCAGATGCAACAGAGAATTGTCT)和 SEQ NO 13 (CAGATGCAACAGAGAATTGTCT)，正向和反向引物的設計主要考慮引物對PCR擴增的靈敏度、特異度和擴增效率的影響。通常按照堿基互補配對原則設計引物，引物與模板的序列要緊密互補。長度為15-30bp，過短或過長可導致特異性差，過長亦會導致其延伸溫度大于74°C而不利于PCR反應。反向引物的確定必須除了上述原則外其3’端必須含有與多態(tài)位點下游第四個堿基A相配對的錯配堿基G，以便在擴增產(chǎn)物中與多態(tài)G等位基因形成GAGAC結(jié)構(gòu)，利于BsmAI內(nèi)切酶及其同裂酶進行酶切鑒定。擴增產(chǎn)物的長度主要是由正向引物所決定的(因為反向引物位于多態(tài)位點下游附近， 其位置大致已確定)，通常擴增產(chǎn)物長度為100-200bp之間，這樣即利于PCR產(chǎn)物擴增，又利于后續(xù)的酶切鑒定。否則，如果產(chǎn)物過短則不利于擴增，過長則酶切后片段長度差異較小， 不利于分辨。例如，在本發(fā)明的一個實施方案中，利用SEQ ID NO :1的核苷酸序列作為正向引物以及SEQ ID NO :2的核苷酸序列作為反向引物的PCR反應可以獲得如下擴增產(chǎn)物aRRtcccRta RttatRtctt Rtaaattaac tctgttcttt caattcttta gatgacacag 60tttatctctt tgttgtaaac cacccagaat tcaagaatac agtggaaatt tttaaatttg 120a a g a a g s a r a caattctctR ttRcatctRa 150(SEQ ID NO :4)擴增后產(chǎn)物序列中下劃線部分分別為正向、反向引物所對應的序列，127bp處s代表C/G多態(tài)即SNP位點rsl2026。該擴增產(chǎn)物長度為150bp JSBsmAI酶切后可出現(xiàn)150bp、 121bpJ9bp三種片斷(其中^bp在電泳圖中不能看到)。酶切后基因型判斷GG型為 121bp, CG型有121bp和150bp兩種片段，CC型為150bp。對于酶切產(chǎn)物的鑒定，通常使用瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳，基于成本和便利性考慮，使用瓊脂糖凝膠電泳更為常見。在本發(fā)明中，對于上述150bp的擴增產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳的條件是將酶切產(chǎn)物在2. 5% -4%瓊脂糖凝膠中3-8V/cm條件下，電泳 40-80分鐘，于紫外燈下拍照鑒定。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，所述限制性內(nèi)切酶選自BsmAI、Alw26I以及它們的同裂酶，更優(yōu)選所述限制性內(nèi)切酶為BsmAI、AlW26I。這主要是基于成本和切割效率的綜合考慮。在本發(fā)明中，PCR擴增反應的條件并不受到特別的限制，只要能夠獲得擴增產(chǎn)物即可。PCR的主要參數(shù)-退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶序列的長度。如果PCR退火溫度過低則易出現(xiàn)非特異產(chǎn)物，過高則影響擴增產(chǎn)物產(chǎn)量，最終需要憑實驗確定。PCR延伸時間根據(jù)產(chǎn)物長度確定，通常20s-60s即可。為了能夠提高PCR擴增效率，進而進一步提高鑒定效率，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所采用的PCR擴增條件是95度預變性3分鐘后；進行30個如下循環(huán)擴增95度變性30秒，56度退火30秒， 72度延伸30秒；30個循環(huán)結(jié)束后72度延伸5min ；對于待測DNA的選擇，本發(fā)明并沒有特別的限制。既可以是從人體的體液或者組織獲得基因組DNA，還可以是經(jīng)過預先降解處理的基因組。為了方便實施，通常優(yōu)選從血液提取的基因組DNA。其中所述的組織包括人體中含有全部或至少P0N2基因的組織，而與是否表達該P0N2基因無關。從體液和/或組織中提取DNA的方法是本領域技術人員公知的， 并且可以參考常用的分子生物學手冊，例如《分子克隆》第2版進行。另外，在本發(fā)明還提供了用于鑒定人P0N2基因多態(tài)性rsl2(^6的試劑盒，其包含擴增人P0N2基因多態(tài)性rsl2026正向引物和反向引物，反向引物3’末端與多態(tài)位點相鄰， 反向引物中與多態(tài)位點下游第四個堿基A相配的堿基由原始序列中的T更改為錯配后的堿基G，錯配后原序列CAGAA或GAGAA更改為CAGAC或GAGAC (其中第一個堿基為rsl2(^6 多態(tài)，第五個堿基為引物中錯配堿基G所配對的堿基C)，其中當多態(tài)等位基因為G時形成 GAGAC序列(與GTCTC互補)可被識別該序列的內(nèi)切酶BsmAI或Alw26I識別。如前所述， 該試劑盒操作簡單，成本低，使用范圍廣。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述試劑盒中還包括BsmAI、Alw26I等限制性內(nèi)切酶以及它們的同裂酶，這樣可以方便對擴增產(chǎn)物的檢測。進一步，優(yōu)選所述限制性內(nèi)切酶是BsmAI、AlW26I。這主要是基于限制性內(nèi)切酶的成本和切割效率的綜合考慮。當然，本領域技術人員可以理解，在試劑盒中還可以包括其他成分，例如用于實施鑒定的說明書等。
四

圖1描述了實施例1中人P0N2基因(rsl2(^6)多態(tài)PCR產(chǎn)物經(jīng)BsmAI酶切后電泳照片。其中M是DNA分子量標志物；泳道1 :CC型樣品的電泳結(jié)果；泳道2和3 =CG型的電泳結(jié)果；泳道4 =GG型樣品的電泳結(jié)果。
五具體實施例方式下面通過本發(fā)明的具體實施方式
對本發(fā)明的技術方案進行詳細描述。其中，需要說明的是，本發(fā)明并不以任何方式受限于下面所述的具體實施方式
和實施例。下面利用SEQ ID NO=I的核苷酸序列作為正向引物以及SEQ ID NO 2的核苷酸序列作為反向引物作為例子，對本發(fā)明的概念進行詳細地描述。在本發(fā)明一個實施方案中，本發(fā)明檢測人P0N2基因多態(tài)rsl2026的方法，步驟是(一 )、提取待測人基因組DNA為模板，所述人基因組DNA模板為人體任何部分取得的人基因組DNA ；(二)、PCR擴增基因組DNA，對提取的模板基因組DNA進行PCR擴增，獲得含多態(tài)附近序列的PCR產(chǎn)物(三)、對PCR擴增產(chǎn)物使用限制性內(nèi)切酶進行酶切反應，得酶切產(chǎn)物；以及(四)、對酶切后的產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定人P0N2基因多態(tài)rsl2026。下面對各個主要步驟進行詳細描述(1)引物設計與合成在美國國立衛(wèi)生研究院國立醫(yī)學圖書館生物信息技術中心http://www.ncbi. nlm. nih. gov網(wǎng)站查找P0N2基因序列和SNP信息，確定P0N2多態(tài)位點堿基變異數(shù)據(jù)；含P0N2多態(tài)rsl2(^6的部分基因序列(601bp)(SEQ ID NO 3)gaattctgta tatggagtag gaaacacttt cttaaaggtc agggagccaa tgatcagaaa 60taacaccaga cggacagcaa taggaaagac agagaatgat ctgttaggtc gtctaacagc 120ttatacattc aacctttcct tgcctgtggt atttaaatgt cagtgcctgc ccagaggtcc 180
6
cgtagttatg tcttgtaaat taactctgtt ctttcaattc tttagatgac acagtttatc 240tctttgttgt aaaccaccca gaattcaaga atacagtgga aatttttaaa tttgaagaag 300sagaaaattc tctgttgcat ctgaaaacag tcaaacatga gcttcttcca aggtacttcc 360tcattttgtt ccttctctaa tttatcccca gcatttgcaa acaatcccta tggtgggttg 420tcctgtcatc ttttataagc gctaatgtat atattagcta atatgtaaga gctaaagagc 480ttatatttcc ttatttataa atgtgtgtgt atagtttcct tataaaccag ggcaagcatg 540gcatatgaaa gttgatgtca ctcatactat tcactgttct atgcggactc ctttgagaaa 600t601基因序列中301bp處s代表C/G多態(tài)即SNP位點rsl2(^6 ；根據(jù)上述序列設計引入錯配堿基的引物，根據(jù)序列情況確定正向和反向引物的位置與長度，具體如下正向引物5，AGGTCCCGTAGTTATGTCTTGT 3，(SEQ ID NO 1),反向引物5，TCAGATGCAACAGAGAATTGTCT 3，(SEQ ID NO 2)；下游引物中下劃線G堿基為錯配堿基用來創(chuàng)造酶切位點，錯配后PCR產(chǎn)物中多態(tài)附近序列由CAGAA或GAGAA (其中第一個堿基為C/G多態(tài))更改為CAGAC或GAGAC，而BsmAI 識別GAGAC序列(與GTCTC序列互補)即多態(tài)為G等位基因時可切開，根據(jù)片段切開情況判斷多態(tài)基因型；按照正向引物序列和反向引物序列合成引物，合成所述引物可以使用本領域中公知的方法，例如固相合成法，也可以委托生物工程公司合成并檢測正向和反向引物。將合成的正向、反向引物稀釋為ΙΟμπιοΙ/L濃度備用；(2)制備PCR擴增產(chǎn)物PCR擴增使用15-100 μ 1的反應體系為2XPCR MIX用量為PCR擴增反應體系體積的一半即7. 5-50μ l、50-2000ng所述待檢測人基因組DNA和10 μ mol/L正向、反向引物各0. 1-10 μ 1，用滅菌雙蒸水補充至15-100 μ 1，混勻，即得PCR擴增反應體系；其中，所述的2XPCR MIX是2倍濃度的PCR反應用的混合液制成；將PCR擴增反應體系在94-95 V預變性3_5分鐘后；進行30_35個如下循環(huán) 94-95°C變性 20-60s，50-65°C退火 20_60s，72°C延伸 20_60s ；30-35 個循環(huán)結(jié)束后 72°C延伸5-lOmin，即得PCR擴增產(chǎn)物，其位置相對應含P0N2多態(tài)rsl2026的部分基因序列(SEQ ID NO 3)中堿基 175bp-324bp 處；擴增后序列(其位置相對應含P0N2多態(tài)rsl2(^6的部分基因序列中堿基175-3M 處，共 150bp)為(SEQ ID NO 4)aggtcccgta gttatgtctt gtaaattaac tctgttcttt caattcttta gatgacacag 60tttatctctt tgttgtaaac cacccagaat tcaagaatac agtggaaatt tttaaatttg 120aagaagsaga caattctctg ttgcatctga150150bp序列擴增后產(chǎn)物序列中下劃線部分為正向、反向引物所對應的序列，127bp 處s代表C/G多態(tài)即SNP位點rsl2026。(3)酶切反應將PCR擴增產(chǎn)物在10-30 μ 1酶切體系中進行酶切反應，所述的10_30 μ 1酶切體系為:2-15 μ 1的PCR擴增產(chǎn)物、識別GAGAC序列(與GTCTC序列互補)的限制性內(nèi)切酶1-10U和IOX酶切緩沖液占總體積的1/10，滅菌雙蒸水補充至10-30 μ 1，混勻，得酶切體系，將酶切體系于37°C水浴4-16小時，即得酶切產(chǎn)物；所述識別GAGAC序列(與GTCTC序列互補)的限制性內(nèi)切酶為BsmAI、Alw26I及其同裂酶；該多態(tài)位點含有G等位基因時PCR產(chǎn)物酶切后可形成切開片段121bp (該片段下游序列因酶切形成粘性末端而比上游序列增加4個堿基)序列(SEQ ID NO 5)aRRtcccRta RttatRtctt Rtaaattaac tctgttcttt caattcttta gatgacacag 60tttatctctt tgttgtaaac cacccagaat tcaagaatac agtggaaatt tttaaatttg 120a121酶切后切開片段121bp序列中下劃線部分為正向引物所對應的序列；該多態(tài)位點含有G等位基因時PCR產(chǎn)物酶切后可形成切開片段^bp (該片段下游序列因酶切形成粘性末端而比上游序列減少4個堿基)序列(SEQ ID NO 6)agaagsagac aattctctgt tgcatctga296bp處s代表C/G多態(tài)即SNP位點rsl2026 ；(2)瓊脂糖凝膠電泳，確定基因多態(tài)性將酶切產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠中3-8V/cm條件下，電泳40_80分鐘，于紫外燈下拍照鑒定，其中，對于不同的基因型，P0N2位點擴增后出現(xiàn)150bp片斷，經(jīng)酶切、電泳出現(xiàn) 150bp、121bpJ9bp三種片斷，基因型判斷依據(jù)150bp和121bp片段的有無判斷GG型為 121bp，CG型有150bp和121bp兩種片段，CC型為150bp ；經(jīng)測序鑒定，測序結(jié)果和使用現(xiàn)有技術檢測所得的結(jié)果完全相同。下面是實施本發(fā)明的若干實施例。實施例11材料與方法1. 1主要試劑及儀器試劑:2XPCR mix (MBI公司)，限制性內(nèi)切酶BsmAI (NEB公司)，瓊脂糖(BBI公司)，引物由上海Sangon公司合成。儀器9600型 PCR 儀(PE 公司)，微型電泳槽(Pharmacia Biotech, EPS1000), Gel Doc 2000凝膠成像儀(Bio-RAD公司)。PCR產(chǎn)物測序由上海生工生物工程有限公司完成。1. 2序列查找及引物設計在NCBI網(wǎng)站查找P0N2基因序列和SNP信息，結(jié)合有關文獻確定P0N2多態(tài)位點堿基變異信息，設計引物，具體如下正向引物5，AGGTCCCGTAGTTATGTCTTGT 3，(SEQ ID NO 1),反向引物5，TCAGATGCAACAGAGAATTGTCT 3，(SEQ ID NO 2)；1. 3從全血標本提取DNA作為待測DNAEDTA抗凝管采集人外周血全血血樣300 μ 1，使用TIANGEN公司RelaxGene Blood DNA System血液基因組DNA提取系統(tǒng)(主要成分為細胞裂解液CL、蛋白酶K、緩沖液TO、洗脫緩沖液TB)提取全血基因組DNA為待測人基因組DNA模板300 μ 1外周血轉(zhuǎn)移至離心管，加入750 μ 1細胞裂解液CL，顛倒混勻5次；
10, 000r/min離心20秒，倒棄上清液；在離心管中加入150μ 1的緩沖液混合液，緩沖液混合液是由緩沖液TO與蛋白酶 K以體積比100 1混合制成，渦旋混勻器混勻至溶液無團塊；然后，在65°C水浴lOmin，其間顛倒混勻5次；加入質(zhì)量濃度為99. 9%的異丙醇150μ 1，顛倒充分混勻至出現(xiàn)絲狀或簇狀基因組 DNA ；10, 000r/min離心3分鐘，倒棄上清液，將離心管倒置在干凈的吸水紙上，確保DNA
沉淀物在管中；加入質(zhì)量濃度為70%乙醇150 μ 1，渦旋振蕩5秒鐘，10，000r/min離心3分鐘，倒棄上清液后，再加入質(zhì)量濃度為70%乙醇150 μ 1，渦旋振蕩5秒鐘，10，000r/min離心3分
鐘，倒棄上清液；將離心管倒置在干凈的吸水紙上停留5分鐘，確保DNA沉淀物在管中；將離心管在室溫下靜置，干燥至所有的液體揮發(fā)干凈(至少5分鐘)；再加入200 μ 1洗脫緩沖液ΤΒ，渦旋振蕩5秒，65°C加熱10分鐘至1小時，加熱時， 輕彈數(shù)次助溶，即得全血基因組DNA。1. 4PCR擴增及酶切鑒定人基因組DNAlOOng (制備方法如上所述)，每個引物0. 2 μ mol/L, IXPCRmix,滅菌雙蒸水補足25 μ 1反應體系。PCR反應條件為首先94°C預變性5min，然后94°C變性30s，根據(jù)引物Tm值取56°C退火20s，72°C延伸20s，共30個循環(huán)后72°C延伸IOmin。PCR擴增后， 取PCR產(chǎn)物10 μ 1，加入5U內(nèi)切酶和2 μ 1 IOX酶切緩沖液和滅菌雙蒸水組成20 μ 1反應體系，37°C水浴中酶切他后，電泳后于凝膠成像儀觀察成像，結(jié)果示于圖1中。2 結(jié)果2. 1酶切結(jié)果上述酶切產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠8V/cm條件下，電泳40分鐘，于紫外燈下拍照鑒定，其中，P0N2位點擴增后出現(xiàn)150bp片斷(以上游序列為準，以下同)JSBsmAI酶切后電泳會出現(xiàn)150bp、121bp (下游序列相比上游序列由于MspI酶切產(chǎn)生粘性末端增加四個單鏈堿基)、29bp(下游序列相比上游序列由于MspI酶切產(chǎn)生粘性末端減少四個單鏈堿基)三種片斷(其中^bp電泳圖中不能看到)。如圖1所示。酶切后基因型判斷GG為121bp —個片段，CG有121bp和150bp兩種片段，CC為150bp —個片段。2. 2P0N2基因多態(tài)結(jié)果鑒定檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)P0N2出現(xiàn)GG型、CG型和CC型三種基因型。另外，對P0N2多態(tài)各類型PCR產(chǎn)物進行測序鑒定，測序結(jié)果與預期結(jié)果完全一致。實施例2外周血全血標本測定人P0N2基因rsl2(^6多態(tài)與實施例1的步驟基本相同，PCR反應所采用的正向引物是SEQ ID N0:7，反向引物是SEQ ID N0:8，退火溫度為57°C，并且所采用的限制性內(nèi)切酶是Alw26I(MBI公司)；正向引物5'TGCCCAGAGGTCCCGTAG 3' (SEQ ID NO 7)反向引物5‘ TTCAGATGCAACAGAGAATTGTCT 3 ‘ (SEQ ID NO 8)結(jié)果
擴增后序列(其位置相對應含P0N2多態(tài)rsl2(^6的部分基因序列中堿基168-325 處，共158bp)，所獲得的擴增產(chǎn)物序列如下(SEQ ID NO 9)tgcccagagg tcccgtagtt atgtcttgta aattaactct gttctttcaa ttctttagat 60gacacagttt atctctttgt tgtaaaccac ccagaattca agaatacagt ggaaattttt 120aaatttgaag aagsagacaa ttctctgttg catctgaa158擴增后產(chǎn)物序列中下劃線部分為正向、反向引物所對應的序列，s代表C/G多態(tài)即 SNP 位點 rs 12(^6。酶切后的產(chǎn)物序列分別如下該多態(tài)位點含有G等位基因時PCR產(chǎn)物酶切后可形成切開片段U8bp (該片段下游序列因酶切形成粘性末端而比上游序列增加4個堿基)序列(SEQ ID NO 10)tRcccaRaRR tcccRtaRtt atgtcttgta aattaactct gttctttcaa ttctttagat 60gacacagttt atctctttgt tgtaaaccac ccagaattca agaatacagt ggaaattttt 120aaatttga128該多態(tài)位點含有G等位基因時PCR產(chǎn)物酶切后可形成切開片段30bp (該片段下游序列因酶切形成粘性末端而比上游序列減少4個堿基)序列(SEQ ID NO=Il)agaagsagac aattctctgt tgcatctgaa30上述酶切產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠6V/cm條件下，電泳50分鐘，于紫外燈下拍照鑒定，其中，P0N2位點擴增后出現(xiàn)158bp片斷，經(jīng)酶切、電泳出現(xiàn)158bp、128bp、30bp三種片斷， 基因型判斷依據(jù)158bp和128bp片段的有無判斷=GG型為128bp, CG型有158bp和128bp 兩種片段，CC型為158bp。實施例3外周血血凝塊標本測定測定人P0N2基因rsl2(^6多態(tài)與實施例1的步驟基本相同，只是采用下面的方法從外周血血凝塊標本提取DNA 作為待測DNA。另外，PCR反應所采用的正向引物是SEQ NO :12，反向引物是SEQ N0:13，退火溫度是56 °C。正向引物5‘GTCCCGTAGTTATGTCTTGTAAA 3' (SEQ NO 12)反向引物5‘CAGATGCAACAGAGAATTGTCT 3' (SEQ NO 13)提取DNA:普通采血管采集人外周血400 μ 1，使用TIANGEN公司RelaxGene Blood DNA System血液基因組DNA提取系統(tǒng)提取外周血血凝塊中基因組DNA為待測人基因組DNA模板；待采血管內(nèi)血清析出后分離血清，然后按下列步驟進行將上述采血管中凝血塊研磨為勻漿狀后置于離心管中，加入750μ 1細胞裂解液 CL，顛倒混勻5次；10, 000r/min離心20秒，倒棄上清液；加入150μ 1緩沖液混合液，緩沖液混合液是由緩沖液re與蛋白酶K以體積比 100 1混合制成，渦旋混勻器混勻至溶液無團塊；然后，在65°C水浴lOmin，其間顛倒混勻6次；加入質(zhì)量濃度為99. 9%的異丙醇150μ 1，顛倒充分混勻至出現(xiàn)絲狀或簇狀基因組 DNA ；
10，000r/min離心3分鐘，倒棄上清液，將離心管倒置在干凈的吸水紙上，確保DNA
沉淀物在管中；加入質(zhì)量濃度為70%的乙醇150 μ 1，渦旋振蕩5秒鐘，10，000r/min離心3分鐘， 倒棄上清液后，再加入質(zhì)量濃度為70%的乙醇150 μ 1，渦旋振蕩5秒鐘，10，000r/min離心 3分鐘，倒棄上清液；將離心管倒置在干凈的吸水紙上停留至少5分鐘，確保DNA沉淀物在管中；將離心管在室溫下靜置，干燥至所有的液體揮發(fā)干凈(至少5分鐘)；加入200 μ 1洗脫緩沖液TB,渦旋振蕩5秒，65°C加熱10分鐘至1小時，加熱時，輕彈數(shù)次助溶，即得外周血血凝塊中基因組DNA。結(jié)果擴增后序列(其位置相對應含P0N2多態(tài)rsl2(^6的部分基因序列中堿基177-323 處，共147bp)，所獲得的擴增產(chǎn)物序列如下(SEQ ID NO 14)gtcccgtagt tatgtcttgt aaattaactc tgttctttca attctttaga tgacacagtt 60tatctctttg ttgtaaacca cccagaattc aagaatacag tggaaatttt taaatttgaa 120gaagsagaca attctctgtt gcatctg147擴增后產(chǎn)物序列中下劃線部分為正向、反向引物所對應的序列，s代表C/G多態(tài)即 SNP 位點 rs 12(^6。酶切后的產(chǎn)物序列分別如下該多態(tài)位點含有G等位基因時PCR產(chǎn)物酶切后可形成切開片段119bp (該片段下游序列因酶切形成粘性末端而比上游序列增加4個堿基)序列(SEQ ID NO 15)RtcccRtaRt tatRtcttRt aaattaactc tgttctttca attctttaga tgacacagtt 60tatctctttg ttgtaaacca cccagaattc aagaatacag tggaaatttt taaatttga 119該多態(tài)位點含有G等位基因時PCR產(chǎn)物酶切后可形成切開片段^bp (該片段下游序列因酶切形成粘性末端而比上游序列減少4個堿基)序列(SEQ ID NO 16)aRaaRsaRac aattctctet tecatcte28上述酶切產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠5V/cm條件下，電泳60分鐘，于紫外燈下拍照鑒定，其中，P0N2位點擴增后出現(xiàn)147bp片斷，經(jīng)酶切、電泳出現(xiàn)147bp、119bp、28bp三種片斷， 基因型判斷依據(jù)147bp和119bp片段的有無判斷=GG型為119bp，CG型有147bp和119bp 兩種片段，CC型為147bp。實施例4人肺組織標本測定人P0N2基因rsl2(^6多態(tài)與實施例1的步驟基本相同，只是采用下面的方法從肺組織標本提取DNA作為待測 DNA。使用手術切除肺組織，酚-氯仿法提取肺組織基因組DNA為待測人基因組DNA模板將肺組織塊解凍，用生理鹽水洗去血污，剪取0. lg，玻璃勻漿器研磨碎肺組織后放入1. 5ml的第一個離心管中；在第一個離心管中加入Iml DNA 提取緩沖液(lOmmol/Ltris 'Cl2,0. lmol/LEDTA, 20 μ g/ml胰RNA酶，0. 5 %的十二烷基硫酸鈉)混勻，再加入50 μ 1質(zhì)量濃度為10 %的十二烷基硫酸鈉，濃度為20mg/ml的蛋白酶K5. 0 μ 1，充分混勻后，于56°C保溫5h，每池搖1次；
放置到室溫，加入飽和酚500 μ 1，顛倒混勻，10000r/min離心lOmin，分離水相和
有機相，吸取上層含核酸的水相置于1. 5ml的第二個離心管中；在第二個離心管中加入與管內(nèi)的含核酸的水相等體積的酚氯仿異戊醇的混合液，其中，酚氯仿異戊醇的混合液是由酚氯仿異戊醇以體積比25 24 1混合制成，顛倒混勻，10000r/min離心10分鐘，取上層液體轉(zhuǎn)移到1. 5ml第三個離心管中；第三個離心管中，加入與管內(nèi)液體等體積的氯仿異戊醇以體積比M 1混合制成的混合液，顛倒混勻，10000r/min離心10分鐘，取上層清液到1. 5ml第四個離心管中；在第四個離心管中加入管內(nèi)清液2. 5倍體積的-20°C預冷的無水乙醇，沉淀DNA， 得DNA沉淀物；將DNA沉淀物，12000r/min離心10分鐘，棄乙醇；再加入_20°C的質(zhì)量濃度為75%的乙醇洗滌，10000r/min離心5分鐘，去乙醇，在 55 °C下干燥，得干燥的DNA沉淀物；加入100 μ 1滅菌雙蒸水溶解干燥的DNA沉淀物，_20°C保存，即得肺組織基因組 DNA，備用。結(jié)果所得酶切產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠4V/cm條件下，電泳70分鐘，于紫外燈下拍照鑒定，其中，P0N2位點擴增后出現(xiàn)150bp片斷，經(jīng)酶切、電泳出現(xiàn)150bp、12 Ibp、^bp三種片斷， 基因型判斷依據(jù)150bp和121bp片段的有無判斷GG型為121bp，CG型有150bp和121bp 兩種片段，CC型為150bp。經(jīng)測序鑒定，測序結(jié)果和使用現(xiàn)有技術檢測所得的結(jié)果完全相同。從上述實施例可以看出，本發(fā)明針對使用PCR-RFLP鑒定P0N2多態(tài)rsl2026的缺點，即使用識別原多態(tài)附近序列的內(nèi)切酶，內(nèi)切酶選擇余地小，價格昂貴等因素。本發(fā)明通過設計包含酶切位點的錯配引物來克服該缺點。該方法可認為是PCR-RFLP的特殊應用，其原理是根據(jù)單堿基突變位點的堿基替代情況設計PCR引物，其中一條引物根據(jù)突變位點鄰近序列設計，人為引入錯配堿基，使得引物3'端和單堿基突變的一種突變型在PCR擴增后形成一個酶切位點，其PCR產(chǎn)物可用類似PCR-RFLP的方法進行分析。由于這種方法應用了引物3'端錯配技術，PCR產(chǎn)物進行酶切電泳后即可進行基因型的鑒定工作，因此在實際運用中具有很大的靈活性，且檢測方法簡單易行，成本低，酶切結(jié)果易分辨，是一種進行基因型鑒定的較好方法。本發(fā)明通過改進實驗方法，重新設計新的引物擴增該多態(tài)序列，使擴增產(chǎn)物中該基因多態(tài)附近序列改變，能夠應用其他內(nèi)切酶進行鑒定，從而可以選擇更為廉價的內(nèi)切酶完成檢測。
權(quán)利要求
1. 一種用于鑒定人P0N2基因多態(tài)性rsl2026的試劑盒，其特征在于，包含擴增人P0N2 基因多態(tài)性rsl2(^6位點附近序列的正向引物和反向引物以及限制性內(nèi)切酶，所述正向引物如SEQ ID NO :7所示，所述反向引物如SEQ ID NO :8所示，所述限制性內(nèi)切酶是Alw26I。
全文摘要
人PON2基因多態(tài)性(rs12026)檢測試劑盒，包含擴增人PON2基因多態(tài)性rs12026位點附近序列的正向引物和反向引物以及限制性內(nèi)切酶，所述正向引物如SEQ ID NO7所示，所述反向引物如SEQ ID NO8所示，所述限制性內(nèi)切酶是Alw26I。本發(fā)明操作簡單，成本低，使用范圍廣。
文檔編號C12Q1/68GK102433386SQ20111043867
公開日2012年5月2日 申請日期2009年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月24日
發(fā)明者姚武, 楊永利, 王威 申請人:鄭州大學