專利名稱：利用宮內(nèi)膜干細(xì)胞誘導(dǎo)分化功能心肌細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用宮內(nèi)膜干細(xì)胞誘導(dǎo)分化功能心肌細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
目前充血性心力衰竭發(fā)病率逐年升高，全球有1500萬(wàn)患者，每年新發(fā)病例為46. 5 萬(wàn)，為65歲以上人群首要住院原因，也是心血管死亡的最主要原因。以干細(xì)胞為種子資源的細(xì)胞移植療法可促進(jìn)梗死局部血管新生和心肌再生，進(jìn)而改善心肌梗死后心功能，已成為目前心血管領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。然而可供移植的胚胎心肌細(xì)胞增殖能力有限、取材不便， 骨骼肌成肌細(xì)胞又不能與心肌細(xì)胞形成縫隙連接且會(huì)致心律失常，致使該治療手段止步不前。因此以干細(xì)胞為種子資源的細(xì)胞治療成為損傷組織修復(fù)和替代的重要手段。其中，人胚胎干細(xì)胞受到其自身一些因素的限制，如致瘤性、免疫原性和倫理問(wèn)題等，尚不能作為理想的移植細(xì)胞源。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell, MSC)是具多分化方向能力的成體干細(xì)胞，因其進(jìn)行自體移植無(wú)排異及來(lái)源的限制，是理想的移植細(xì)胞源。其中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是目前主要的干細(xì)胞來(lái)源。盡管其倫理問(wèn)題與胚胎干細(xì)胞相比大為減少，但骨髓細(xì)胞必須通過(guò)侵入的途徑獲得，而且隨著年齡的增長(zhǎng)，干細(xì)胞數(shù)量顯著減少。因采集方式及自身含量的限制，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在臨床應(yīng)用上面臨著難以突破的瓶頸。骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞主要存在以下問(wèn)題1.分化為心肌細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞等功能細(xì)胞的潛能不夠；2.移植后大部分細(xì)胞死亡；3.移植療效不理想；4.細(xì)胞數(shù)量限制。子宮內(nèi)膜細(xì)胞系具有很強(qiáng)的自我更新能力。在每個(gè)月經(jīng)周期都會(huì)有組織和血管的大量增長(zhǎng)，這一增長(zhǎng)過(guò)程會(huì)隨著月經(jīng)周期的結(jié)束而停止。美日中等多國(guó)科學(xué)家的最新研究顯示在隨女性經(jīng)血脫落的子宮內(nèi)膜組織中，具有相當(dāng)數(shù)量的間充質(zhì)干細(xì)胞(基質(zhì)干細(xì)胞)_宮內(nèi)膜干細(xì)胞，數(shù)量為骨髓來(lái)源的30倍；這些干細(xì)胞活力更強(qiáng)，更強(qiáng)的自我更新和增殖能力，分化潛能更接近胚胎干細(xì)胞。有研究發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)膜干細(xì)胞不僅具有幾乎每M小時(shí)復(fù)制一次的驚人速率，而且它們產(chǎn)生獨(dú)特生長(zhǎng)因子的速率，比來(lái)自于臍帶血的干細(xì)胞要大上 10萬(wàn)倍。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種利用宮內(nèi)膜干細(xì)胞誘導(dǎo)分化功能心肌細(xì)胞的方法，所得的功能心肌細(xì)胞能用于治療心肌梗死。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種利用子宮內(nèi)膜干細(xì)胞誘導(dǎo)分化功能心肌細(xì)胞的方法，包括以下步驟1)、宮內(nèi)膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和擴(kuò)增
將經(jīng)血經(jīng)含抗生素的殺菌液的殺菌處理后，離心，去上清液；然后加入Chang氏通用培養(yǎng)基置于4 6% CO2,94 96%飽和濕度的36 38°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)5 7天后換液去除未貼壁細(xì)胞；一旦細(xì)胞生長(zhǎng)至75 85%匯合度時(shí)，即采用胰酶消化傳代；一般，可每隔2 4換液一次，每3 4天傳代細(xì)胞一次；2)、體外誘導(dǎo)分化將上述步驟1)所得的第4 6代生長(zhǎng)狀況良好的細(xì)胞以胰酶消化，當(dāng)顯微鏡下見(jiàn)細(xì)胞變?yōu)閱蝹€(gè)圓形時(shí)即以含體積濃度為13 17%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，離心， 所得的細(xì)胞沉淀用PBS清洗；在上述PBS清洗后的細(xì)胞中加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基置于4 6% CO2、94 96%飽和濕度的36 38°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每IX IO5個(gè)的細(xì)胞中加入0. 8 1. 2ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為在無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中含有1 10 μ M的5-氮胞苷；培養(yǎng)時(shí)間為68 76小時(shí)，得功能性心肌細(xì)胞。作為本發(fā)明的利用子宮內(nèi)膜干細(xì)胞誘導(dǎo)分化功能心肌細(xì)胞的方法的改進(jìn)步驟 1)依次為①、經(jīng)血收集在采集管內(nèi)設(shè)置20ml的Hank' s平衡鹽溶液(HBSS)，并添加以下成分至以下濃度萬(wàn)古霉素(Vancomycin) 60 100 μ g/mL、頭孢氨芐(Claforan) 150 350 μ g/mL、卡那霉素(Amikacin) 50 150 μ g/mL、慶大霉素(Gentamycin) 80 160 μ g/mL、兩性霉素 B (Amphotericin B) 2 3 μ g/mL及300 500單位肝素鈉；以此作為含抗生素的殺菌液； 將15 20ml的經(jīng)血放入上述采集管內(nèi)，于0 4°C的低溫下保存M 48小時(shí)；然后離心， 去上清液；②、原代培養(yǎng)A)、取6 IOml的Chang氏通用培養(yǎng)基加入到步驟①所得物中；B)、將步驟A)的所得物放入培養(yǎng)瓶中置于4 6% C02、94 96%飽和濕度的36 38°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；培養(yǎng)5 7天后全量換液；再將上述培養(yǎng)瓶直立3 8分鐘，從而使未貼壁的細(xì)胞滑落至培養(yǎng)瓶底部，用移液管去除培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基；C)、在步驟B)所得的培養(yǎng)瓶中加入2 4mL的Chang氏通用培養(yǎng)基進(jìn)行潤(rùn)洗(潤(rùn)洗細(xì)胞層)，然后用移液管去除培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基；D)、在步驟C)所得的培養(yǎng)瓶中加入6 IOmL的Chang氏通用培養(yǎng)基，置于4 6% CO2、94 96%飽和濕度的36 38 °C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；Chang氏通用培養(yǎng)基的配制方法如下在無(wú)菌條件下，在無(wú)菌容器中加入650mL MEM-alpha(MEM alpha, Invitrogen ^w] ) >160 ~ 200mL Chang B (Irvine Scientific 公司)、10 30mL Chang C 基液(Irvine Scientific 公司)、5 15mL 青霉素/鏈霉素雙抗(10，000U/mL芐青霉素鈉，10，000 μ g/mL鏈霉素)，5 15mL的濃度為 200mM 的 L-谷氨酰胺(L-glutamine，Invitrogen 公司)、130 170mL 的胎牛血清(ES-FBS， Invitrogen公司)；充分混勻，高壓蒸汽滅菌后放入0 4°C冰箱保存待用；③、細(xì)胞傳代培養(yǎng)一旦步驟②原代培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)至75 85%匯合度時(shí)，即采用胰酶消化傳代；(一般每3 4天傳代細(xì)胞一次)；具體如下A)、一旦步驟②原代培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)至75 85%匯合度時(shí)，去除培養(yǎng)液，然后用無(wú)鈣鎂離子的PBS洗滌液進(jìn)行洗滌；B)、加入2 4ml胰酶，置于4 6% CO2、94 96%飽和濕度的36 38°C培養(yǎng)箱中孵育4 6分鐘；C)、加入4 6ml的Chang氏通用培養(yǎng)基使胰酶失活；D)、輕柔吹打，使貼壁細(xì)胞脫落并成單細(xì)胞狀態(tài)；E)、按l 8的比率傳代；F)、在每Iml的細(xì)胞懸液中加入5 7ml的Chang氏通用培養(yǎng)基；然后置于4 6% CO2、94 96%飽和濕度的36 38 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在本發(fā)明中，孵育和培養(yǎng)均是在4 6% CO2,94 96%飽和濕度的36 38°C培養(yǎng)箱中進(jìn)行的。在本發(fā)明中，用于消化的胰酶是指常規(guī)的0.25%或者0.2% (質(zhì)量體積比)的胰酶(胰蛋白酶)。本發(fā)明主要涉及以下內(nèi)容1.宮內(nèi)膜干細(xì)胞的培養(yǎng)及分子標(biāo)記物的鑒定。2.體外實(shí)驗(yàn)建立5-氮胞苷定向誘導(dǎo)經(jīng)血干細(xì)胞分化為功能性心肌細(xì)胞的體外模型。3.心肌梗死后充血后心力衰竭動(dòng)物模型的構(gòu)建。4.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)將沒(méi)有誘導(dǎo)和成功誘導(dǎo)分化的功能性心肌細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)移植，評(píng)估 MSCs移植后在體內(nèi)的分化情況及心功能改善情況。本發(fā)明通過(guò)體外經(jīng)血干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定，篩選出穩(wěn)定的宮內(nèi)膜干細(xì)胞系；經(jīng) 5-氮胞苷體外定向誘導(dǎo)模型，成功分化出功能性心肌細(xì)胞；利用細(xì)胞移植術(shù)，將沒(méi)有誘導(dǎo)和定向分化為心肌細(xì)胞經(jīng)血干細(xì)胞原位移植在心肌梗死后充血后心力衰竭動(dòng)物模型的梗死灶周邊，研究宮內(nèi)膜干細(xì)胞移植在心肌梗死后充血后心力衰竭動(dòng)物模型治療的作用；術(shù)后跟蹤細(xì)胞體內(nèi)的分化情況及心功能改善情況；運(yùn)用Kaplan-Meier生存曲線分析宮內(nèi)膜干細(xì)胞移植術(shù)在治療心肌梗死后充血后心力衰竭動(dòng)物模型的療效，證實(shí)其治療心肌梗死的可行性。宮內(nèi)膜(經(jīng)血)干細(xì)胞是最近發(fā)現(xiàn)的成體干細(xì)胞的一種，屬于間充質(zhì)干細(xì)胞 (MenSC)。子宮內(nèi)膜組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)存在豐富的間充質(zhì)干細(xì)胞，在月經(jīng)期間隨經(jīng)血排出體外，是一種無(wú)創(chuàng)、安全的干細(xì)胞來(lái)源方式。在細(xì)胞標(biāo)記分子表達(dá)和細(xì)胞增殖、分化能力上，經(jīng)血干細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞更相似。本發(fā)明通過(guò)5-氮胞苷誘導(dǎo)宮內(nèi)膜干細(xì)胞定向分化為功能性心肌細(xì)胞的體外模型，采用不經(jīng)誘導(dǎo)和誘導(dǎo)定向分化的宮內(nèi)膜干細(xì)胞體內(nèi)移植的方法，觀察干細(xì)胞在體內(nèi)分化的效果，為心肌梗死后充血后心力衰竭的治療提供一種高效、應(yīng)用更廣泛的解決方案。本發(fā)明的利用宮內(nèi)膜干細(xì)胞誘導(dǎo)分化功能心肌細(xì)胞的方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)1、宮內(nèi)膜干細(xì)胞表達(dá)心肌細(xì)胞特異性基因GREMl是骨髓干細(xì)胞的10倍。2、體外誘導(dǎo)分化率高，可高達(dá)60%。3、宮內(nèi)膜干細(xì)胞在小動(dòng)物體內(nèi)存活時(shí)間可達(dá)2月以上。
綜上所述，本發(fā)明建立體外定向誘導(dǎo)心肌細(xì)胞模型，利用干細(xì)胞移植技術(shù)，研究宮內(nèi)膜干細(xì)胞移植在心肌梗死后充血后心力衰竭動(dòng)物模型治療的作用；證實(shí)其治療心肌梗死的可行性，為提高干細(xì)胞臨床治療效果奠定基礎(chǔ)。


下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。圖1為免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，5μ M的5-氮胞苷誘導(dǎo)后72小時(shí)，β-Actin染色結(jié)果；圖2為RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，5 μ M的5_氮胞苷誘導(dǎo)后72小時(shí)，三條帶從上到下分另Ij 為 β -MHC, cTNT 和GAPDH ；圖3為體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖4為體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖5為移植后宮內(nèi)膜干細(xì)胞生存力評(píng)價(jià)圖。
具體實(shí)施例方式一、宮內(nèi)膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和擴(kuò)增招募10位不同年齡段的經(jīng)期婦女，在完全自愿的前提下捐獻(xiàn)月經(jīng)血樣品。具體操作規(guī)程如下1、經(jīng)血樣品收集將經(jīng)血采集管，月事杯放入經(jīng)血采集盒，送至經(jīng)血供者手中。采集管事先裝有 20mlHBSS(Hank' s平衡鹽溶液)采集液，其中含有Vancomycin (萬(wàn)古霉素)80 μ g/mL、 Claforan (頭孢氨芐)250 μ g/mL、Amikacin (卡那霉素)100 μ g/mL、Gentamycin (慶大霉素)120 μ g/mL、Amphotericin B (兩性霉素B) 2. 7 μ g/mL及400單位肝素鈉。以此作為含抗生素的殺菌液。即上述HBSS (Hank' s平衡鹽溶液)采集液的制備方法如下在20ml的Hank' s平衡鹽溶液中添加以下成分至以下濃度萬(wàn)古霉素 (Vancomycin) 80 μ g/mL、頭孢氨芐(Claforan) 250 μ g/mL、卡那霉素(Amikacin) 100 μ g/ mL、慶大霉素(Gentamycin) 120 μ g/mL、兩性霉素 B (Amphotericin B) 2. 7 μ g/mL及 400 單位肝素鈉；然后再按照常規(guī)程序于高溫高壓下進(jìn)行滅菌。供者在月經(jīng)開(kāi)始的前幾天(第1至3天)，利用月事杯獲取經(jīng)血樣品。將每15 20ml的經(jīng)血(屬于同一個(gè)供者)放入上述1個(gè)采集管內(nèi)。在得到細(xì)胞捐贈(zèng)者知會(huì)同意的情況下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)(此知會(huì)同意必需獲得制定評(píng)審委員會(huì)的批準(zhǔn))。在獲取樣品后送往處理實(shí)驗(yàn)室之前必須將它們?cè)诘蜏?0 4°C )條件下進(jìn)行保存(保存期一般為M到48 小時(shí))。1)保存M小時(shí)后，觀察經(jīng)血收集管中的樣品，如有沉淀，可將樣品經(jīng)由IOOmicron 過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾；2)準(zhǔn)備離心前，仔細(xì)將樣品收集管的外周擦拭干凈；確保離心機(jī)上離心管的平 3)在840g、4. 0°C的條件下離心樣品7分鐘；
4)小心取出樣品收集管，勿擾亂細(xì)胞分層；5)將樣品收集管外周用酒精棉擦拭消毒后，移入生物安全柜進(jìn)行下一步操作；6)去除上清液；小心吸液，不要擾亂細(xì)胞層，造成額外的細(xì)胞丟失。上述上清液可用于進(jìn)行細(xì)菌檢測(cè)，即將該上清液按照常規(guī)的血培養(yǎng)法進(jìn)行厭氧菌和需氧菌、真菌的檢測(cè)，并按照常規(guī)方法進(jìn)行鑒定。若為陽(yáng)性結(jié)果，則結(jié)束整個(gè)宮內(nèi)膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和擴(kuò)增。將上述HBSS (Hank' s平衡鹽溶液)采集液中被處理了 M小時(shí)后的經(jīng)血，按照常規(guī)方式進(jìn)行微生物檢測(cè)及傳染病病原體安全檢測(cè)，一般對(duì)常見(jiàn)病毒如HIV、HBV, HCV, CMV和梅毒進(jìn)行檢測(cè)。若為陽(yáng)性結(jié)果，則結(jié)束整個(gè)宮內(nèi)膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和擴(kuò)增。上述2種檢測(cè)目的是為了保證最終所得的功能心肌細(xì)胞的使用安全性。2、原代培養(yǎng)培養(yǎng)基配制——Chang氏通用培養(yǎng)基的成分如下l)650mL MEM alpha 培養(yǎng)基2) 180mL Chang 氏 B 液(基礎(chǔ)培養(yǎng)基)(18% ν/ν)3) 20mL Chang 氏 C 液(2% ν/ν)4) IOmL青霉素/鏈霉素雙抗(10，000U/mL芐青霉素鈉，10, 000 μ g/mL鏈霉素；即每ml青霉素/鏈霉素雙抗溶液中含有10，000U的芐青霉素鈉和10，000 μ g的鏈霉素)5) IOmL 的 L-谷氨酰胺 200mM (IOOx)6) I5OmL 的胎牛血清(15% ν/ν)Chang氏通用培養(yǎng)基的配制方法如下在無(wú)菌條件下，在無(wú)菌容器中加入 650mLMEM-alpha # S (MEM alpha, Invitrogen ^w] ) U80mL Chang BS^ (Irvine Scientific 公司)、20mL Chang C 基液(Irvine Scientific 公司)、IOmL 青霉素 / 鏈霉素雙抗(10，000U/mL芐青霉素鈉，10, 000 μ g/mL鏈霉素)，IOmL的濃度為200mM的L-谷氨酰胺(L-glutamine，Invitrogen 公司)、150mL 的胎牛血清(ES-FBS，Invitrogen 公司)；充分混勻，按照常規(guī)方式高壓蒸汽滅菌后放入0 4°C冰箱保存待用。1)取7mLChang氏通用培養(yǎng)基，加入到已去除上清的經(jīng)血樣品(即步驟1的所得物)中，輕柔吹打混勻；得細(xì)胞懸液；2)取一個(gè)T-25培養(yǎng)瓶，將步驟1)所得的全部細(xì)胞懸液移取到該培養(yǎng)瓶中；3)放入36. 0-38. 0°C的孵箱內(nèi)(5% C02，95%飽和濕度)培養(yǎng)；4)培養(yǎng)5-7天，全量換液(即換7mLChang氏通用培養(yǎng)基)。在生物安全柜中，先將培養(yǎng)瓶直立5分鐘，待未貼壁的細(xì)胞大部分隨培養(yǎng)基滑落至培養(yǎng)瓶底部，用移液管將培養(yǎng)基去除。5)取3mLChang氏通用培養(yǎng)基，慢慢在培養(yǎng)瓶側(cè)壁滴入。慢慢將培養(yǎng)瓶放平，輕柔地?fù)u晃，潤(rùn)洗細(xì)胞層，然后將培養(yǎng)瓶直立5分鐘，用移液管將培養(yǎng)基去除。6)取7mLChang氏通用培養(yǎng)基，慢慢在培養(yǎng)瓶側(cè)壁滴入。7)鏡下觀察，有散落的貼壁細(xì)胞。8)放入36. 0-38. 0°C CO2孵箱(5% C02，95%飽和濕度)內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中，等干細(xì)胞細(xì)胞貼壁后，去除未貼壁的細(xì)胞，一般每隔2 4天換液一次繼續(xù)培養(yǎng)。一周后觀察，細(xì)胞生長(zhǎng)，有成團(tuán)細(xì)胞增殖，此時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合度。
3、細(xì)胞傳代培養(yǎng)1)去除上述原代培養(yǎng)步驟的8)所得物中的培養(yǎng)液；2)用無(wú)鈣鎂離子的PBS洗滌液進(jìn)行洗滌；上述無(wú)鈣鎂離子的PBS洗滌液的配制如下
NaCl8.OOg
KCl0. 2g
Na2HPO4H2O1. 56g
KH2PO40. 2
雙蒸水定容至1 L;于高壓蒸汽滅菌(常規(guī)程序)后放入4°C冰箱保存待用。3)加入3ml胰酶，36_38°C孵育(5% CO2,95%飽和濕度)5分鐘；4)加入5ml的Chang氏通用培養(yǎng)基使胰酶失活；5)輕柔吹打，使貼壁細(xì)胞脫落并成單細(xì)胞狀態(tài)；6)按1 8的比率傳代在8ml的細(xì)胞懸液中取Iml至一新的T_25培養(yǎng)瓶中，再加入6ml的Chang氏通用培養(yǎng)基，混勻；7)放入 36. 0-38. 0°C CO2 孵箱(5% CO2,95% 飽和濕度)內(nèi)培養(yǎng)；8)每3-4天傳代細(xì)胞一次(即從步驟1)開(kāi)始至步驟7)為止，每3-4天傳代一次)，過(guò)度生長(zhǎng)的細(xì)胞會(huì)降低細(xì)胞的自然分化率。4、經(jīng)血間充質(zhì)干細(xì)胞的分子表型鑒定流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面抗原1)細(xì)胞傳至第2-4代時(shí)收集細(xì)胞，0. 25%胰酶消化細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞量為 IXlO6 ；2)分別取所需數(shù)據(jù)的0. 5ml EP管，分別加入小鼠抗人單克隆抗體(⑶34，⑶44， CD45, CD73, CD90, CD105, CD29, SSEA-4，0CT-4，及同型對(duì)照)20 μ 1 ；3)、管內(nèi)分別加入細(xì)胞樣本(步驟1)所得)50μ1，避光4°C孵育30min;4)、300g 離心 5 分鐘；5)、棄上清，加入(質(zhì)量濃度)人血清的PBS 1ml，充分混勻，300g離心5分鐘；6)、棄上清，加入PBS調(diào)整樣本量至100 μ 1，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析；所得結(jié)果為CD44，CD73,CD90, CD105, CD29, SSEA-4, 0CT-4 為陽(yáng)性，CD34, CD45 為陰性；從而確定所得確為宮內(nèi)膜干細(xì)胞。二、建立宮內(nèi)膜干細(xì)胞定向分化為功能性心肌細(xì)胞的體外模型取培養(yǎng)4-6代的宮內(nèi)膜干細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，采用ΙμΜ,δμΜ,ΙΟμΜ不同濃度的5-氮胞苷，并結(jié)合不同的誘導(dǎo)時(shí)間，將宮內(nèi)膜干細(xì)胞定向誘導(dǎo)成功能性心肌細(xì)胞。對(duì)分化所得細(xì)胞進(jìn)行心肌肌球蛋白重鏈(MHC)，心肌肌球蛋白輕鏈(MLC-2v)，心肌肌鈣蛋白 (Troponin)等標(biāo)志的免疫細(xì)胞化學(xué)染色，以及相關(guān)心肌特異性分子標(biāo)志如Nkx2. 5，ANF, GATA4，Na+-Ca2+交換泵及磷酸蛋白受體等的RT-PCR鑒定等。具體操作規(guī)程如下
1、體外定向誘導(dǎo)宮內(nèi)膜干細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞取第4-6代生長(zhǎng)狀況良好的細(xì)胞，表現(xiàn)為生長(zhǎng)旺盛、胞體大、胞核清晰、胞漿豐富、 顯微鏡下折光性強(qiáng)的細(xì)胞，以胰酶(例如為0.2%胰蛋白酶)消化，顯微鏡下見(jiàn)細(xì)胞變?yōu)閱蝹€(gè)圓形時(shí)即以含15%胎牛血清的DMEM終止消化，輕柔吹打后離心，獲得細(xì)胞沉淀，PBS洗 2遍(目的是為了洗去胰蛋白酶、胎牛血清等物質(zhì))。誘導(dǎo)培養(yǎng)基將細(xì)胞沉淀吹散，然后接種于6孔板中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，接種細(xì)胞密度為1 X IO5/孔，每孔加Iml誘導(dǎo)培養(yǎng)基(定容至 Iml)。置于5% CO2,95%飽和濕度的36 38°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。為了確定最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基，分別設(shè)置了以下3種誘導(dǎo)培養(yǎng)基含有1 μ M濃度5-氮胞苷的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，含有5 μ M濃度5-氮胞苷的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，含有10 μ M濃度5-氮胞苷的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基。以不含5-氮胞苷的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基作為對(duì)照。上述含有1 μ M濃度5-氮胞苷的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基的制備方法如下在無(wú)血清 DMEM培養(yǎng)基中加入5-氮胞苷，直至5-氮胞苷的濃度為1 μ Μ。于高壓蒸汽滅菌(常規(guī)方式) 后放入4°C冰箱保存待用。改變5-氮胞苷的用量，從而相應(yīng)的得到含有5 μ M濃度5-氮胞苷的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基以及含有10 μ M濃度5-氮胞苷的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基。孵育7 后，在上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中孵育的均能得到功能性心肌細(xì)胞；其中，含有 5 μ M濃度5-氮胞苷的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基所對(duì)應(yīng)的效果最好。而不含5-氮胞苷的無(wú)血清 DMEM培養(yǎng)基不能得到功能性心肌細(xì)胞。將上述功能性心肌細(xì)胞用含10% FBS (胎牛血清，體積含量)的DMEM培養(yǎng)基換液，每隔2-3天全量換液一次，繼續(xù)培養(yǎng)至第8周，每組包括20個(gè)細(xì)胞爬片(即每組分別設(shè)置誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后72小時(shí)及第2、3、4周)。5-氮胞苷誘導(dǎo)72小時(shí)后完成，繼續(xù)在含10% FBS (胎牛血清)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，目的是為了觀察誘導(dǎo)后心肌細(xì)胞的變化。2、免疫組化鑒定1)取5μ M的5-氮胞苷誘導(dǎo)72小時(shí)的細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛室溫固定。2)加入3% H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。3)加入待測(cè)β-Actin—抗，4°C過(guò)夜。4)加入生物素標(biāo)記的二抗。常溫孵育IOmin。5)鏡下觀察。所得結(jié)果如圖1所示圖1為免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，5μ M的5-氮胞苷誘導(dǎo)后72小時(shí)，β-Actin染色結(jié)果。β-Actin是心肌細(xì)胞的一種特異性蛋白，從圖1得知，宮內(nèi)膜干細(xì)胞已誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞。3、RT-PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞特異性基因(β -MHC, cTNT)的表達(dá)取第2代和誘導(dǎo)后72小時(shí)和第1、2、3、4、6、8周細(xì)胞，計(jì)數(shù)約1\106個(gè)，1^&01法提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行體外擴(kuò)增。PCR所需引物見(jiàn)下表1:表 1
所述擴(kuò)增體系為試劑
濃度
體積
權(quán)利要求
1.利用宮內(nèi)膜干細(xì)胞誘導(dǎo)分化功能心肌細(xì)胞的方法，其特征是包括以下步驟1)、宮內(nèi)膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和擴(kuò)增將經(jīng)血經(jīng)含抗生素的殺菌液的殺菌處理后，離心，去上清液；然后加入Chang氏通用培養(yǎng)基置于4 6% CO2,94 96%飽和濕度的36 38°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)5 7天后換液去除未貼壁細(xì)胞；一旦細(xì)胞生長(zhǎng)至75 85%匯合度時(shí)，即采用胰酶消化傳代；2)、體外誘導(dǎo)分化將上述步驟1)所得的第4 6代生長(zhǎng)狀況良好的細(xì)胞以胰酶消化，當(dāng)顯微鏡下見(jiàn)細(xì)胞變?yōu)閱蝹€(gè)圓形時(shí)即以含體積濃度為13 17%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，離心，所得的細(xì)胞沉淀用PBS清洗；在上述PBS清洗后的細(xì)胞中加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基置于4 6% CO2、94 96%飽和濕度的 36 38°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每1 X IO5個(gè)的細(xì)胞中加入0. 8 1. 2ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為在無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中含有1 10 μ M的5-氮胞苷；培養(yǎng)時(shí)間為68 76小時(shí)， 得功能心肌細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用宮內(nèi)膜干細(xì)胞誘導(dǎo)分化功能心肌細(xì)胞的方法，其特征是所述步驟1)依次為①、經(jīng)血收集在采集管內(nèi)設(shè)置20ml的Hank' s平衡鹽溶液，并添加以下成分至以下濃度萬(wàn)古霉素 60 100μ g/mL、頭孢氨芐150 350 μ g/mL、卡那霉素50 150 μ g/mL、慶大霉素80 160 μ g/mL、兩性霉素B 2 3 μ g/mL及300 500單位肝素鈉；以此作為含抗生素的殺菌液；將15 20ml的經(jīng)血放入上述采集管內(nèi)，于0 4°C的低溫下保存M 48小時(shí)；然后離心，去上清液；②、原代培養(yǎng)A)、取6 IOml的Chang氏通用培養(yǎng)基加入到步驟①所得物中；B)、將步驟A)的所得物放入培養(yǎng)瓶中置于4 6%CO2,94 96%飽和濕度的36 38°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；培養(yǎng)5 7天后全量換液；再將上述培養(yǎng)瓶直立3 8分鐘，從而使未貼壁的細(xì)胞滑落至培養(yǎng)瓶底部，用移液管去除培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基；C)、在步驟B)所得的培養(yǎng)瓶中加入2 4mL的Chang氏通用培養(yǎng)基進(jìn)行潤(rùn)洗，然后用移液管去除培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基；D)、在步驟C)所得的培養(yǎng)瓶中加入6 IOmL的Chang氏通用培養(yǎng)基，置于4 6%CO2, 94 96%飽和濕度的36 38 °C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；所述Chang氏通用培養(yǎng)基的配制方法如下在無(wú)菌條件下，在無(wú)菌容器中加入 650mLMEM-alpha 培養(yǎng)基、160 200mL 的 Chang B 基液、10 30mL 的 Chang C 基液、5 15mL青霉素/鏈霉素雙抗(10，00(^/11^芐青霉素鈉，10，00(^8/1^鏈霉素)，5 151^的濃度為200mM的L-谷氨酰胺、130 170mL的胎牛血清；充分混勻，高壓蒸汽滅菌后放入0 4°C冰箱保存待用；③、細(xì)胞傳代培養(yǎng)一旦步驟②原代培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)至75 85%匯合度時(shí)，即采用胰酶消化傳代；具體如下A)、一旦步驟②原代培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)至75 85%匯合度時(shí)，去除培養(yǎng)液，然后用無(wú)鈣鎂離子的PBS洗滌液進(jìn)行洗滌；B)、加入2 胰酶，置于4 6%CO2,94 96%飽和濕度的36 38°C培養(yǎng)箱中孵育4 6分鐘；C)、加入4 6ml的Chang氏通用培養(yǎng)基使胰酶失活；D)、輕柔吹打，使貼壁細(xì)胞脫落并成單細(xì)胞狀態(tài)； 幻、按1 8的比率傳代；F)、在每Iml的細(xì)胞懸液中加入5 7ml的Chang氏通用培養(yǎng)基；然后置于4 6% C02、94 96%飽和濕度的36 38 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用宮內(nèi)膜干細(xì)胞誘導(dǎo)分化功能心肌細(xì)胞的方法，包括以下步驟1)宮內(nèi)膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和擴(kuò)增；2)體外誘導(dǎo)分化將上述步驟1)所得的第4～6代生長(zhǎng)狀況良好的細(xì)胞以胰酶消化，當(dāng)顯微鏡下見(jiàn)細(xì)胞變?yōu)閱蝹€(gè)圓形時(shí)即以含體積濃度為13～17％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，離心，所得的細(xì)胞沉淀用PBS清洗；在上述PBS清洗后的細(xì)胞中加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基置于4～6％CO2、94～96％飽和濕度的36～38℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)時(shí)間為68～76小時(shí)，得功能心肌細(xì)胞。所得的功能心肌細(xì)胞能用于治療心肌梗死。
文檔編號(hào)C12N5/0775GK102199573SQ20111009268
公開(kāi)日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2011年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月13日
發(fā)明者項(xiàng)春生 申請(qǐng)人:杭州易文賽生物技術(shù)有限公司