專(zhuān)利名稱(chēng)：金黃色葡萄球菌腸毒素a、b基因pcr同步檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種金黃色葡萄球菌腸毒素A、B基因PCR 同步檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，簡(jiǎn)稱(chēng)金葡菌)是動(dòng)物和人類(lèi)化膿感染中最常見(jiàn)的病原菌，在自然界中無(wú)處不在，空氣、水、灰塵及人和動(dòng)物的排泄物中都可找到， 因而食品受其污染的機(jī)會(huì)很多。食品受其污染后，不僅腐敗變質(zhì)，而且部分菌株產(chǎn)生葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal Enterotoxins，SEs)。腸毒素是一類(lèi)結(jié)構(gòu)相關(guān)，毒力相似，抗原性不同的胞外蛋白質(zhì)。根據(jù)其抗原性可將其分為5個(gè)血清型SEA、SEB、SEC、SED和SEE，這五類(lèi)稱(chēng)為經(jīng)典腸毒素(其中SEC中包括SEC1、SEC2和SEC3三種亞型)，也是全球食物中毒中最常見(jiàn)的血清型。各型腸毒素均可引起細(xì)菌性食物中毒，其中以A、D型引起的食物中毒最多，B型和C型次之。金黃色葡萄球菌在pH值低于5的條件下很少腸毒素，當(dāng)pH值高于9. 8時(shí)，無(wú)論何型腸毒素都不能產(chǎn)生。葡萄球菌在牛奶和谷粉粥上于20 37°C下經(jīng)4 8h產(chǎn)生毒素，在 5 6°C低溫下18d產(chǎn)生毒素或不產(chǎn)生毒素。在含水分、蛋白質(zhì)和淀粉較多的食品中，葡萄球菌較易繁殖并產(chǎn)生毒素，如帶菌的生肉餡，于37°C下經(jīng)18 19h產(chǎn)生毒素，若在肉餡中加入少量饅頭碎屑，在同樣溫度下只經(jīng)過(guò)8h就能產(chǎn)生毒素，可見(jiàn)淀粉對(duì)形成毒素有促進(jìn)作用。引起金黃色葡萄球菌腸毒素中毒的食品主要為肉、奶、魚(yú)、蛋類(lèi)及制品等動(dòng)物性食品。糕、涼拌切粉、剩大米飯和米酒等也曾引起過(guò)中毒；熟肉類(lèi)如在熟后污染了致病葡萄球菌，又在20 30°C的環(huán)境下放置較長(zhǎng)時(shí)間，則極易引起中毒；奶和奶制品以及用奶制作的冷飲和奶油糕點(diǎn)常是引起中毒的食品；油煎雞蛋、熏魚(yú)、油浸魚(yú)罐頭等含油脂較多的食品，在污染上致病性葡萄球菌以后也能產(chǎn)生毒素。金黃色葡萄球菌在空氣中養(yǎng)分低時(shí)較易產(chǎn)生毒素，因此帶有此菌的食品，在通風(fēng)不良的高溫下放置，極有利此菌生長(zhǎng)并產(chǎn)生毒素。 當(dāng)食品污染了葡萄球菌并同時(shí)污染了其它微生物時(shí)，葡萄球菌的繁殖則受到抑制。如食品經(jīng)加熱，原有的各種微生物已被殺死，拮抗微生物也不復(fù)存在，熟后再一次被葡萄球菌污染，則將會(huì)促進(jìn)葡萄球菌的生長(zhǎng)并形成毒素。金黃色葡萄球菌引起的食物中毒在世界各地均有發(fā)現(xiàn)。常發(fā)生于夏秋季節(jié)，這是因?yàn)闅鉁剌^高，有利于細(xì)菌繁殖。但在冬季，如受到污染的食品在溫度較高的室內(nèi)保存，葡萄球菌也可繁殖并產(chǎn)生毒素。當(dāng)此細(xì)菌數(shù)> IO6個(gè)/克時(shí)，產(chǎn)生的腸毒素可引起食物中毒等病癥。目前，檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素的方法有酶聯(lián)免疫雙抗法，雙向瓊脂擴(kuò)散法。酶聯(lián)免疫雙抗法的缺點(diǎn)是易受食物成分及葡萄球菌蛋白A的影響，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，費(fèi)用較高，不利于在基層單位推廣使用。雙向瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，靈敏度低
發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供金黃色葡萄球菌腸毒素A、B基因PCR 同步檢測(cè)引物、其檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法。本發(fā)明提供一種金黃色葡萄球菌腸毒素A、B基因PCR同步檢測(cè)引物，其為SEAB-F =TGATAAATAYAAAGRKAAAffAMGTAG (SEQ ID No. 1)SEAB-R :GTTACACCACCATACATRCAAG(SEQ ID No. 2)。其中，所述的引物擴(kuò)增片段為SEA的566-670bp的片段和SEB的338_472bp的片段，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為105bp和135bp。根據(jù)電泳結(jié)果，即可判斷為何種腸毒素基因。本發(fā)明還提供含有上述引物的金黃色葡萄球菌腸毒素A、B基因PCR同步檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒還可包括PCR緩沖液、dNTPs、無(wú)菌超純水和Taq DNA聚合酶等。本發(fā)明還提供應(yīng)用上述的試劑盒在食品中食品中檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素A、B 基因的方法，其包括1)提取食品中的DNA;2)以步驟1提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；3)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。其中，所述的PCR反應(yīng)體系為每20μ 1的反應(yīng)液中，含有10-50ng的模板、 20-3(^] 各上下游引物、10\ 0 緩沖液2“ 1,0. 15-0. 25mM 的 dNTPs，1-1. 5U 的 Taq DNA 聚合酶，無(wú)菌超純水補(bǔ)足體積。其中，所述的PCR反應(yīng)條件為951預(yù)變性41^11，951變性308，50 541退火 30 60s，72°C延伸lmin，共25 30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。取5 10 μ 1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣于3%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行檢測(cè)，電壓為90V，電泳時(shí)間為40min，然后于凝膠成像系統(tǒng)中成像，觀察PCR擴(kuò)增產(chǎn)物有無(wú)預(yù)期的DNA特異性片段。本發(fā)明開(kāi)發(fā)了同步檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素A、B基因引物和試劑盒。本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒能準(zhǔn)確靈敏地檢測(cè)食品中的金黃色葡萄球菌腸毒素A、B, DNA最低檢測(cè)濃度為 3. 58ng，而且與其他細(xì)菌無(wú)交叉反應(yīng)，特異性好，同時(shí)樣品的前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，耗時(shí)少，能同時(shí)檢測(cè)大量的樣品，樣品檢測(cè)成本低于傳統(tǒng)的腸毒素檢測(cè)方法，而且本發(fā)明試劑保存時(shí)間長(zhǎng)，無(wú)放射性污染。本發(fā)明對(duì)解決大批量樣品的金黃色葡萄球菌腸毒素A、B的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)技術(shù)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。


圖1為簡(jiǎn)并引物SEAB特異性的瓊脂糖凝膠電泳分析圖。M =DNA Marker B ；1,8 金黃色葡萄球菌SEA ；2，9 金黃色葡萄球菌SEB ；3 陰性對(duì)照；4 金黃色葡萄球菌；5 表皮葡萄球菌；6 大腸桿菌；7 沙門(mén)氏菌。 圖2為金黃色葡萄球菌腸毒素B的DNA靈敏性試驗(yàn)瓊脂糖凝膠電泳分析圖。M =DNA Marker B ；1,2 :358ng ；3，4 35. 8ng ；5，6 3. 58ng ；7，8 :358pg ；9，10 35. 8pg。圖3為SEA、SEB在同一個(gè)PCR反應(yīng)管中反應(yīng)的電泳分析圖。M =DNA Marker B ；1 SEA、SEB在同一 PCR反應(yīng)管中擴(kuò)增的結(jié)果。圖4為細(xì)菌菌數(shù)10倍系列稀釋的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析圖。M =DNAMarker B ；1 :2X106cfu/ml ；2 :2X 105cfu/ml ；3 :2X 104cfu/ml ；4 :2X 103cfu/ml ；5 :2X 102cfu/ml ； 6 :1. 9 X IO1CfVml ；7 陰性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1簡(jiǎn)并引物檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素A、B的PCR試劑盒的組建(1)簡(jiǎn)并引物 SEAB 上、下游各 15πιΜ，100μ 1。(2) IOX PCR 緩沖液(含 Mg2+20mM)，1. 5ml。(3) dNTPs (IOmM)，1. 5ml。(4)無(wú)菌超純水，3. Oml。(5) Taq DNA 聚合酶(5U/ μ 1)，100 μ 1。實(shí)施例2試劑盒操作取簡(jiǎn)并上游引物0. 5μ 1，簡(jiǎn)并下游引物0. 5μ 1，10XPCR緩沖液2μ 1，dNTPs 0. 5μ l,Taq DNA聚合酶0. 5 μ 1，無(wú)菌超純水補(bǔ)足至20 μ 1，放入0. 2ml的離心管中，把提取的菌體DNA 1 μ 1加入上述體系中，總體積為20 μ 1，離心混勻后置PCR儀上進(jìn)行自動(dòng)化擴(kuò)增反應(yīng)。提取菌體DNA的方法①將Iml無(wú)水乙醇、Iml氨水和Iml石油醚加入到5ml人工污染金黃色葡萄球菌腸毒素A、B的乳品樣品中，混勻。②混合物以12000xg，離心lOmin。棄去上清液，剩余的沉淀用300 μ 1 10mM/L TE(pH7. 8)溶解。將Syl(IOmgAil)的溶葡萄球菌酶加入到上述液體中，37°C水浴lh，期間不斷劇烈振蕩。③將50μ1 10%的SDS加入上述液體中，煮沸5min。④將等體積的氯仿加入上述混合液中，充分振蕩混勻，17000xg離心lOmin，棄沉
淀，保留上清液。⑤將上清液移入一新的離心管中，用0. 1倍體積2. 5M乙酸銨(pH5. 4)，2. 5倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇和5 μ 1 (10mg/ml)糖原沉淀DNA，混合物17000xg，離心20min。DNA沉淀干燥后用50 μ 1 TE溶解，置于-20°C備用。反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性4min，95°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸lmin，共30 個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。取5 μ 1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣于3%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行檢測(cè)，電壓為90V，電泳時(shí)間為 40min，然后于凝膠成像系統(tǒng)中成像，觀察PCR擴(kuò)增產(chǎn)物有無(wú)預(yù)期的DNA特異性片段。結(jié)果表明，在IOObp和130bp左右出現(xiàn)兩條特異的條帶，而陰性對(duì)照則無(wú)條帶出現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)例1以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、表皮葡萄球菌為對(duì)照菌，利用上述檢測(cè)方法同時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌腸毒素SEA菌株，金黃色葡萄球菌腸毒素SEB菌株和對(duì)照菌株進(jìn)行PCR檢測(cè)，然后對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖可知，簡(jiǎn)并引物 SEAB只對(duì)金黃色葡萄球菌腸毒素SEA、SEB菌出現(xiàn)PCR陽(yáng)性擴(kuò)增反應(yīng)，對(duì)照組未出現(xiàn)特異性片段，該簡(jiǎn)并引物顯示了良好的特異性。實(shí)驗(yàn)例2靈敏性實(shí)驗(yàn)提取的金黃色葡萄球菌腸毒素B的DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)并計(jì)算其濃度。DNA定量測(cè)定方法將提取的DNA模板進(jìn)行適度稀釋?zhuān)米贤夥止夤舛扔?jì)測(cè)定260nm波長(zhǎng)下的 OD值，DNA含量=OD260 X 50 μ g/ml (雙鏈DNA) X 10 (稀釋倍數(shù))，經(jīng)計(jì)算得DNA含量=358ng/ μ 1，將其逐步10—1 ； 10_2 ； 10_3 ； 10_4 ； 10_5稀釋?zhuān)謩e取1 μ 1為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，確定DNA最低檢測(cè)濃度為3. 58ng,電泳結(jié)果見(jiàn)圖2所示。實(shí)驗(yàn)例3簡(jiǎn)并引物同時(shí)檢測(cè)腸毒素A、B的實(shí)驗(yàn)分別取SEA、SEB菌的DNA 1μ 1為模板，加入到同一個(gè)PCR反應(yīng)管中，無(wú)菌超純水 12 μ 1，其余用量不變，PCR反應(yīng)條件也不變，電泳結(jié)果見(jiàn)圖3，由圖可知SEA、SEB菌的PCR 特異性片段已擴(kuò)增出并分離開(kāi)，說(shuō)明特異性簡(jiǎn)并引物SEAB既可以分別檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素SEA、SEB菌，又可以檢測(cè)出一個(gè)樣品中是否同時(shí)含有金黃色葡萄球菌腸毒素SEA、 SEB菌。不但減少了引物用量，節(jié)約成本，而且縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)效率。實(shí)驗(yàn)例4菌體靈敏性實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)不可以直接進(jìn)行菌體PCR，因?yàn)榻瘘S色葡萄球菌的細(xì)胞壁比較厚，煮沸不能破壞其細(xì)胞壁，因此必須提取其DNA。本實(shí)驗(yàn)的目的就要建立一種能夠同時(shí)快速檢測(cè)食品中 A型和B型金黃色葡萄球菌的PCR方法。以金黃色葡萄球菌腸毒素SEB菌株作為檢測(cè)菌，營(yíng)養(yǎng)肉湯過(guò)夜增菌培養(yǎng)后用無(wú)菌生理鹽水做一系列10倍稀釋?zhuān)俳?jīng)平板菌落計(jì)數(shù)得知各梯度濃度為2X106、2X105、 2X 104、2X 103、2X 102、1. 9X IOlJcfuAil,分別用PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明本方法的靈敏性為2X103cfu/ml，顯示了較好的靈敏性，電泳結(jié)果見(jiàn)圖4所示。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)驗(yàn)例5本發(fā)明試劑盒檢測(cè)生牛乳中的金黃色葡萄球菌腸毒素A、B實(shí)施例1的試劑盒檢測(cè)了 50份生牛乳，結(jié)果見(jiàn)表1可知，其中有3份被檢出含有 SEA，有4份被檢出含有SEB，有2份含有SEA和SEB，產(chǎn)毒素率為18%。本試驗(yàn)結(jié)果與Mork 等及Jorgensen等報(bào)告生鮮乳中葡萄球菌產(chǎn)毒素率分別為38.0%和22. 1% [73]，基本一致。表1金黃色葡萄球菌及其腸毒素的檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.金黃色葡萄球菌腸毒素A、B基因PCR同步檢測(cè)引物，其為SEAB-F TGATAAATAYAAAGRKAAAffAMGTAGSEAB-R :GTTACACCACCATACATRCAAG。
2.含有權(quán)利要求1所述引物的金黃色葡萄球菌腸毒素A、B基因PCR同步檢測(cè)試劑盒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，還包含PCR緩沖液、dNTPs、無(wú)菌超純水和Taq DNA聚合酶。
4.應(yīng)用權(quán)利要求2或3所述的試劑盒在食品中檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素A、B基因的方法，其包括1)提取食品中的DNA;2)以步驟1提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；3)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的PCR反應(yīng)體系為每20μ 1的反應(yīng)液中，含有10-50ng的模板、20-30pM各上下游引物、10XPCR緩沖液2μ 1、0. 15-0. 25mM的 dNTPs, 1-1. 5U的TaqDNA聚合酶，無(wú)菌超純水補(bǔ)足體積。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性 4min, 95°C變性30s，50 54°C退火30 60s，72°C延伸lmin，共25 30個(gè)循環(huán)，最后72°C 延伸lOmin。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種金黃色葡萄球菌腸毒素A、B基因PCR同步檢測(cè)引物、其檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法。本發(fā)明提供的同步檢測(cè)引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1和2所示。本發(fā)明還提供含有所述引物的PCR檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒能準(zhǔn)確靈敏地檢測(cè)食品中的金黃色葡萄球菌腸毒素A、B，DNA最低檢測(cè)濃度為3.58ng，而且與其他細(xì)菌無(wú)交叉反應(yīng)，特異性好，同時(shí)樣品的前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，耗時(shí)少，能同時(shí)檢測(cè)大量的樣品，成本低。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102181547SQ201110092430
公開(kāi)日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月13日
發(fā)明者劉繼超, 周偉明, 姜鐵民, 陳歷俊 申請(qǐng)人:北京三元食品股份有限公司