專利名稱：一種轉(zhuǎn)基因番茄特異性檢測靶序列、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子及其檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，主要涉及一種轉(zhuǎn)基因番茄kneca B, Da, F品系的基因特異性和構(gòu)建特異性的檢測靶序列、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子及其核酸檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
自1996年全球第一例商品化的轉(zhuǎn)基因番茄問世以來，由GMCs加工的轉(zhuǎn)基因食品和食品成分達(dá)4000余種。隨著GMCs的大規(guī)模種植和商業(yè)化生產(chǎn)，其安全性問題受到廣泛關(guān)注。歐盟、韓國、日本等相繼制定了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的標(biāo)簽制度；我國于2001年開始實(shí)施標(biāo)簽制度，2002年施行《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理辦法》，將玉米、大豆、油菜、棉花和番茄列為第一批實(shí)施標(biāo)識(shí)管理的GMCs。轉(zhuǎn)基因番茄，一方面作為生物反應(yīng)器，用以生產(chǎn)醫(yī)藥用重組蛋白、 抗體的研發(fā)；另一方面，用于培育具有延熟、抗蟲等性能的的番茄良種品系。其中已商品化的轉(zhuǎn)基因番茄共有kneca B，Da，F(xiàn)番茄、Bioscein (華番1號(hào)，商品名百日鮮)等九種品系。目前，我國番茄轉(zhuǎn)基因成分的相關(guān)檢測技術(shù)研究較玉米、大豆等農(nóng)作物略有滯后。在九種商品化的轉(zhuǎn)基因品系中只有Bioscein的檢測研究較為全面。我國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局2006年頒布了番茄中轉(zhuǎn)基因成分的定性PCR檢測方法行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(SN/T1816-2006)， 而轉(zhuǎn)基因番茄的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究國內(nèi)外尚未見報(bào)道。轉(zhuǎn)基因番茄kneca B, Da, F品系是由美國捷利康公司(Zeneca Seeds)研發(fā)，于 1994年在美國和1996年在加拿大批準(zhǔn)上市。B，Da，F(xiàn)品系是利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù)培育而成，目的基因是部分多聚半乳糖苷酶(polygalacturonase，pg)，可抑制番茄自身pg 表達(dá)而具有延熟特性，便于儲(chǔ)藏和運(yùn)輸。Da，F(xiàn)品系表達(dá)載體為PJR16S，內(nèi)含部分正義的pg 基因；B品系表達(dá)載體是pJR16A，內(nèi)含部分反義的pg基因。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qPCR)廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測。qPCR常通過對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(reference material, RM)進(jìn)行梯度稀釋，而構(gòu)建檢測用標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法來實(shí)現(xiàn)定量。 基于拷貝數(shù)計(jì)算的qPCR定量，實(shí)驗(yàn)證實(shí)質(zhì)?？梢蕴娲鶪MCs的基因組作為核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。在構(gòu)建qPCR定量檢測體系中，RM用作陽性對照和配制不同濃度的定量檢測的標(biāo)準(zhǔn)品，用于對GMCs混合水平進(jìn)行量化和分析。在轉(zhuǎn)基因定量檢測過程中，RM必須經(jīng)過嚴(yán)格試驗(yàn)驗(yàn)證其均勻性、穩(wěn)定性和定值。高純度、定值準(zhǔn)確可靠、良好的溯源性和系列性是有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特點(diǎn)。目前獲得歐盟IRMMQnstitutefor Reference Materials and Measurements) lki￡URMM WWiiHfeit^M (certified reference material, CRM)白勺 GMCs，如含量為0%，0. 1%，0. 5%，1%，2%，5%的轉(zhuǎn)基因玉米財(cái)-176等，已不能滿足現(xiàn)階段快速增長的GMCs監(jiān)控的需求。質(zhì)粒容易獲得，儲(chǔ)存簡單，高穩(wěn)定性以及普遍適用性等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)可以成為替代基因組的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；質(zhì)粒不僅操作簡單、定量簡單而且可以避免因?yàn)橹参锬承┙M織的基因結(jié)構(gòu)不同而導(dǎo)致的轉(zhuǎn)基因含量的不一致。作為核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子插入的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因與外源基因比例是恒定的，能夠應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因定量檢測。2009 年 Reiting 報(bào)道，GMCs 亞麻品系 CDC Triffid FP967 (加拿大 UniversityofSaskatchewan)研發(fā)，于1996年在加拿大、1999年在美國批準(zhǔn)生產(chǎn)及流通，在2001年退市。然而在2009年在檢測歐洲市場亞麻樣品中，⑶C Triffid亞麻FP967構(gòu)建特異性呈陽性反應(yīng)。這事件說明了盡管已退市的GMCs，其外源基因有可能發(fā)生基因的逃逸等情況而可能對生態(tài)安全性造成影響。所以，對退市或者未獲批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因作物，建立其國際標(biāo)準(zhǔn)化的檢測體系都是必需的。Roning等人在2003年根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米Btll品系的表達(dá)載體序列設(shè)計(jì)特異引物，運(yùn)用反向PCR技術(shù)擴(kuò)增得到外源基因插入玉米基因在邊界序列，從而設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)基因玉米Btll品系特異性的引物和探針，同時(shí)獲得的序列與美國FDA在1995年對轉(zhuǎn)基因玉米Btll品系品系的解除控制書中公布的表達(dá)載體的序列相吻合。Reiting根據(jù)GMCs數(shù)據(jù)庫AGBIOS針對CaMV35S啟動(dòng)子和NPTII基因序列之間的連接區(qū)域序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針，并能有效的檢測如轉(zhuǎn)基因玉米，轉(zhuǎn)基因棉花和轉(zhuǎn)基因油菜等不同品系GMCs。這些均證實(shí)GMCs中外源基因在成功導(dǎo)入作物基因組后，其導(dǎo)入序列是穩(wěn)定，此也即我們能針對插入序列建立GMCs核酸檢測的重要科學(xué)基礎(chǔ)。 基于此，本發(fā)明利用反向遺傳學(xué)原理，自美國FDA解除控制書以及轉(zhuǎn)基因檢測方法數(shù)據(jù)庫GMDD和GMCs數(shù)據(jù)庫AGBIOS獲取轉(zhuǎn)基因番茄kneca B, Da, F品系的相關(guān)序列及載體結(jié)構(gòu)信息，合成構(gòu)建具有GMCs監(jiān)測核酸靶標(biāo)分子片段的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子及其工程菌菌株的方法，不失為解決退市或未批準(zhǔn)流通的GMCs而確實(shí)缺乏實(shí)際基體樣品的可行方法之

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)方案之一是提供一種轉(zhuǎn)基因番茄kneca B，Da，F(xiàn)品系的基因特異性和構(gòu)建特異性核酸檢測靶序列。解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案的如下利用反向遺傳學(xué)原理構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因番茄kneca B, Da, F品系的pg基因特異性檢測革巴序列(the target sequence of pg gene-specific, GS_pg)，具有 SEQ ID NO :1 所示堿基組成。利用反向遺傳學(xué)原理構(gòu)建的kneca Da, F品系pJR16S構(gòu)建特異性檢測靶序列 (the target sequence of pJR16S construct specific, CS-16S),具有 SEQ ID NO :2所示
堿基組成。利用反向遺傳學(xué)原理構(gòu)建的kneca B品系pJR16A構(gòu)建特異性檢測靶序列(the target sequence of pJR16A construct specific, CS-16A),具有 SEQ ID NO :3 所不喊基組成。本發(fā)明另一目的是提供一種重組質(zhì)?；蛸|(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或E. coli工程菌菌株。實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下一種包含有上述任一所述轉(zhuǎn)基因番茄kneca B, Da, F品系的pg基因特異性和 PJR16S、PJR16A構(gòu)建特異性檢測靶序列的重組質(zhì)?；蛸|(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；進(jìn)一步以該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)菌E. coli，獲得能用于生產(chǎn)該重組質(zhì)粒的工程菌菌株。本發(fā)明的另一目的是提供轉(zhuǎn)基因番茄Zeneca B, Da，F(xiàn)品系的pg基因特異性和 PJR16S、PJR16A構(gòu)建特異性核酸檢測試劑盒。
實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下一種針對SEQ ID NO 1的pg基因特異性核酸檢測試劑盒，主要包括有堿基組成為SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5的引物對，以及由SEQ ID NO 6所示堿基構(gòu)成的Taqman探針。一種針對SEQ ID NO 2的pJR16S構(gòu)建特異性核酸檢測試劑盒，主要包括有堿基組成為SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8的引物對，以及由SEQ ID NO 9所示堿基構(gòu)成的Taqman 探針。一種針對SEQ ID N0:3的pJR16A構(gòu)建特異性核酸檢測試劑盒，主要包括有堿基組成為SEQ ID N0:10和SEQ ID NO :11的引物對，以及由SEQ ID N0:12所示堿基構(gòu)成 Taqman 探針。本發(fā)明基于反向遺傳學(xué)“序列-結(jié)構(gòu)-功能”的原理，自美國FDA解除控制書以及轉(zhuǎn)基因檢測方法數(shù)據(jù)庫GMDD和轉(zhuǎn)基因作物genetically Modified Crops, GMCs)數(shù)據(jù)庫 AGBIOS獲取轉(zhuǎn)基因番茄kneca B,Da,F品系的相關(guān)序列及載體結(jié)構(gòu)信息，合成構(gòu)建其具有 GMCs監(jiān)測核酸靶標(biāo)分子片段的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子、E. coli工程菌菌株及其qPCR檢測體系，為轉(zhuǎn)基因番茄kneca B, Da, F品系的監(jiān)測建立了可行的可供使用的定性與定量檢測體系，可對基于pJR16A/pJR16S載體轉(zhuǎn)化所研發(fā)的kneca B，Da，F(xiàn)轉(zhuǎn)基因番茄品系及其后續(xù)形成的雜交系如自F系發(fā)展形成的1401F、H282F、11013F、7913F等，以及對其在環(huán)境和其他番茄品系是否存在基因的逃逸等生態(tài)安全性情況進(jìn)行基因特異性和構(gòu)建特異性檢測。本發(fā)明構(gòu)建轉(zhuǎn)基因番茄kneca B, Da, F品系核酸檢測體系中，經(jīng)常規(guī)PCR和qPCR 驗(yàn)證，該引物和探針都具有特異性。擴(kuò)增效率范圍在93. 3% 102. 4%而相關(guān)系數(shù)R2在 0. 994 0. 998，證明該體系可以有效反映ERG_apx與GS_pg或CS-16S或CS-16A的量的關(guān)系。所建立的qPCR方法可以檢測含量低至0. 的GS-pg和CS-16S以及CS-16A，經(jīng)過換算后的偏差在-9. 7 17. 3%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)差在4. 2% 25. 8%范圍內(nèi)，證明所構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子及其qPCR檢測體系能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因成分的定量檢測，為轉(zhuǎn)基因番茄kneca B, Da, F 品系的監(jiān)測建立了可行的可供使用的定性與定量檢測體系，可對基于pJR16A/pJR16S載體轉(zhuǎn)化所研發(fā)的kneca B，Da，F(xiàn)轉(zhuǎn)基因番茄品系及其后續(xù)形成的雜交系如自F系發(fā)展形成的 1401F、H282F、11013F、7913F等，以及對其在環(huán)境和其他番茄品系是否存在基因的逃逸等生態(tài)安全性情況進(jìn)行基因特異性和構(gòu)建特異性檢測。


圖 1 番茄 pg 基因(GenBank accesstion number :Μ37304· 1，ΑΚ326072. 1)與 B， Da, F品系導(dǎo)入的pg片段(pJR16-pg)的序列比對；圖2 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pEasy-T3_16A，pEasy-T3_16S的EcoR I酶切鑒定圖，其中， M. 5000bp DNA Marker ； 1.質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子 pEasy_T3_16A ；2.質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子 pEasy-T3_16S ；圖3 :GS_pg、CS-16A和CS-16S特異性檢測以及LOD分析，其中，(A) GS-pg檢測特異性分析M. IOObp DNA marker ；1.陰性對照；
2.pEasy-T3-16A ；
3.pEasy-T3-16S ；
4.益豐4號(hào)番茄基因組DNA ；
5.益豐番茄基因組DNA ；
6.夏豐番茄基因組DNA ；
7.年豐番茄基因組DNA ；
8.金豐番茄基因組DNA ；
(B)GS-pg檢測的LOD分析
M. IOObp DNA marker ；1.陰性對照；2-7.IO5 IO1Copies/μ 1 ；
(OCS-16A檢測的LOD分析；
M. IOObp DNA marker ；1.陰性對照；2-7.IO5 101，copies/μ 1 ；
(D)CS-16S檢測的LOD分析；
M. IOObp DNA marker ；1.陰性對照；2-7.IO5 IO1Copies/μ 1 ；
圖 4 :ERG-apx, GS-pg 以及 CS-16A 和 CS--16S的標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建，其中，
A :ERG-apx的標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)(R2)==0. 994，效率=98. 4%
B :GS-pg的標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2 = 0. 997，效率==93. 3%，Cf 為 0. 95
C :CS-16A 標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2 = 0. 998，效率=102. 4%, Cf % 0. 95
D :CS-16S 標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2 = 0. 996，效率=95. 6%, Cf 為 0. 93。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明基于反向遺傳學(xué)原理構(gòu)建分別含有轉(zhuǎn)基因番茄B，Da，F(xiàn)品系的pg基因特異性序列(GS-pg)及其構(gòu)建特異性序列(CS-16S、CS-16A)的轉(zhuǎn)基因番茄B，Da，F(xiàn)品系的特異性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子 pEasy-T3-16A、pEasy-T3_16S。以Beacon Designer 7. 5設(shè)計(jì)用于定性PCR和qPCR檢測的引物對和Taqman探針；基于質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子建立了定性PCR和qPCR檢測體系，對方法的特異性、敏感性、重復(fù)性、檢測下限等指標(biāo)進(jìn)行評估；使用PicoGreen試劑盒對質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子進(jìn)行定量，以番茄內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因質(zhì)粒為背景DNA定量混有pEasy-T3-16A或pEasy-T3-16S制備成含量為1 %和 0.1% (w/w)的兩組核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，進(jìn)行所構(gòu)建qPCR檢測體系的定量性能評價(jià)。結(jié)果錨定 qPCR檢測靶序列GS-pg湖bp，CS-16S 109bp、CS-16A 102bp ；酶切鑒定所構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子均可得到預(yù)期大小的插入子片段；所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測體系，重復(fù)性的相對標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)O. 2% 1.5%，檢測下限25copies，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程線性關(guān)系R2值在0. 994 0. 998，效率在93. 3% 102. 4%。經(jīng)換算系數(shù)Cf換算，對PicoGreen定量的樣品進(jìn)行驗(yàn)證，其實(shí)測值與真值的偏差是-9. 7% 17. 3%。從而，本發(fā)明成功構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因番茄kneca B, Da, F品系的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子及其 qPCR檢測體系，為轉(zhuǎn)基因番茄kneca B,Da,F品系轉(zhuǎn)基因成分的監(jiān)測建立了可行的可供使用的定性與定量檢測體系?？蓪趐JR16A/pJR16S載體轉(zhuǎn)化所研發(fā)的kneca B, Da, F 轉(zhuǎn)基因番茄品系及其后續(xù)形成的雜交系如自F系發(fā)展形成的1401F、H282F、11013F、7913F 等，以及對其在環(huán)境和其他番茄品系是否存在基因的逃逸等生態(tài)安全性情況進(jìn)行基因特異性和構(gòu)建特異性檢測。
以下結(jié)合附圖，對本發(fā)明做詳細(xì)闡述，但不用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例一熒光定量PCR(qPCR)的引物及Taqman探針的設(shè)計(jì)與合成Ipg基因的生物信息學(xué)分析以及設(shè)計(jì)基于文獻(xiàn)復(fù)習(xí)和NCBI網(wǎng)絡(luò)信息平臺(tái)、上海市轉(zhuǎn)基因安全性檢測評估共享服務(wù)平臺(tái) Oittp://www. shgmo. org/)、轉(zhuǎn)基因檢測方法數(shù)據(jù)庫(GMO Detection methodDatabase GMDD)、轉(zhuǎn)基因作物數(shù)據(jù)庫AGBIOS(http//cera-Rmc. org/index.php ？ action = gm_crop_database) 和美國食品藥品監(jiān)督管理局(U. S. Food and Drug Administration, FDA)對轉(zhuǎn)基因番茄ZenecaB，Da, F品系的解除控制書中公布的Pg基因序列，應(yīng)用DNAMAN以及 ft~imerfremier5. 0等軟件對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。針對轉(zhuǎn)基因番茄kneca B, Da, F品系表達(dá)載體中的目的基因Pg的序列，利用軟件Beacon Designer 7. 5設(shè)計(jì)pg基因的qPCR 引物和Taqman探針。2轉(zhuǎn)基因番茄kneca B, Da, F品系的構(gòu)建特異性的生物信息學(xué)分析及設(shè)計(jì)構(gòu)建特異性檢測是指針對植物表達(dá)載體構(gòu)建所特有的序列即其T-DNA區(qū)域內(nèi)(LB 與RB之間)相鄰兩個(gè)元件間的連接區(qū)序列(如pg-nos、nptII-p-nos等)。根據(jù)上述的轉(zhuǎn)基因作物的數(shù)據(jù)平臺(tái)，對B，Da品系的pJR16A的CaMV35S啟動(dòng)子和部分反義pg基因序列之間的連接區(qū)域序列p35S-partial antisense pg和F品系pJR16S的CaMV35S啟動(dòng)子和部分正義Pg基因序列之間的連接區(qū)域序列p35S-partial sense pg進(jìn)行生物信息學(xué)分析，錨定高度保守的特異性序列分別作為kneca B，Da及F品系的構(gòu)建特異性核酸檢測靶標(biāo)。具體序列如下轉(zhuǎn)基因番茄kneca B, Da, F pg基因特異性檢測靶序列(the target sequenceof pg gene-specific, GS-pg)SEQ ID NO :1 :GTGATTAATG TACTTAGCTTTGGAGCTAAGGGTGATGGAAAAACATATGATAATAT TGCATTTGAGCAAGCATGGAATGA AGCATGTTCA TCTAGAACAC CTGTTCAA ；Zeneca Da, F 品系 pJR16S 構(gòu)建特異性檢測革巴序列(the target sequence ofpJR16S construct specific, CS-16S)SEQ ID NO 2 :ACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAG GAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACAGGTACCC AATCTTTTTC AATAGACAA ；Zeneca B 品系 pJR16A 構(gòu)建特異性檢測靶序列(the target sequence ofpJR16A construct specific, CS-16A)SEQ ID NO :3 :AAGGGATGAC GCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATAT AAGGAAGTTC ATTTCATTTGGAGAGGACAGGTACCCACTC AAATTTGATA TG。3引物和Taqman探針?biāo)徒簧锕竞铣伞?轉(zhuǎn)基因番茄kneca B, Da, F品系pg基因的生物信息分析結(jié)果pg基因廣泛存在于植物之中，番茄Pg基因(GenBank Accession No. M37304. 1)全長7456bp，含有9個(gè)外顯子和 8 個(gè)內(nèi)含子。番茄 pg 基因的 cDNA(GenBankAccession No. AK326072. 1)。利用 DNAMAN 對M37304. UAK326072. 1和B, Da, F品系導(dǎo)入的pg片段進(jìn)行多序列比對，從比對結(jié)果(圖 1)可以看出，導(dǎo)入的Pg片段含有番茄Pg基因的外顯子的1至4的區(qū)域和部分5區(qū)域。此外，利用DNAMAN比對Da，F(xiàn)品系表達(dá)載體為pJR16S內(nèi)部分正義pg基因和B品系表達(dá)載體是PJR16A的內(nèi)含部分反義的pg基因，獲取兩者相同序列設(shè)計(jì)B，Da, F品系導(dǎo)入的pg片段的GS-pg引物和探針。Zeneca B，Da，F(xiàn)品系qPCR體系的檢測試劑盒主要包括有引物對與iTaqman探針， 見表1。表1. Zeneca B, Da, F品系核酸檢測引物對與Taqman探針
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因番-kneca B, Da，F(xiàn)品系pg基因特異性檢測靶序列，其特征是，具有 SEQ ID NO 1所示堿基組成。
2.—種轉(zhuǎn)基因番-kneca Da，F(xiàn)品系pJR16S構(gòu)建特異性檢測靶序列，其特征是，具有 SEQ ID NO :2所示堿基組成。
3.—種轉(zhuǎn)基因番-kneca B品系pJR16A構(gòu)建特異性檢測靶序列，其特征是，具有SEQ ID NO 3所示堿基組成。
4.一種包含有權(quán)利要求1-3任一所述轉(zhuǎn)基因番茄的特異性檢測靶序列的重組質(zhì)?；蛸|(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或工程菌菌株。
5.一種針對權(quán)利要求1所述特異性檢測靶序列的Pg基因特異性檢測試劑盒，其特征是，主要包括有堿基組成為SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5的引物對，以及由SEQ ID NO 6 所示堿基構(gòu)成的iTaqman探針。
6.一種針對權(quán)利要求2所述特異性檢測靶序列的PJR16S構(gòu)建特異性檢測試劑盒，其特征是，主要包括有堿基組成為SEQ ID NO :7和SEQ ID NO 8的引物對，以及由SEQ ID NO 9所示堿基構(gòu)成的Taqman探針。
7.一種針對權(quán)利要求3所述特異性檢測靶序列的PJR16A構(gòu)建特異性檢測試劑盒，其特征是，主要包括有堿基組成為SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO 11的引物對，以及由SEQ ID NO 12所示堿基構(gòu)成的Taqman探針。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)基因番茄Zeneca B，Da，F(xiàn)品系的基因特異性和構(gòu)建特異性的檢測靶序列、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子及其核酸檢測試劑盒，該質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子為含有任一種具有堿基組成SEQ ID NO1-3的檢測靶序列。所述核酸檢測試劑盒包括有由SEQ ID NO4-6組成、由SEQ ID NO7-9組成、由SEQ ID NO10-12組成。本發(fā)明成功構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因番茄Zeneca B，Da，F(xiàn)品系的基因特異性和構(gòu)建特異性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子及其qPCR檢測體系，為轉(zhuǎn)基因番茄Zeneca B，Da，F(xiàn)品系轉(zhuǎn)基因成分的監(jiān)測建立了可行的可供使用的定性與定量檢測體系，可對其在環(huán)境和其他番茄品系是否存在基因的逃逸等生態(tài)安全性情況進(jìn)行檢測。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102199599SQ201110092368
公開日2011年9月28日 申請日期2011年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月13日
發(fā)明者周倫彬, 周曉紅, 胡良勇, 麥榮嘉 申請人:廣州市計(jì)量檢測技術(shù)研究院