專利名稱：一種堿性蛋白酶的生產方法
技術領域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領域，具體涉及一種堿性蛋白酶的生產方法。
背景技術：
堿性蛋白酶(Alkaline Protease)屬內肽酶中的絲氨酸蛋白水解酶類，可以在堿性條件下水解蛋白質肽鍵，其最適作用PH—般為9 11，主要應用于加酶洗滌劑工業(yè)，在制革、絲綢、飼料、醫(yī)藥、食品、環(huán)保等工業(yè)也有廣泛的應用。目前，在世界范圍內蛋白分解酶是工業(yè)酶中用得最多的酶，約占酶總量的60%，其中堿性蛋白酶就占25%。它在商業(yè)中的巨大應用前景及在基礎研究中的重要作用，吸引著國際國內的許多公司及研究單位競相對其進行多方面的研究。研究室的前期研究通過低能N+離子注入技術誘變選育得到一株高產堿性蛋白酶的嗜堿芽孢桿菌，并通過正交試驗確定其最佳發(fā)酵培養(yǎng)基，其7L規(guī)模發(fā)酵罐酶活力達到 36000U/mL。清液發(fā)酵指培養(yǎng)基中不含固體不溶物，其發(fā)酵過程中傳質效果要優(yōu)于粗料發(fā)酵， 且降低后續(xù)分離純化的難度，可以極大降低生產成本。補料分批發(fā)酵與不補料分批發(fā)酵相比，特點在于使發(fā)酵系統(tǒng)中維持較低的基質濃度。低基質濃度的優(yōu)點①可以除去快速利用碳源的阻遏效應，并維持適當?shù)木w濃度，使不致于加劇供氧矛盾；②避免在培養(yǎng)基中積累有毒代謝物，即代謝阻遏。本發(fā)明中菌株的發(fā)酵周期55小時左右，產酶高峰期在對數(shù)生長末期，此時營養(yǎng)物質濃度較低，不利于產酶。采用高營養(yǎng)物質濃度發(fā)酵液發(fā)酵則會產生阻遏效應，抑制菌體的生長，同樣不利于產酶。同時發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源采用棉籽餅粉，雖利于產酶，但為粗料發(fā)酵， 原料利用率低，且含有大量微小顆粒，給后期酶的分離純化帶來困難。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足之處，提供一種堿性蛋白酶的生產方法， 本發(fā)明利用堿性蛋白酶高產菌株發(fā)酵生產堿性蛋白酶，采用清液發(fā)酵與補料分批發(fā)酵相結合的方法，本方法有效提高嗜堿芽孢桿菌產堿性蛋白酶的能力。本發(fā)明實現(xiàn)目的的技術方案如下一種堿性蛋白酶的生產方法，生產過程采用補料分批發(fā)酵的方法。
而且，發(fā)酵采用清液發(fā)酵。而且，發(fā)酵所用微生物為嗜堿芽孢桿菌Bacillus alcalophilus Y-22，保藏編號為CGMCC No. 5313，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。而且，發(fā)酵步驟如下(1)種子的培養(yǎng)從斜面上挑取一環(huán)新培養(yǎng)的嗜堿性芽孢桿菌Y-22接入種子培養(yǎng)液中(50mL種子培養(yǎng)基/250mL三角瓶)，200r/min, 34°C培養(yǎng)12h ；(2)發(fā)酵罐培養(yǎng)5% ν/ν接種量轉接至液體發(fā)酵培養(yǎng)基；溫度34°C;轉速250 450r/min ；通風量1 0. 5 1 1.5。發(fā)酵過程中自動流加氨水及20% ν/ν的鹽酸，使發(fā)酵液PH值維持在7.0;(3)補料分批發(fā)酵在堿性蛋白酶高產菌株發(fā)酵產堿性蛋白酶的過程中按一定的比生長速率流加補料培養(yǎng)基，發(fā)酵10-30小時控制比生長速率0. 121^,30-55小時控制比生長速率0. MT1。而且，所用發(fā)酵培養(yǎng)基配方為g/L 酵母浸粉17，麥芽糊精100g/L、檸檬酸鈉3g/L、 氯化鈣2. 6g/L、K2HP0418g/L、pH自然，標準棉籽餅粉水解液150mL/L。而且，所用補料培養(yǎng)基配方為麥芽糊精600g/L、檸檬酸鈉3g/L、氯化鈣2. 6g/L、 K2HP0418g/L、pH自然，標準棉籽餅粉水解液800mL/L。而且，所述標準棉籽餅粉水解液為棉籽餅粉經物理作用及酶水解后得到的上清液。而且，所述標準棉籽餅粉水解液的制備方法步驟如下(1)棉籽餅粉加干重2-5倍的水，高壓蒸煮20-30分鐘，除去對菌體生長有害的棉酚；(2)加入棉籽餅粉干重1-3% (w/w)復合酶制劑，45°C，120r/min,攪拌處理120分鐘；(3)板框過濾，濾液即為棉籽餅粉酶水解液；(4)將棉籽餅粉酶水解液中蛋白濃度稀釋為25g/L，即為標準棉籽餅粉酶水解液。而且，所述復合酶制劑為蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶和果膠酶的混合物。而且，所述復配比例為蛋白酶纖維素酶木聚糖酶果膠酶= 3 · 1. 5 · 2 · 5 · 2 ο本發(fā)明的優(yōu)點及積極效果是1、本發(fā)明提供一種堿性蛋白酶的生產方法，采用清液發(fā)酵與補料分批發(fā)酵相結合的方法，本方法有效提高嗜堿芽孢桿菌產堿性蛋白酶的能力，7L規(guī)模發(fā)酵罐酶活力達到 41000U/mL，較原始7L規(guī)模發(fā)酵罐酶活力36000U/mL提高了 13. 9%。2、本發(fā)明采用補料分批發(fā)酵可以減少底物抑制，解除底物的分解代謝物阻遏作用，減少抑制性副產物的形成，增加細胞濃度；同時產酶高峰期處于菌體對數(shù)生長末期，碳氮源濃度成為堿性蛋白酶生成的限制因素，因此流加碳氮源，適當提高發(fā)酵液中碳氮源濃度，可以提高其產酶活力，減少發(fā)酵時間。3、本發(fā)明首先通過高壓蒸煮的物理方法除去棉酚，然后使用蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶經嚴格配比而成的復合酶制劑，可最大限度的水解棉籽餅粉，使其營養(yǎng)物質充分溶于水中，同時減少后期分離純化的難度，降低了生產成本，獲得良好的經濟效益。


圖1為本發(fā)明堿性蛋白酶高產菌株的7L發(fā)酵罐發(fā)酵產酶曲線；圖2為本發(fā)明堿性蛋白酶高產菌株的7L發(fā)酵罐清液發(fā)酵與補料分批發(fā)酵相結合發(fā)酵產酶曲線。
具體實施方式
下面通過具體實施例對本發(fā)明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明采用補料分批發(fā)酵可以減少底物抑制，解除底物的分解代謝物阻遏作用， 減少抑制性副產物的形成，增加細胞濃度；同時產酶高峰期處于菌體對數(shù)生長末期，碳氮源濃度成為堿性蛋白酶生成的限制因素，因此流加碳氮源，適當提高發(fā)酵液中碳氮源濃度，可以提高其產酶活力。本發(fā)明同時采用清液發(fā)酵的方法，用棉籽餅粉酶水解液替代棉籽餅粉粗料，減少發(fā)酵液中不溶固體顆粒含量，有利于發(fā)酵傳質，提高原料的利用率，并減少下游分離純化的難度，降低生產成本。棉籽餅粉成分較為復雜，含有豐富的蛋白質及木質纖維素，使用單一水解酶水解較為困難，且含有一定量的棉酚，不利于菌體生長。本發(fā)明首先通過高壓蒸煮的物理方法除去棉酚，然后使用蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶經嚴格配比而成的復合酶制劑，可最大限度的水解棉籽餅粉，使其營養(yǎng)物質充分溶于水中。具體步驟如下1、水解棉籽餅粉復合酶的制備復合蛋白酶復配比例為蛋白酶纖維素酶木聚糖酶果膠酶= 3 · 1. 5 · 2 · 5 · 2 ο根據(jù)不同產地的棉籽餅粉所含物質的差別，可適當調節(jié)調節(jié)蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶比例，制成可最佳水解棉籽餅粉的復合酶制劑。2、棉籽餅粉酶水解液的制備(1)根據(jù)棉籽餅粉干重加2-5倍重量的水，高壓蒸煮25分鐘，除去對菌體生長有害的棉酚。(2)加入棉籽餅粉干重1-3% (w/w)的復合酶制劑，45°C，120r/min,攪拌處理120分鐘。(3)板框過濾，濾液即為棉籽餅粉酶水解液。(4)使用凱氏定氮法測定棉籽餅粉酶水解液中蛋白濃度，加適量水稀釋，將棉籽餅粉酶水解液中蛋白濃度稀釋為25g/L，即為標準棉籽餅粉酶水解液。3、培養(yǎng)基(1)保藏/活化培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏8，酵母浸粉2，多聚蛋白胨5，NaCl 2，瓊脂 17，酪蛋白 4，K2HPO418，pH 自然。(2)種子培養(yǎng)基(g/L)酵母浸粉5，胰蛋白胨5，葡萄糖，K2HPO4IS, pH自然。(3)液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)酵母浸粉17，麥芽糊精100，檸檬酸鈉3，氯化鈣2. 6， K2HPO4IS, pH自然，其中添加標準棉籽餅粉酶水解液150(mL/L)。(4)補料培養(yǎng)基(g/L)麥芽糊精600，檸檬酸鈉3，氯化鈣2. 6,K2HPO4IS,pH自然， 其中添加標準棉籽餅粉酶水解液800 (mL/L)。4、菌株本發(fā)明使用的菌種為嗜堿芽孢桿菌Bacillus alcalophilus，保藏編號為CGMCC No. 5313，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。5、種子的培養(yǎng)從斜面上挑取一環(huán)新培養(yǎng)的嗜堿性芽孢桿菌接入種子培養(yǎng)液中 (50mL 種子培養(yǎng)基 /250mL 三角瓶)，200r/min, ;34°C培養(yǎng) 12h。6、發(fā)酵過程
(1)7L發(fā)酵罐裝液量4L。(2)5% (ν/ν)接種量轉接至液體發(fā)酵培養(yǎng)基。(3)溫度34°C ；轉速250 450r/min ；通風量1 0. 5 1 1.5。發(fā)酵過程中自動流加氨水及20% (ν/ν)的鹽酸，使發(fā)酵液ρΗ值維持在7.0。(4)補料發(fā)酵發(fā)酵10-30小時控制比生長速率0. 13^1, 30-55小時控制比生長速率 0. 81Γ1。流加速率F (mL/h)由指數(shù)方程確定 [隱]咖X和S分別為發(fā)酵罐中細胞和底物質量濃度，g/L ； μ為生長速率，IT1 ；V為發(fā)酵液體積，L ;SF為補加底物的質量濃度，g/L ；Yx/S為細胞對底物的得率系數(shù)；(VX)tl為培養(yǎng)體系的初始細胞量，go7、堿性蛋白酶活力的測定取發(fā)酵液，6000r/min離心，取上清液測定酶活。采用《中華人民共和國輕工業(yè)標準》QB/T 1803-1993工業(yè)酶制劑通用實驗方法，即福林(Folin)法。7L規(guī)模發(fā)酵罐不補料發(fā)酵及補料發(fā)酵過程酶活分別如附圖1、附圖2所示?？梢园l(fā)現(xiàn)采用補料分批發(fā)酵與清液發(fā)酵相結合的發(fā)酵方法，可以提前產酶期，提高單位發(fā)酵酶活。 且發(fā)酵液中不含不溶性固體顆粒，為后期分離純化提供便利。
權利要求
1.一種堿性蛋白酶的生產方法，其特征在于生產過程采用補料分批發(fā)酵的方法。
2.根據(jù)權利要求1所述的堿性蛋白酶的生產方法，其特征在于發(fā)酵采用清液發(fā)酵。
3.根據(jù)權利要求1所述的堿性蛋白酶的生產方法，其特征在于發(fā)酵所用微生物為嗜堿芽孢桿菌Bacillus alcalophilus Y-22，保藏編號為=CGMCC No. 5313，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
4.根據(jù)權利要求3所述的堿性蛋白酶的生產方法，其特征在于發(fā)酵步驟如下(1)種子的培養(yǎng)從斜面上挑取一環(huán)新培養(yǎng)的嗜堿性芽孢桿菌Y-22接入種子培養(yǎng)液中 (50mL 種子培養(yǎng)基 /250mL 三角瓶)，200r/min, ;34°C培養(yǎng) 12h ；(2)發(fā)酵罐培養(yǎng)5%ν/ν接種量轉接至液體發(fā)酵培養(yǎng)基；溫度34°C ；轉速250 450r/min ；通風量1 0. 5 1 1.5。發(fā)酵過程中自動流加氨水及20% ν/ν的鹽酸，使發(fā)酵液PH值維持在7.0;(3)補料分批發(fā)酵在堿性蛋白酶高產菌株發(fā)酵產堿性蛋白酶的過程中按一定的比生長速率流加補料培養(yǎng)基，發(fā)酵10-30小時控制比生長速率0. 12^1, 30-55小時控制比生長速率 0. 61Γ1。
5.根據(jù)權利要求4所述的堿性蛋白酶的生產方法，其特征在于所用發(fā)酵培養(yǎng)基配方為g/L 酵母浸粉17，麥芽糊精100g/L、檸檬酸鈉3g/L、氯化鈣2. 6g/L、K2HP0418g/L、pH自然，標準棉籽餅粉水解液150mL/L。
6.根據(jù)權利要求4所述的堿性蛋白酶的生產方法，其特征在于所用補料培養(yǎng)基配方為麥芽糊精600g/L、檸檬酸鈉3g/L、氯化鈣2. 6g/L、K2HP0418g/L、pH自然，標準棉籽餅粉水解液800mL/L。
7.根據(jù)權利要求5或6所述的堿性蛋白酶的生產方法，其特征在于所述標準棉籽餅粉水解液為棉籽餅粉經物理作用及酶水解后得到的上清液。
8.根據(jù)權利要求7所述的堿性蛋白酶的生產方法，其特征在于所述標準棉籽餅粉水解液的制備方法步驟如下(1)棉籽餅粉加干重2-5倍的水，高壓蒸煮20-30分鐘，除去對菌體生長有害的棉酚；(2)加入棉籽餅粉干重1-3%w/w復合酶制劑，45°C，120r/min，攪拌處理120分鐘；(3)板框過濾，濾液即為棉籽餅粉酶水解液；(4)將棉籽餅粉酶水解液中蛋白濃度稀釋為25g/L，即為標準棉籽餅粉酶水解液。
9.根據(jù)權利要求7所述的堿性蛋白酶的生產方法，其特征在于所述復合酶制劑為蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶和果膠酶的混合物。
10.根據(jù)權利要求9所述的堿性蛋白酶的生產方法，其特征在于所述復合酶制劑的復配比例為蛋白酶纖維素酶木聚糖酶果膠酶=3 1. 5 2. 5 2。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種堿性蛋白酶的生產方法，其中菌株的分類命名為嗜堿芽孢桿菌Bacillus alcalophilus，保藏編號為CGMCC No.5313，本發(fā)明中發(fā)酵方法采用清液發(fā)酵與補料分批發(fā)酵相結合，將粗料棉籽餅粉制備為棉籽餅粉酶水解液，并采用流加碳氮源的發(fā)酵方式，有效的提高了發(fā)酵酶活，7L規(guī)模發(fā)酵罐酶活力達到41000U/mL，較原始7L規(guī)模發(fā)酵罐酶活力36000U/mL提高了13.9％，同時降低了后期酶分離純化的難度，降低了生產成本，并獲得良好的經濟效益。
文檔編號C12N9/54GK102517268SQ20111043777
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月23日 優(yōu)先權日2011年12月23日
發(fā)明者劉敏堯, 劉逸寒, 劉靚, 王建玲, 王春霞, 薄嘉鑫, 路福平 申請人:天津科技大學