一種高溫堿性蛋白酶及其制備方法
【專利摘要】一種高溫堿性蛋白酶及其制備方法，涉及蛋白酶。提供一種高溫堿性蛋白酶Fppro1及制備方法，以及高溫堿性蛋白酶基因Fppro1。高溫堿性蛋白酶Fppro1的生產(chǎn)菌株為太平洋火色桿菌Flammeovirga?Pacifica?H2。制備時，克隆高溫堿性蛋白酶基因Fppro1，將其插入表達(dá)載體，構(gòu)建攜帶高溫堿性蛋白酶基因Fppro1的重組表達(dá)載體；將高溫堿性蛋白酶基因Fppro1的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，選取陽性克隆于培養(yǎng)基中培養(yǎng)；離心收集發(fā)酵后的大腸桿菌BL21細(xì)胞，重懸大腸桿菌BL21細(xì)胞于裂解緩沖液中，將裂解后的懸液離心，收集上清液，再與Ni－NTA?Agarose混勻，純化。
【專利說明】一種高溫堿性蛋白酶及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及蛋白酶，特別涉及一種高溫堿性蛋白酶及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]堿性蛋白酶是指在pH值偏堿性范圍內(nèi)水解蛋白質(zhì)肽鍵的酶類，目前多來自芽孢桿菌蛋白酶，大部分屬于絲氨酸蛋白酶，它能水解蛋白質(zhì)分子肽鏈生成多肽或氨基酸，具有較強的分解蛋白質(zhì)的能力。
[0003]堿性蛋白酶最早發(fā)現(xiàn)于豬胰臟中，1913年，Rohm首先將胰島蛋白酶用于洗滌浸泡劑。1945年Jaag等在微生物中發(fā)現(xiàn)了堿性蛋白酶，使得該酶的研究與應(yīng)用得到快速發(fā)展。1963年，諾和諾德公司(現(xiàn)諾維信公司)發(fā)現(xiàn)了高效的、適用于洗滌劑的堿性蛋白酶Alcalase0目前用于洗漆劑的堿性蛋白酶商品也越來越多，例如諾維信公司的Sabinase、Kannase> Durazyme 等，花王公司的 KAP, GENENC0R 公司的 Properase CT, NOVO 公司的Savinase4.0T高溫堿性蛋白酶等。目前，蛋白酶是工業(yè)用酶中應(yīng)用得最多的一類酶，約占酶總量的60%，其中堿性蛋白酶就占了 25%。除了洗滌劑以外，它還廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療、釀造、絲綢、制革等行業(yè)。它在商業(yè)中的應(yīng)用前景，以及在科學(xué)研究中的重要作用使其得到研究人員和國內(nèi)外公司的長期關(guān)注。
[0004]最適作用溫度在30?40°C的中溫堿性蛋白酶和最適作用溫度低于30°C的低溫堿性蛋白酶在目前的研究報道和申請/授權(quán)的專利中最為常見。而最適作用溫度在50°C以上的高溫堿性蛋白酶的研究報道和申請/授權(quán)的專利較少。中國專利C N 103013960A提供了一種高溫堿性蛋白酶及其重組表達(dá)工程菌，其最適作用溫度為60°C，最適pH值為12。酶在添加了各種穩(wěn)定劑制成混合制劑后，在40°C下存放30天仍有95%的剩余酶活力，但沒有提供原始酶的熱穩(wěn)定性特征 。中國專利ZL200620111116.8提供一種耐高溫金屬蛋白酶基因工程菌及其獲得方法，其最 適 作用溫度為65°C，最適pH值為7.2，不屬于堿性蛋白酶，沒有提供熱穩(wěn)定性的特征。中國專利ZL200610069339.2提供一種高產(chǎn)耐高溫蛋白酶的蘇云金芽孢桿菌篩選及培養(yǎng)方法，其中所述的蛋白酶最適作用溫度為55°C，在55°C條件下Ih基本不失活，在60°C條件下Ih仍有60%以上的活力，沒有提供作用pH值的特征。
[0005]高溫堿性蛋白酶在高溫下能發(fā)揮最大催化效率，具有較好的熱穩(wěn)定性，比中溫和低溫堿性蛋白酶具有更廣泛的應(yīng)用價值。在實際應(yīng)用中，除了酶在不同溫度、不同pH條件下的活力之外，酶的穩(wěn)定性是評估應(yīng)用潛力的關(guān)鍵指標(biāo)之一，包括熱穩(wěn)定性、對有機溶劑的耐受性等。因此，堿性、熱穩(wěn)定的高溫蛋白酶具有重要的開發(fā)應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明旨在提供一種高溫堿性蛋白酶基因Fpprol。
[0007]本發(fā)明的第二個目的是提供一種由所述高溫堿性蛋白酶基因Fpprol編碼的重組高溫堿性蛋白酶FpproI。
[0008]本發(fā)明的第三個目的是提供一種所述重組高溫堿性蛋白酶Fpprol的制備方法。[0009]所述高溫堿性蛋白酶命名為Fpprol，其生產(chǎn)菌株為太平洋火色桿菌(Flammeovirga Pacifica)H2，該菌株已于2012年6月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏編號為:CCTCC NO:M2012229。
[0010]所述高溫堿性蛋白酶基因Fpprol的序列如下:
[0011]I ATGAAAAATA CAATTTCAAA AATCTTATTG GGTGCTGCTA TTTTTACCCA TATAGGTTTT
[0012]61 ACTGCAAACG CACAAGAAGA ACCTCGTAAA GAAGCTCCAA AGAATTGGTT TAACCTTAGC
[0013]121 TATGAACAAG ATGGTGTTTA TGGAGTTGGA ACCGAAAGAG CATACGACGA GATTTTAAAA
[0014]181 AATAAAAAAT CAAAAAAAGT TGTGGTTGCA GTGATTGATA GCGGAATCGA TATCGATCAT
[0015]241 GAAGATCTTA AGGACGTTAT CTGGAAAAAT AAAAAGGAAG TTGCAGGTAA CGGTAAAGAT
[0016]301 GATGATAACA ACGGTTATGT TGATGACGTA AACGGTTGGA ACTTTATTGG TGGTGCTGAT
[0017]361 GGATCAATGG TGAATGAAGA AAACCTTGAG GTAGCTCGTC TTTATGGAAA ACTTAGTAAG
[0018]421 AAGTTTGAAG GAGTAGCTGA AGGTGATGTA GCAAAAGCGG ATAAAAAAGA ATACACTTTG
[0019]481 TGGTTAGAAG TGAAAAAAGC TTTCGAAGAA GGCTACACTA AAGCAGAAGA AAACTATACA
[0020]541 CGTTACTCTA CATATTTACA CCAATTTCAA AGAGGAAAAG CATTATTTAT GGCTTATTTC
[0021]601 GATTTAGAAG ATGAAGGTGA AATTGTTGGT GCGTTAGAAT CATTTGATTC TAGTGATGAA.[0022]661 GTACTGATGG GAATGAAGGA GATGACATTA GGTCTTCTTT CACAAGGTGT TACAGATGAT
[0023]721 CAGCTTCAAG AAGGTGTTGA CTACTTTGAA GGTCAGGTGA AATCCAATTA TAATTATGAG
[0024]781 TTAAATACTC GTGAAATTGT TGGTGATGAT ATCGACAATA AGTCTCAAAG AGATTATGGT
[0025]841 AATAATAAAG TAACAGGTCC TGATGCTCTT CATGGTACTC ATGTTGCTGG AATTATTGCT
[0026]901 GCCTCAAGAG GAAATGAAAT TGGTATGGAT GGTGTTGCCG ACAATGTAGA AATTATGGTT
[0027]961 GTCAGAACTG TACCTAACGG TGATGAACGT GATAAAGATG TTGCAAATTC AATTATTTAT
[0028]1021 GCTGTTGATA ATGGTGCACA AATCATTAAT ATGAGCTTTG GTAAACCTTA TTCGCCATAC
[0029]1081 AAAGGAACAG TAGATAAAGC TGTTAAGTAT GCTGAATCAA AAGGAGTACT TCTAGTACAT
[0030]1141 GCCGCTGGTA ATGACCATAA GAATACAGAT AAAGGAAATA ATTTCCCAAG AGATAAATAT
[0031]1201 GATTCTGGCA AAACTGCAAA GAATTGGATA GAGGTTGGAG CATCAACTTG GATGACTGAT
[0032]1261 GAGAAACTCC CTGCAACGTT TTCTAACTAT GCTAAGAAAA GTGTAGACTT ATTTGCTCCA
[0033]1321 GGTTTTGATA TTTACTCAAC AATTCCAGGT TCAGAATATA CTAATTTAAA TGGTACAAGT
[0034]1381 ATGGCATGTC CTGTTGTTGC AGGTTGTGCA GCTGTATTAA TGTCATATTA TCCGAACTTG
[0035]1441 TCAGCAGTAC AAGTGAAGAA GATTTTAATG AAAACAGTAA CTCCATTGAA GAGTAAGGAA
[0036]1501 GTATTGTTAC CTGGTTATAA TAGTTTAGAA GAAGGTGAAG AGCCTCAAAA AGTTAAATTT
[0037]1561 GGATCATTAT CAGTAAGTGG TGGTGTAGTT AACTTATATG AAGCTGTAAA ATACGCTGAA
[0038]1621 AAGATCTCAA AATAG
[0039]所述高溫堿性蛋白酶基因Fpprol編碼的高溫堿性蛋白酶基因Fpprol的氨基酸序列如下:
[0040]I MKNTISKILL GAAIFTHIGF TANAQEEPRK EAPKNWFNLS YEQDGVYGVG
[0041]51 TERAYDEILK NKKSKKVVVA VIDSGIDIDH EDLKDVIffKN KKEVAGNGKD
[0042]101 DDNNGYVDDV NGffNFIGGAD GSMVNEENLE VARLYGKLSK KFEGVAE⑶V
[0043]151 AKADKKEYTL WLEVKKAFEE GYTKAEENYT RYSTYLHQFQ RGKALFMAYF
[0044]201 DLEDEGEIVG ALESFDSSDE VLMGMKEMTL GLLSQGVTDD QLQEGVDYFE[0045]251 GQVKSNYNYE LNTREIVGDD IDNKSQRDYG NNKVTGPDAL HGTHVAGIIA
[0046]301 ASRGNEIGMD GVADNVEIMV VRTVPNGDER DKDVANSIIY AVDNGAQIIN
[0047]351 MSFGKPYSPY KGTVDKAVKY AESKGVLLVH AAGNDHKNTD KGNNFPRDKY
[0048]401 DSGKTAKNWI EVGASTWMTD EKLPATFSNY AKKSVDLFAP GFDIYSTIPG
[0049]451 SEYTNLNGTS MACPVVAGCA AVLMSYYPNL SAVQVKKILM KTVTPLKSKE
[0050]501 VLLPGYNSLE EGEEPQKVKF GSLSVSGGVV NLYEAVKYAE KISK
[0051]所述高溫堿性蛋白酶基因Fpprol的制備方法包括以下步驟:
[0052]I)克隆高溫堿性蛋白酶基因Fpprol ；
[0053]2)將高溫堿性蛋白酶基因Fpprol插入表達(dá)載體，構(gòu)建攜帶所述高溫堿性蛋白酶基因Fpprol的重組表達(dá)載體；
[0054]3)將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(E.coli) BL21中；
[0055]4)選取轉(zhuǎn)化后E.coli BL21中的陽性克隆于培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；
[0056]5)離心收集發(fā)酵后的E.coli BL21細(xì)胞，重懸所述E.coli BL21細(xì)胞于裂解緩沖液中進(jìn)行裂解；
[0057]6)將步驟5)中裂解后的懸液離心，收集上清液，再與N1-NTA Agarose混勻，按照純化試劑盒說明書進(jìn)行純化，即得高溫堿性蛋白酶基因Fpprol。
[0058]在步驟2)中,所述表達(dá)載體可選自pCold I載體等。
[0059]在步驟4)中，所述培養(yǎng)基可選自含有ΙΟΟμ g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件可為:溫度為37° C，搖床培養(yǎng)至A6tltl=0.6時，再加入異丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG)至終濃度為50ymol/L，在16° C條件下誘導(dǎo)12h。
[0060]在步驟5)中，所述裂解緩沖液配方可為:0.3mol/L NaCl, 10mmol/L咪唑,50mmol/LNaH2PO4? ρΗ8.0。
[0061]在步驟6)中，所述離心的條件可為18000父8，離心2011 11，41:。
[0062]本發(fā)明具有以下突出優(yōu)點:
[0063]1.所述高溫堿性蛋白酶Fpprol具有新的基因序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫中沒有相似的完整ORF基因序列。
[0064]2.所述高溫堿性蛋白酶Fpprol能夠在E.coli中穩(wěn)定表達(dá)，誘導(dǎo)后上清液中酶的活力可達(dá)38600U/mL。重組酶Fpprol的最適作用溫度為60°C，在40?70°C范圍內(nèi)能保持60°C以上的活力，在50?65°C范圍內(nèi)保持約90 %以上的活力，具有較寬的作用溫度范圍。
[0065]3.重組酶Fpprol具有很好的熱穩(wěn)定性:在不加任何穩(wěn)定劑的條件下，在30°C下至少保持24h不失活；在40°C下12h后酶活力剩余95%以上；50°C下保溫Ih后活力反而有略微的上升，2h后活力可保持85%，4h后保持約75% ；60 C保溫Ih仍能保持約65%的活力。
[0066]4.最適作用pH值為9，在pH8?10范圍內(nèi)能保持80%以上的活力；在pH7時能保持約65%的活力，具有較寬的pH作用范圍。
[0067]由于上述特征，本發(fā)明中所述高溫堿性蛋白酶Fpprol可廣泛應(yīng)用于洗滌、食品、
制革等工業(yè)中。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0068]圖1為高溫堿性蛋白酶基因Fpprol重組表達(dá)純化的SDS-PAGE圖譜。在圖1中，M為蛋白Marker,泳道I為重組載體pColdl-Fpprol在E.coli BL21中的表達(dá)(未進(jìn)行誘導(dǎo)),泳道2為經(jīng)N1-NTA純化所得的目的蛋白FpproI(?60kDa)，泳道3為重組載體pCoId1-FpproI在E.coli BL21中的誘導(dǎo)表達(dá)。
[0069]圖2為重組酶Fpprol的最適作用溫度。在圖2中，橫坐標(biāo)為溫度(°C )，縱坐標(biāo)為酶的相對活性(％)。
[0070]圖3為重組酶Fpprol的熱穩(wěn)定性。在圖3中，橫坐標(biāo)為保溫時間(h)，縱坐標(biāo)為酶的相對活力(％);各標(biāo)記為:300C ；.400C ；? 500C ；W60V+Ca2'； A60V-,來70V?
[0071]圖4為重組酶Fpprol的最適作用pH值。在圖4中，橫坐標(biāo)為pH值，縱坐標(biāo)為酶的相對活性(％)。
【具體實施方式】
[0072]下面結(jié)合具體實施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如分子克隆實驗室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)中所述的實驗條件，或按照試劑或儀器生產(chǎn)廠商所建議的條件。
[0073]用于制備所述高溫堿性蛋白酶基因Fpprol的生產(chǎn)菌株為太平洋火色桿菌(Flammeovirga Pacifica) H2。該菌株已于2012年6月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏編號為:CCTCC NO:M2012229。
[0074]1.高溫堿性蛋白酶Fpprol的制備
[0075]I) Flammeovirga Pacifica H2 基因組 DNA 的提取
[0076]用接種環(huán)挑取_80°C保存的Flammeovirga Pacifica H2菌種,在LB培養(yǎng)基平板(一種細(xì)菌培養(yǎng)基，含有1%的胰蛋白胨，1%的氯化鈉，0.5%的酵母提取物，1.5%的瓊膠糖)上劃線分離單菌落。劃線后的平板置37°C培養(yǎng)過夜，挑取一個單菌落接種到5mL的LB培養(yǎng)液管中(一種細(xì)菌培養(yǎng)基，含有1%的胰蛋白胨，1%的氯化鈉，0.5%的酵母提取物)，37°C搖動培養(yǎng)過夜。取1.5mL的培養(yǎng)物2000r/min離心2min ;再加入500μ L6mol/L鹽酸胍，輕輕混勻，直至裂解清亮(可酌量增加鹽酸胍用量)；加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，混勻，15000r/min離心4?5min，將上層水相移入新管；緩慢加入等體積異丙醇，混勻后放置5min ；15000r/min離心15s,去除上清，沉淀用70%乙醇洗兩次，吹干；加入200 μ L TE溶液(10mmol/L Tris-HCl, lmmol/LEDTA)，2 μ L RNase A, 37°C酶解 Ih ;加入 120 μ L 異丙醇，
2μ Llmol/L MgCl2,輕輕混勻,靜置IOmin ；15000r/min離心5min,去除上清,沉淀用70%乙醇洗兩次，吹干；沉淀溶解于50 μ L TE溶液。
[0077]2)高溫堿性蛋白酶基因Fpprol的PCR擴增和序列分析
[0078]根據(jù)Flammeovirga Pacifica H2菌株基因組測序后的基因注釋結(jié)果,設(shè)計引物F:5’ -CGGGATCC ATG AAA AAT ACA ATT TCA-3’(劃線為 BamH I 酶切位點)(SEQIDN0.3)和R:5，-ACAAGCTT CTA TTT TGA GAT CTT TTC-3，(劃線為 Hind III 酶切位點)(SEQIDN0.4)。以提取的Flammeovirga Pacifica H2基因組DNA為模板,用引物F和R擴增全長的Fpprol基因。PCR反應(yīng)條件為:在5的反應(yīng)體系中含有，1001模板，400111110/1引物，400111110/L 引物 R，200ymo/L dNTP,2.5mmo/L Mg2+，5U Primer Star HSTaq 酶(購自 TaKaRa 公司)，5mL10XPCR 反應(yīng)緩沖液；反應(yīng)條件:94°C 5min 預(yù)變性；98°C 10s、55°C 45s,72°C 2min 循環(huán)30圈；72°C延伸lOmin。所得PCR產(chǎn)物純化后用BamH I和Hind III進(jìn)行酶切，并與同樣用BamH I和Hind III酶切后的pColdl載體連接，得到pColdl-Fpprol表達(dá)載體，采用CaCl2法將pColdl-Fpprol轉(zhuǎn)化到E.coli DH5 α中，挑取陽性克隆進(jìn)行測序。
[0079]3)重組酶Fpprol的表達(dá)和純化
[0080]將步驟2)中獲得的序列正確的重組表達(dá)載體pColdl-Fpprol轉(zhuǎn)化E.coli BL21,選取陽性克隆在含100 μ g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37° C搖培至A6tltl = 0.6時，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至終濃度100μπιΟ1/1，16° C誘導(dǎo)12h后將菌液收集至200mL的離心管中，5000 Xg離心沉淀細(xì)菌細(xì)胞。將細(xì)菌細(xì)胞重新懸浮在20mL的裂解緩沖液(裂解緩沖液配方為:0.3mol/L NaCl，IOmmoI/L 咪唑，50mmol/L NaH2PO4, pH8.0)中，超聲波處理至菌液成半透明，18000 Xg離心20min，上清與預(yù)先用裂解緩沖液平衡的N1-NTAAgarose混勻,4° C結(jié)合I小時,純化過程按照純化試劑盒(購自Qiagen公司)說明進(jìn)行。純化的蛋白經(jīng)12%的SDS-PAGE電泳分析，其分子量約為60kDa，純度達(dá)95%以上(結(jié)果參見圖1)
[0081]2.重組酶Fpprol基本酶學(xué)性質(zhì)分析的實施例
[0082]I)蛋白酶活力的測定方法
[0083]以酪蛋白為底物，采用福林酚法測定。所用溶液包括:福林使用溶液(一份市售福林溶液與兩份水混合，搖勻)，碳酸鈉溶液(42.4g/L)，三氯乙酸(65.4g/L)，梯度pH值緩沖液，酪蛋白溶液(10.0g/L)。反應(yīng)過程如下:在1.5mL小離心管中加入800 μ L酪蛋白溶液，放入已調(diào)至反應(yīng)溫度的水浴鍋中預(yù)熱5min，加入200 μ L酶液，緩慢搖勻，放回水浴鍋中反應(yīng)lOmin。加入270 μ L三氯乙酸，混合均勻以終止反應(yīng)。
[0084]另外設(shè)置一對照管，.在對照管中加入800 μ L酪蛋白溶液，放入已調(diào)至反應(yīng)溫度的水浴鍋中預(yù)熱5min，加入200 μ L水，緩慢搖勻，放回水浴鍋中反應(yīng)lOmin。加入270 μ L三氯乙酸和用100°C處理5min后的酶液,混合均勻。
[0085]將實驗管和對照管以13，000r/min離心2min，分別取ImL上清液于相應(yīng)編號的空試管中，之后再依次加入5mL碳酸鈉溶液和0.5mL福林使用溶液,混勻后于40° C水浴顯色20min。測定各管的OD68tl值。并從已做好的Tyr標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出反應(yīng)中產(chǎn)生的Tyr的量，計算酶活。
[0086]蛋白酶活力單位(U)的定義為每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生I μ g酪氨酸所需的酶量。
[0087]2)重組酶Fpprol的最適作用溫度分析
[0088]采用Tris-HCl緩沖液(pH8.0)，將經(jīng)純化后的重組酶Fpprol在不同溫度下進(jìn)行酶促反應(yīng)并測定酶活。以最高酶活為100%，計算相對酶活，繪制溫度一相對酶活曲線(見圖
2)。結(jié)果表明本發(fā)明中的重組酶Fpprol的最適作用溫度為60°C，且具有較寬的作用溫度范圍:在40°C?70°C范圍內(nèi)能保持60°C以上的活力；在50°〇?65°C范圍內(nèi)保持約90%以上的活力；在30°C時可保持約40%的活力。
[0089]3)重組酶Fpprol的熱穩(wěn)定性分析
[0090]采用Tris-HCl緩沖液(pH8.0)，將經(jīng)純化后的重組酶Fpprol在不同溫度下保溫一定時間，然后進(jìn)行酶促反應(yīng)，測定剩余蛋白酶的活力，檢測在最適反應(yīng)溫度下反應(yīng)。繪制保溫時間一相對活力曲線(見圖3)。結(jié)果表明本發(fā)明中的重組酶Fpprol具有非常好的熱穩(wěn)定性。在30°C下保溫24h后活力沒有喪失；在40°C下12h后酶活力剩余95%以上；50°C下保溫Ih后活力反而有略微的上升，2h后活力可保持85 %, 4h后保持約75 %, 8h后可保持約50%的活力；60°C保溫Ih酶活剩余約65%，2h后酶活剩余40%。
[0091]在Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中添加0.lmmol/L Ca2+，再按相同步驟檢測重組酶Fpprol在60°C下的穩(wěn)定性(圖3),結(jié)果表明Ca2+顯著提高重組酶Fpprol的熱穩(wěn)定性,在60°C保溫Ih后酶活剩余76%，保溫2h后剩余酶活為65%，均比沒有Ca2+時的65%和40%聞。
[0092]目前為止的研究報道和申請/授權(quán)的專利中，如果不添加穩(wěn)定劑，初始蛋白酶在40°C以上的熱穩(wěn)定性都較差，最好的一種是中國專利ZL200610069339.2所提供的由蘇云金芽孢桿菌所產(chǎn)的耐高溫蛋白酶，其最適作用溫度為55°C，在55°C條件下Ih基本不失活，在60°C條件下Ih剩余活力為60%。因此本發(fā)明中的重組酶Fpprol具有非常突出的熱穩(wěn)定性。
[0093]4)重組酶Fpprol的最適作用pH分析
[0094]經(jīng)純化的重組酶Fpprol在不同pH值的緩沖液中，于60°C下進(jìn)行反應(yīng)以測定其最適pH，以最高酶活為100%，計算相對酶活，繪制pH —相對酶活曲線(見圖4)。結(jié)果表明本發(fā)明中的重組酶Fpprol的最適作用pH值為9，在pH8?10范圍內(nèi)能保持80%以上的活力；在PH7時能保持約65%的活力，具`有較寬的pH作用范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種高溫堿性蛋白酶，其特征在于所述高溫堿性蛋白酶命名為Fpprol，其生產(chǎn)菌株為太平洋火色桿菌(Flammeovirga Pacifica)H2,該菌株已于2012年6月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏編號為=CCTCC NO:M2012229。
2.如權(quán)利要求1所述一種高溫堿性蛋白酶，其特征在于高溫堿性蛋白酶基因Fpprol的序列如下:
I ATGAAAAATA CAATTTCAAA AATCTTATTG GGTGCTGCTA TTTTTACCCA TATAGGTTTT
61 ACTGCAAACG CACAAGAAGA ACCTCGTAAA GAAGCTCCAA AGAATTGGTT TAACCTTAGC
121 TATGAACAAG ATGGTGTTTA TGGAGTTGGA ACCGAAAGAG CATACGACGA GATTTTAAAA
181 AATAAAAAAT CAAAAAAAGT TGTGGTTGCA GTGATTGATA GCGGAATCGA TATCGATCAT
241 GAAGATCTTA AGGACGTTAT CTGGAAAAAT AAAAAGGAAG TTGCAGGTAA CGGTAAAGAT
301 GATGATAACA ACGGTTATGT TGATGACGTA AACGGTTGGA ACTTTATTGG TGGTGCTGAT
361 GGATCAATGG TGAATGAAGA AAACCTTGAG GTAGCTCGTC TTTATGGAAA ACTTAGTAAG
421 AAGTTTGAAG GAGTAGCTGA AGGTGATGTA GCAAAAGCGG ATAAAAAAGA ATACACTTTG
481 TGGTTAGAAG TGAAAAAAGC TTTCGAAGAA GGCTACACTA AAGCAGAAGA AAACTATACA
541 CGTTACTCTA CATATTTACA CCAATTTCAA AGAGGAAAAG CATTATTTAT GGCTTATTTC
601 GATTTAGAAG ATGAAGGTGA AATTGTTGGT GCGTTAGAAT CATTTGATTC TAGTGATGAA
661 GTACTGATGG GAATGAAGGA GATGACATTA GGTCTTCTTT CACAAGGTGT TACAGATGAT
721 CAGCTTCAAG AAGGTGTTGA CTACTTTGAA GGTCAGGTGA AATCCAATTA TAATTATGAG
781 TTAAATACTC GTGAAATTGT TGGTGATGAT ATCGACAATA AGTCTCAAAG AGATTATGGT
841 AATAATAAAG TAACAGGTCC TGATGCTCTT CATGGTACTC ATGTTGCTGG AATTATTGCT
901 GCCTCAAGAG GAAATGAAAT TGGTATGGAT GGTGTTGCCG ACAATGTAGA AATTATGGTT
961 GTCAGAACTG TACCTAACGG TGATGAACGT GATAAAGATG TTGCAAATTC AATTATTTAT
1021 GCTGTTGATA ATGGTGCACA AATCATTAAT ATGAGCTTTG GTAAACCTTA TTCGCCATAC
1081 AAAGGAACAG TAGATAAAGC TGTTAAGTAT GCTGAATCAA AAGGAGTACT TCTAGTACAT
1141 GCCGCTGGTA ATGACCATAA GAATACAGAT AAAGGAAATA ATTTCCCAAG AGATAAATAT
1201 GATTCTGGCA AAACTGCAAA GAATTGGATA GAGGTTGGAG CATCAACTTG GATGACTGAT
1261 GAGAAACTCC CTGCAACGTT TTCTAACTAT GCTAAGAAAA GTGTAGACTT ATTTGCTCCA
1321 GGTTTTGATA TTTACTCAAC AATTCCAGGT TCAGAATATA CTAATTTAAA TGGTACAAGT
1381 ATGGCATGTC CTGTTGTTGC AGGTTGTGCA GCTGTATTAA TGTCATATTA TCCGAACTTG
1441 TCAGCAGTAC AAGTGAAGAA GATTTTAATG AAAACAGTAA CTCCATTGAA GAGTAAGGAA
1501 GTATTGTTAC CTGGTTATAA TAGTTTAGAA GAAGGTGAAG AGCCTCAAAA AGTTAAATTT
1561 GGATCATTAT CAGTAAGTGG TGGTGTAGTT AACTTATATG AAGCTGTAAA ATACGCTGAA
1621 AAGATCTCAA AATAG0
3.如權(quán)利要求1所述一種高溫堿性蛋白酶，其特征在于高溫堿性蛋白酶基因Fpprol編碼的高溫堿性蛋白酶基因Fpprol的氨基酸序列如下:
I MKNTISKILL GAAIFTHIGF TANAQEEPRK EAPKNWFNLS YEQDGVYGVG
.51 TERAYDEILK NKKSKKVVVA VIDSGIDIDH EDLKDVIffKN KKEVAGNGKD
.101 DDNNGYVDDV NGffNFIGGAD GSMVNEENLE VARLYGKLSK KFEGVAE⑶V
.151 AKADKKEYTL WLEVKKAFEE GYTKAEENYT RYSTYLHQFQ RGKALFMAYF` 201 DLEDEGEIVG ALESFDSSDE VLMGMKEMTL GLLSQGVTDD QLQEGVDYFE
`251 GQVKSNYNYE LNTREIVGDD IDNKSQRDYG NNKVTGPDAL HGTHVAGIIA
`301 ASRGNEIGMD GVADNVEIMV VRTVPNGDER DKDVANSIIY AVDNGAQIIN
`351 MSFGKPYSPY KGTVDKAVKY AESKGVLLVH AAGNDHKNTD KGNNFPRDKY
`401 DSGKTAKNWI EVGASTWMTD EKLPATFSNY AKKSVDLFAP GFDIYSTIPG
`451 SEYTNLNGTS MACPVVAGCA AVLMSYYPNL SAVQVKKILM KTVTPLKSKE
`501 VLLPGYNSLE EGEEPQKVKF GSLSVSGGVV NLYEAVKYAE KISK0
4.高溫堿性蛋白酶基因Fpprol的制備方法，其特征在于包括以下步驟: 1)克隆高溫堿性蛋白酶基因Fpprol； 2)將高溫堿性蛋白酶基因Fpprol插入表達(dá)載體，構(gòu)建攜帶所述高溫堿性蛋白酶基因Fpprol的重組表達(dá)載體； 3)將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(E.coli)BL21中； 4)選取轉(zhuǎn)化后E.coli BL21中的陽性克隆于培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)； 5)離心收集發(fā)酵后的E.coli BL21細(xì)胞，重懸所述E.coli BL21細(xì)胞于裂解緩沖液中進(jìn)行裂解； 6)將步驟5)中裂解后的懸液離心`，收集上清液，再與N1-NTAAgarose混勻，按照純化試劑盒說明書進(jìn)行純化，即得高溫堿性蛋白酶基因Fpprol。
5.如權(quán)利要求4所述高溫堿性蛋白酶基因Fpprol的制備方法，其特征在于在步驟2)中，所述表達(dá)載體選自pCold I載體。
6.如權(quán)利要求4所述高溫堿性蛋白酶基因Fpprol的制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述培養(yǎng)基選自含有IOOy g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基。
7.如權(quán)利要求4所述高溫堿性蛋白酶基因Fpprol的制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件為:溫度為37°C，搖床培養(yǎng)至A_ = 0.6時，再加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷至終濃度為50ymol/L，在16°C條件下誘導(dǎo)12h。
8.如權(quán)利要求4所述高溫堿性蛋白酶基因Fpprol的制備方法，其特征在于在步驟5)中，所述裂解緩沖液配方為:0.3mol/L NaCl，10mmol/L 咪唑，50mmol/L NaH2PO4, pH8.0。
9.如權(quán)利要求4所述高溫堿性蛋白酶基因Fpprol的制備方法，其特征在于在步驟6)中，所述離心的條件為18000 Xg,離心20min,4°C。
【文檔編號】C12N15/57GK103436511SQ201310268933
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年6月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月28日
【發(fā)明者】曾潤穎, 徐輝 申請人:國家海洋局第三海洋研究所