重組成對堿性氨基酸蛋白酶的制劑的制作方法
【專利摘要】本申請?zhí)峁┏蓪A性氨基酸蛋白酶(例如，重組成對堿性氨基酸蛋白酶)的穩(wěn)定化制劑，所述制劑含有糖、糖醇、和/或非離子型表面活性劑。與非穩(wěn)定化組合物相比，本發(fā)明所公開的成對堿性氨基酸蛋白酶制劑在儲存和/或經受機械應力時保留較大量的成對堿性氨基酸蛋白酶活性和單體成對堿性氨基酸蛋白酶含量，同時減少成對堿性氨基酸蛋白酶聚集。還提供用于穩(wěn)定地稀釋成對堿性氨基酸蛋白酶(例如，重組成對堿性氨基酸蛋白酶)組合物的方法。
【專利說明】重組成對堿性氨基酸蛋白酶的制劑
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求2011年6月2日提交的美國臨時申請?zhí)?1/492，712的權益，出于所有的目的，所述申請的內容明確地以引用的方式整體并入本文。
[0003]應用領域
[0004]本申請總體上涉及蛋白質制劑的領域。
[0005]發(fā)明背景
[0006]蛋白水解哺乳動物枯草桿菌蛋白酶樣蛋白原轉化酶(SPC或PC)家族與細菌枯草桿菌蛋白酶和酵母Kex2p同源。迄今為止，已經鑒別出SPC家族的七個不同成員，包括成對堿性氨基酸蛋白酶(furin)、PC1 (還稱為 PC3)、PC2、PACE4、PC4、PC5 (還稱為 PC6)、PC7(LPC、PC8、或SPC7)，其各自展現出獨特的組織分布。
[0007]成對堿性氨基酸蛋白酶，還稱為PACE (成對堿性氨基酸裂解酶)普遍表達于所有哺乳動物組織和細胞系中，并且能夠加工分泌途徑中的廣泛范圍的生物活性前體蛋白，還包括激素、生長因子、受體、病毒和細菌蛋白、以及血漿蛋白。它是結構上安排成幾個域的鈣依賴性絲氨酸內切蛋白酶，所述域即信號肽、前肽、催化結構域、中間結構域(還稱為homo-B或P結構域)、C末端定位的富含半胱氨酸的結構域、跨膜結構域以及胞質尾區(qū)。成對堿性氨基酸蛋白酶的蛋白酶裂解位點包含識別序列，其特征為氨基酸序列Arg-X-Lys/Arg-Arg (Hosaka 等，J Biol Chem.1991;266:12127-30)。
[0008]成對堿性氨基酸蛋白酶屬于蛋`白原轉化酶家族并且依賴于鈣(Ca2+)。成對堿性氨基酸蛋白酶特異性地裂解在I位和4位處含有精氨酸的特定序列內的C末端的精氨酸肽鍵。這種序列可以在許多人蛋白質中發(fā)現，從而表明成對喊性氣基Ife蛋白酶在多種人蛋白原的成熟過程中起著重要作用。因此，成對堿性氨基酸蛋白酶是將潛在的前體蛋白加工成其生物活性產物的蛋白原轉化酶。成對堿性氨基酸蛋白酶是使前體蛋白在其成對堿性氨基酸加工位點處裂解的鈣依賴性絲氨酸內切蛋白酶。成對堿性氨基酸蛋白酶的一種底物是馮.維勒布蘭德(von Willebrand)因子(vffF)。
[0009]成對堿性氨基酸蛋白酶(例如，重組成對堿性氨基酸蛋白酶)能夠通過裂解VWF的Arg741-Ser742肽鍵來將前VWF (原馮?維勒布蘭德因子)轉化成成熟VWF。這一成熟步驟是(例如)提供馮.維勒布蘭德病B型的療法的rVWF產生過程的一部分。活化重組蛋白質的產生具有高度臨床和診斷重要性。例如，活性或成熟蛋白質(像成熟VWF)可以用于控制凝血。
[0010]成對堿性氨基酸蛋白酶制劑,特別是重組成對堿性氨基酸蛋白酶(recombinantfurin)(重組成對堿性氨基酸蛋白酶(rfurin))制劑經常由于來自蛋白質降解(經常來自成對堿性氨基酸蛋白酶蛋白質的自身裂解)的重組成對堿性氨基酸蛋白酶活性損失而具有較短的保質期(少于6個月)。此外，當用于某些產生過程(如產生成熟vWF)時，重組成對堿性氨基酸蛋白酶制劑經常被稀釋200倍，并且稀釋的重組成對堿性氨基酸蛋白酶通常顯示不成比例的活性損失。因此，在本領域中需要使成對堿性氨基酸蛋白酶(例如，重組成對堿性氨基酸蛋白酶)組成物穩(wěn)定化的方法和制劑，以及用于稀釋濃成對堿性氨基酸蛋白酶(例如，重組成對堿性氨基酸蛋白酶)組合物而不損失大部分成對堿性氨基酸蛋白酶活性的方法。
[0011]發(fā)明概述
[0012]通過提供用于使成對堿性氨基酸蛋白酶(例如，重組成對堿性氨基酸蛋白酶組合物)穩(wěn)定化的方法和制劑，本公開實現了成對堿性氨基酸蛋白酶(例如，重組成對堿性氨基酸蛋白酶)配制、儲存、以及操作領域中的這些和其它需求。通過添加糖、糖醇和/或非離子型表面活性劑顯著增加成對堿性氨基酸蛋白酶(例如，重組成對堿性氨基酸蛋白酶)組合物在儲存和機械應力過程中的穩(wěn)定性的發(fā)現，使這些需求至少部分地得到滿足。
[0013]因此，本發(fā)明提供高度穩(wěn)定化的成對堿性氨基酸蛋白酶制劑，特別是高度穩(wěn)定化的重組成對堿性氨基酸蛋白酶制劑，所述重組成對堿性氨基酸蛋白酶制劑與起始(對照)成對堿性氨基酸蛋白酶制劑相比在高溫、攪拌以及不同PH條件下顯示出增加的穩(wěn)定性。
[0014]一方面,本公開提供一種重組成對堿性氨基酸蛋白酶(recombinant furin)(重組成對堿性氨基酸蛋白酶(rfurin))的穩(wěn)定化水性組合物,所述組合物包含:8，000U/mL至500，000U/mL重組成對堿性氨基酸蛋白酶；100mM至300mM藥學上可接受的鹽；0.5mM至2mM鈣；2%至20%糖或糖醇；10ppm至200ppm非離子型表面活性劑；IOmM至200mM緩沖劑；以及5.5 至 7.5 的 pH。
[0015]在一個實施方案中，以上所提供的組合物包含150mM至250mM藥學上可接受的鹽。在另一個實施方案中，以上所提供的組合物包含190± IOmM藥學上可接受的鹽。在另一個實施方案中，以上所提供的組合物包含190mM藥學上可接受的鹽。
[0016]在以上所提供的組合物的一個實施方案中，藥學上可接受的鹽是氯化鈉。在以上所提供的組合物的另一個實施方案中，藥學上可接受的鹽是氯化鉀。
[0017]在一個實施方案中，以上所提供的組合物包含0.9±0.2mM鈣。在另一個實施方案中，以上所提供的組合物包含0.92mM鈣。
[0018]在一個實施方案中，以上所提供的組合物包含5%至15%糖或糖醇。在另一個實施方案中，以上所提供的組合物包含10±2%糖或糖醇。在另一個實施方案中，以上所提供的組合物包含10%糖或糖醇。
[0019]在以上所提供的組合物的一個實施方案中，糖或糖醇選自由蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其組合組成的組。在以上所提供的組合物的另一個實施方案中，糖或糖醇是海藻糖。在以上所提供的組合物的另一個實施方案中，糖或糖醇是蔗糖。
[0020]在一個實施方案中，以上所提供的組合物包含IOppm至IOOppm非離子型表面活性劑。在另一個實施方案中，以上所提供的組合物包含50ppm至IOOppm非離子型表面活性劑。在另一個實施方案中，以上所提供的組合物包含75ppm非離子型表面活性劑。
[0021]在以上所提供的組合物的一個實施方案中，非離子型表面活性劑是聚山梨酯80。
[0022]在一個實施方案中，以上所提供的組合物包含50mM至150mM緩沖劑。在另一個實施方案中，以上所提供的組合物包含90± IOmM緩沖劑。在另一個實施方案中，以上所提供的組合物包含9ImM緩沖劑。
[0023]在以上所提供的組合物的一個實施方案中，緩沖劑包含乙酸鹽。在以上所提供的組合物的另一個實施方案中， 緩沖劑包含HEPES。在以上所提供的組合物的另一個實施方案中，緩沖劑包含MES。在以上所提供的組合物的另一個實施方案中，緩沖劑包含乙酸鹽和HEPES。
[0024]在一個實施方案中，以上所提供的組合物包含25mM至75mM乙酸鹽和25mM至75mMHEPES。在另一個實施方案中，以上所提供的組合物包含45±5mM乙酸鹽和45±5mM HEPES。在另一個實施方案中，以上所提供的組合物包含45mM乙酸鹽和46mM HEPES。
[0025]在一個實施方案中，以上所提供的組合物具有5.5至7.0的pH。在另一個實施方案中，以上所提供的組合物具有5.5至6.5的pH。在另一個實施方案中，以上所提供的組合物具有6.0±0.2的pH。在另一個實施方案中，以上所提供的組合物具有6.0的pH。
[0026]在以上所提供的組合物的一個實施方案中，組合物與不含糖或糖醇的重組成對堿性氨基酸蛋白酶組合物相比在于37°C下儲存時具有增加的穩(wěn)定性。
[0027]在以上所提供的組合物的一個實施方案中，組合物與不含糖或糖醇的重組成對堿性氨基酸蛋白酶組合物相比在于37°C下儲存時維持較高的重組成對堿性氨基酸蛋白酶活性百分比。
[0028]在以上所提供的組合物的一個實施方案中，組合物與不含糖或糖醇的重組成對堿性氨基酸蛋白酶組合物相比在于37°C下儲存時維持較高的重組成對堿性氨基酸蛋白酶單體含量百分比。
[0029]在以上所提供的組合物的一個實施方案中，組合物與不含非離子型表面活性劑的重組成對堿性氨基酸蛋白酶組合物相比在攪拌時具有增加的穩(wěn)定性。
[0030]在以上所提供的組合物的一個實施方案中，組合物與不含非離子型表面活性劑的重組成對堿性氨基酸蛋白酶組合物相比在攪拌時維持較高的重組成對堿性氨基酸蛋白酶活性百分比。
[0031]在以上所提供的組合物的一`個實施方案中，組合物與不含非離子型表面活性劑的重組成對堿性氨基酸蛋白酶組合物相比在攪拌時維持較高的重組成對堿性氨基酸蛋白酶單體含量百分比。
[0032]在以上所提供的組合物的一個實施方案中，組合物與不含非離子型表面活性劑的重組成對堿性氨基酸蛋白酶組合物相比在稀釋時具有增加的穩(wěn)定性。
[0033]在以上所提供的組合物的一個實施方案中，組合物與不含非離子型表面活性劑的重組成對堿性氨基酸蛋白酶組合物相比在稀釋時維持較高的重組成對堿性氨基酸蛋白酶活性百分比。
[0034]在以上所提供的組合物的一個實施方案中，組合物與不含非離子型表面活性劑的重組成對堿性氨基酸蛋白酶組合物相比在稀釋時維持較高的重組成對堿性氨基酸蛋白酶單體含量百分比。
[0035]一方面,本公開提供一種重組成對堿性氨基酸蛋白酶(recombinant furin)(重組成對堿性氨基酸蛋白酶(rfurin))的穩(wěn)定化水性組合物,所述組合物包含:8，000U/mL至500，000U/mL重組成對堿性氨基酸蛋白酶；190mM氯化鈉；0.92mM鈣；10%海藻糖；75ppm聚山梨酯80 ；45mM乙酸；46mM HEPES ；以及5.5至7.5的pH。
[0036]在一個實施方案中，以上所提供的組合物具有5.5至7.0的pH。在另一個實施方案中，以上所提供的組合物具有5.5至6.5的pH。在另一個實施方案中，以上所提供的組合物具有6.0±0.2的pH。在另一個實施方案中，以上所提供的組合物具有6.0的pH。
[0037]一方面，本公開提供一種用于稀釋重組成對堿性氨基酸蛋白酶水性組合物的方法,所述方法包括向所述重組成對堿性氨基酸蛋白酶水性組合物添加包含IOppm至200ppm非離子型表面活性劑的稀釋緩沖液，從而形成稀釋的重組成對堿性氨基酸蛋白酶組合物。
[0038]在以上所提供的方法的一個實施方案中，稀釋緩沖液包含IOppm至IOOppm非離子型表面活性劑。在以上所提供的方法的另一個實施方案中，稀釋緩沖液包含50ppm至IOOppm非離子型表面活性劑。在以上所提供的方法的另一個實施方案中，稀釋緩沖液包含75ppm非離子型表面活性劑。
[0039]在以上所提供的方法的一個實施方案中，稀釋緩沖液具有5.5至7.5的pH。在以上所提供的方法的另一個實施方案中，稀釋緩沖液具有5.5至6.5的pH。在以上所提供的方法的另一個實施方案中，稀釋緩沖液具有6.0±0.2的pH。在以上所提供的方法的另一個實施方案中，稀釋緩沖液具有6.0的pH。
[0040]在以上所提供的方法的一個實施方案中，稀釋的重組成對堿性氨基酸蛋白酶組合物包含至少50%存在于稀釋前的重組成對堿性氨基酸蛋白酶水性組合物中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶活性。
[0041]在以上所提供的方法的一個實施方案中，稀釋的重組成對堿性氨基酸蛋白酶組合物包含至少75%存在于稀釋前的重組成對堿性氨基酸蛋白酶水性組合物中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶活性。
[0042]一方面,本公開提供一種重組成對堿性氨基酸蛋白酶(recombinant furin)(重組成對堿性氨基酸蛋白酶(rfurin))的高度穩(wěn)定化的制劑,所述制劑包含:8，000U/mL至
52,000U/mL重組成對堿性氨基酸蛋白酶；lmM至300mM藥學上可接受的鹽；0.1mM至2mM氯化鈣；1%至20%糖和/或糖二水合物；50ppm至IOOppm表面活性劑；以及ImM至IOOmM羧酸、濃度足以維持4.0至 7.0的pH的緩沖劑、或所述羧酸和所述緩沖劑二者。
[0043]在一個實施方案中，以上所提供的制劑包含180mM至200mM鹽。
[0044]在以上所提供的制劑的一個實施方案中，鹽是氯化鈉。
[0045]在一個實施方案中，以上所提供的制劑包含0.5mM至1.0mM鈣。
[0046]在一個實施方案中，以上所提供的制劑包含5%至15%糖或糖二水合物。
[0047]在以上所提供的制劑的一個實施方案中，糖或糖二水合物選自由蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其組合組成的組。
[0048]在以上所提供的制劑的一個實施方案中，表面活性劑是聚山梨酯80。
[0049]在以上所提供的制劑的一個實施方案中，表面活性劑以約65ppm至約85ppm的濃
度存在。
[0050]在以上所提供的制劑的一個實施方案中，羧酸是乙酸。
[0051]在以上所提供的制劑的一個實施方案中，羧酸的濃度是35mM至55mM。
[0052]在以上所提供的制劑的一個實施方案中，緩沖劑是HEPES。
[0053]在以上所提供的制劑的一個實施方案中，緩沖劑的濃度是約20ppm至約lOOpprn。
[0054]在以上所提供的制劑的一個實施方案中，所述制劑與不含糖或糖二水合物的制劑相比在于37°C下儲存之后顯示出改進的穩(wěn)定性。
[0055]在以上所提供的制劑的一個實施方案中，通過向包含1%聚山梨酯80、500mMHEPES、400mM乙酸、ImM氯 化鈣、以及海藻糖二水合物粉末的組合物添加重組成對堿性氨基酸蛋白酶來制備所述制劑，其中所述組合物在添加至所述重組成對堿性氨基酸蛋白酶之前具有6.0的pH。
[0056]一方面,本公開提供一種重組成對堿性氨基酸蛋白酶(recombinant furin)(重組成對堿性氨基酸蛋白酶(rfurin))的高度穩(wěn)定化的制劑,所述制劑包含:8，000U/mL至57，000U/mL重組成對堿性氨基酸蛋白酶；190mM氯化鈉；0.92mM氯化鈣；10%w/w海藻糖二水合物；75ppm聚山梨酯80 ；45mM乙酸；以及46mM HEPES。
[0057]一方面,本公開提供一種重組成對堿性氨基酸蛋白酶(recombinant furin)(重組成對堿性氨基酸蛋白酶(rfurin))的高度穩(wěn)定化的制劑,所述制劑包含:(a)8，000U/mL至52，000U/mL重組成對堿性氨基酸蛋白酶；(b) ImM至300mM藥學上可接受的鹽；(c) 0.1mM至2mM氯化|丐；(d) 1%至20%糖和/或糖二水合物；(e) 50ppm至IOOppm表面活性劑；以及
(f)1mM至IOOmM羧酸、或濃度足以維持4.0至7.0的pH的緩沖劑、或所述羧酸和所述緩沖劑二者。
[0058]附圖簡述
[0059]圖1.對照制劑中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶——使用成對堿性氨基酸蛋白酶活性測定分析的溫度研究。將對照制劑中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶樣品在室溫、37°C或45°C下孵育至多7天。重組成對堿性氨基酸蛋白酶樣品的活性相對于孵育天數進行繪圖。誤差棒是±1標準偏差；n=4。
[0060]圖2.對照制劑中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶——使用SEC分析的溫度研究。使用SEC來分析與圖1中相同的樣品。相對重組成對堿性氨基酸蛋白酶峰高相對于孵育天數進行繪圖。相對峰高以在時間零點處的重組成對堿性氨基酸蛋白酶峰高的百分比的形式進行計算。
[0061]圖3.使用SEC分析在37°C下孵育的對照制劑中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶。將對照制劑中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶樣品在37°C下孵育7天。圖3示出在280nm下六個時間點的SEC吸收特征的疊合圖。與圖1中相同的研究。
[0062]圖4.使用蛋白質印跡法分析在室溫和37°C下孵育的對照制劑中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶。與圖1中相同的研究。泳道=(I)MWM標記；(2)T=0 ;(3)在室溫下孵育I天的重組成對堿性氨基酸蛋白酶；(4)在室溫下孵育2天的重組成對堿性氨基酸蛋白酶；(5)在室溫下孵育3天的重組成對堿性氨基酸蛋白酶；(6)在室溫下孵育7天的重組成對堿性氨基酸蛋白酶；(7)MWM標記；(8)在37°C下孵育I天的重組成對堿性氨基酸蛋白酶；(9)在37°C下孵育2天的重組成對堿性氨基酸蛋白酶；(10)在37°C下孵育3天的重組成對堿性氨基酸蛋白酶；以及(11)在37°C下孵育7天的重組成對堿性氨基酸蛋白酶。
[0063]圖5.對照制劑中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶——使用成對堿性氨基酸蛋白酶活性測定分析的冷凍/解凍研究。重組成對堿性氨基酸蛋白酶活性相對于冷凍/解凍循環(huán)次數進行繪圖。誤差棒是±1標準偏差；n=4。
[0064]圖6.對照制劑中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶——使用SEC分析的冷凍/解凍研究。重組成對堿性氨基酸蛋白酶峰高相對于冷凍/解凍循環(huán)次數進行繪圖。
[0065]圖7.對照制劑中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶——使用活性測定分析的攪拌研究。重組成對堿性氨基酸蛋白酶活性相對于攪拌時間進行繪圖。誤差棒是±1標準偏差；n=4o
[0066]圖8.對照制劑中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶——使用SEC分析的攪拌研究。重組成對堿性氨基酸蛋白酶峰高相對于攪拌時間進行繪圖。
[0067]圖9.使用蛋白質印跡法比較不同批次的重組成對堿性氨基酸蛋白酶。使用蛋白質印跡法分析不同批次的重組成對堿性氨基酸蛋白酶。產生次序按字母順序表示。泳道= (I)MWM標記；(2)成對堿性氨基酸蛋白酶參考；(3)03-04-09(批次018342，2mL 小瓶)；(4) 03-08-09 (批次 018365，2mL 小瓶)；(5) 03-15-09 (批次 018366，2mL 小瓶)；(6) 03-01-09 (批次 018315，2mL 小瓶)；(7) 07-26-10 (批次 X572，200mL 瓶子)；
(8)03-06-09(批次 018365, 200mL 瓶子);(9) 08-01-10 (批次 X576，200mL 瓶子)；
(10)03-09-09(批次018366，200mL瓶子)；(Il)MWM標記；(12)成對堿性氨基酸蛋白酶參考；(13) 08-03-10 (批次 X577, 200mL 瓶子)；(14) 07-24-10 (批次 X573, 200mL 瓶子);(15) 07-30-10 (批次 X575, 200mL 瓶子)；(16)018346 (在-80 V 下的 QC 穩(wěn)定性)；
(17)018346 (在-25 V下的QC穩(wěn)定性)；(18)018315 (在-80 V下的QC穩(wěn)定性)；以及
(19)018315(在-25°C下的 QC 穩(wěn)定性)。
[0068]圖10.使用成對堿性氨基酸蛋白酶活性測定分析的融化方法對重組成對堿性氨基酸蛋白酶活性的影響。重組成對堿性氨基酸蛋白酶樣品活性以在4°C (左)抑或室溫(RT ;右)下解凍的不同批次的重組成對堿性氨基酸蛋白酶的條形圖的形式示出。誤差棒是土 I標準偏差；n=4。
[0069]圖11.使用成對堿性氨基酸蛋白酶活性測定分析的pH5和pH5.5對重組成對堿性氨基酸蛋白酶活性的作用。將重組成對堿性氨基酸蛋白酶樣品在37°C下在pH5.0、pH5.5抑或pH6.0(對照制劑)下孵育至多7天。重組成對堿性氨基酸蛋白酶樣品的活性相對于孵育天數進行繪圖。誤差棒是±1標準偏差；n=4。
[0070]圖12.使用SEC分析的pH5和pH5.5對重組成對堿性氨基酸蛋白酶活性的作用。將重組成對堿性氨基酸蛋白酶樣品在3`7°C下在pH5.0、pH5.5抑或pH6.0 (對照制劑)下孵育。重組成對堿性氨基酸蛋白酶的相對峰高相對于孵育天數進行繪圖。相對峰高以在時間零點處的重組成對堿性氨基酸蛋白酶峰高的百分比的形式進行計算。
[0071]圖13.使用SEC分析的在37°C下對照制劑中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶穩(wěn)定性。將對照制劑中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶樣品在37°C下孵育四天。280nm吸收特征的疊合圖示出三個時間點:T=0、孵育I天以及4天。
[0072]圖14.使用SEC分析的MES(ρΗ6.0)中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶穩(wěn)定性。將重組成對堿性氨基酸蛋白酶樣品摻以MES (最終C=IOOmM,ρΗ6.0)并且在37°C下孵育四天。280nm吸收特征的疊合圖示出三個時間點:T=0、孵育I天以及4天。
[0073]圖15.使用SEC分析的HEPES(ρΗ7.0)中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶穩(wěn)定性。將重組成對堿性氨基酸蛋白酶樣品摻以HEPES(最終C=IOOmM, ρΗ7.0)并且在37°C下孵育四天。280nm吸收特征的疊合圖示出三個時間點:T=0、孵育I天以及4天。
[0074]圖16.使用SEC分析的HEPES (ρΗ8.0)中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶穩(wěn)定性。將重組成對堿性氨基酸蛋白酶樣品摻以HEPES(最終C=IOOmM, ρΗ8.0)并且在37°C下孵育四天。280nm吸收特征的疊合圖示出三個時間點:T=0、孵育I天以及4天。
[0075]圖17.使用SEC分析的在37°C下蔗糖和聚山梨酯80添加劑對重組成對堿性氨基酸蛋白酶穩(wěn)定性的作用。將樣品在37°C下孵育四天。重組成對堿性氨基酸蛋白酶的相對峰高相對于孵育時間進行繪圖。相對峰高以在時間零點處的重組成對堿性氨基酸蛋白酶峰高的百分比的形式進行計算。
[0076]圖18.使用成對堿性氨基酸蛋白酶活性測定分析的在37°C下蔗糖和聚山梨酯80對對照制劑中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶穩(wěn)定性的作用。重組成對堿性氨基酸蛋白酶樣品的相對活性相對于孵育天數進行繪圖以便比較以下樣品:無添加劑的對照制劑、對照制劑加10%蔗糖、以及對照制劑加10%蔗糖加25ppm聚山梨酯80。相對活性值以在時間零點處的重組成對堿性氨基酸蛋白酶活性的百分比的形式進行計算。誤差棒是±1標準偏差=4。
[0077]圖19.使用成對堿性氨基酸蛋白酶活性測定分析的在37°C下蔗糖和聚山梨酯80對MES緩沖液中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶穩(wěn)定性的作用。重組成對堿性氨基酸蛋白酶樣品的相對活性相對于孵育天數進行繪圖以便比較以下樣品:無添加劑的對照制劑、摻以MES (最終C=IOOmM, pH6.0)、摻以MES (最終C=IOOmM, pH6)加10%蔗糖、以及摻以MES (最終C=IOOmM, pH6.0)加10%蔗糖加25ppm聚山梨酯80。相對活性值以在時間零點處的重組成對堿性氨基酸蛋白酶活性的百分比的形式進行計算。誤差棒是±1標準偏差；n=4。
[0078]圖20.使用成對堿性氨基酸蛋白酶活性測定分析的在37°C下對照制劑與MES緩沖液中的制劑中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶穩(wěn)定性的比較。重組成對堿性氨基酸蛋白酶樣品的相對活性相對于孵育天數進行繪圖以便比較以下樣品:無添加劑的對照制劑、對照制劑加10%蔗糖、以及摻以MES (最終C=IOOmM, pH6.0)加10%蔗糖。相對活性值以在時間零點處的重組成對堿性氨基酸蛋白酶活性的百分比的形式進行計算。誤差棒是±1標準偏差；n=4。
[0079]圖21.使用成對堿性氨基酸蛋白酶活性測定分析的在37°C下蔗糖與甘露糖醇中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶穩(wěn)定性的比較。所有樣品均摻以HEPES/乙酸，pH6.0。重組成對堿性氨基酸蛋白酶樣品的相對活性相對于孵育天數進行繪圖以便比較以下樣品:無添加劑、10%蔗糖、10%甘露糖醇、10%蔗糖加25ppm聚山梨酯80、以及10%甘露糖醇加25ppm聚山梨酯80。相對活性值以在時間零點處的重組成對堿性氨基酸蛋白酶活性的百分比的形式進行計算。誤差棒是標準偏差；n=4。
[0080]圖22.在37°C下的重組成對堿性氨基酸蛋白酶穩(wěn)定性:使用SEC分析的蔗糖對甘露糖醇。使用SEC分析與圖21中相同的樣品。相對重組成對堿性氨基酸蛋白酶峰高相對于孵育時間進行繪圖。相對峰高以在時間零點處的重組成對堿性氨基酸蛋白酶峰高的百分比的形式進行計算。
[0081]圖23.由成對堿性氨基酸蛋白酶活性測定分析的在37°C下孵育5天后海藻糖中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶穩(wěn)定性。使用成對堿性氨基酸蛋白酶活性測定檢驗在37 °C下不同量的海藻糖和聚山梨酯80對重組成對堿性氨基酸蛋白酶穩(wěn)定性的作用。首先，將所有樣品均摻以HEPES和乙酸(最終濃度:HEPES - 50mM，乙酸-50mM，pH6.0)，然后添加10%蔗糖抑或不同量的海藻糖和/或聚山梨酯80。還包括對照制劑中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶樣品。將數據從在37°C下孵育5天后的最高活性值至最低活性值進行排序(各對中的右側條)。各對中的左側條描繪在時間零點處的成對堿性氨基酸蛋白酶活性值。誤差棒是±1標準偏差；n=4。
[0082] 圖24.在37°C下孵育5天后海藻糖中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶活性。在重新計算后展示與圖23中相同的樣品以便示出在37°C下孵育5天后各樣品剩余的初始活性的百分比。還包括對照制劑中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶樣品。誤差棒是±1標準偏差；n=4o
[0083]圖25.使用SEC分析的在37°C下孵育5天后海藻糖中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶穩(wěn)定性。與圖24中相同的樣品。圖示出在37°C下孵育5天后各樣品剩余的初始重組成對堿性氨基酸蛋白酶峰值的百分比。還包括對照制劑中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶樣品O
[0084]圖26.使用蛋白質印跡法分析的在35°C下孵育5天后海藻糖中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶穩(wěn)定性。與圖24中相同的樣品。使樣品成對:第一樣品-時間零點，第二樣品-在37°C下孵育5天。泳道:(I) MWM標記；(2)成對堿性氨基酸蛋白酶參考，(3)對照；(4)對照制劑，T=O ; (5)對照制劑，5天；(6) 10%蔗糖，T=O ; (7) 10%蔗糖，5天；(8)2%海藻糖，T=O ; (9)2% 海藻糖，5 天；(10) 10% 海藻糖，T=O ; (11) 10% 海藻糖，5 天；(12)MWM 標記；(13)成對堿性氨基酸蛋白酶參考;(14)對照；(15) 5%海藻糖，T=O ； (16) 5%海藻糖，5天；(17) 5%海藻糖，+IOppm 吐溫 80, T=O ； (18) 5% 海藻糖，+IOppm 吐溫 80, 5 天；(19) 5% 海藻糖，+25ppm吐溫 80，T=O ； (20) 5% 海藻糖，+25ppm 吐溫 80，5 天；(21) 5% 海藻糖，+IOOppm 吐溫 80，T=O ；以及(22) 5%海藻糖，+IOOppm吐溫80，5天。
[0085]圖27.在37°C下孵育5天后測試的海藻糖含量對重組成對堿性氨基酸蛋白酶活性的作用。與圖24中相同的實驗。首先，將所有樣品均摻以HEPES和乙酸(最終濃度:HEPES - 50mM,乙酸-50mM，pH6.0)，然后添加不同量的海藻糖。在37°C下孵育5天后的成對堿性氨基酸蛋白酶活性相對于添加至樣品中的海藻糖的百分比進行繪圖。誤差棒是±1標準偏差；n=4。
[0086]圖28.孵育5天后使用SEC分析的在37°C下海藻糖含量對重組成對堿性氨基酸蛋白酶穩(wěn)定性的作用。與圖27中相同的實驗。在37°C下孵育5天后的重組成對堿性氨基酸蛋白酶峰高相對于添加至樣品中的海藻糖的百分比進行繪圖。
`[0087]圖29.在37°C下孵育5天后測試的聚山梨酯80含量對重組成對堿性氨基酸蛋白酶活性的作用。與圖24中相同的實驗。首先，將所有樣品均摻以HEPES、乙酸(最終濃度:HEPES - 50mM,乙酸-50mM，pH6.0)、以及5%海藻糖，然后添加不同量的聚山梨酯80。在37°C下孵育5天后的成對堿性氨基酸蛋白酶活性相對于添加至樣品中的聚山梨酯80的量進行繪圖。誤差棒是±1標準偏差；n=4。
[0088]圖30.孵育5天后使用SEC分析的在37°C下聚山梨酯80含量對重組成對堿性氨基酸蛋白酶穩(wěn)定性的作用。與圖29中相同的樣品。在37°C下孵育5天后的重組成對堿性氨基酸蛋白酶峰高相對于添加至樣品中的聚山梨酯80的量進行繪圖。
[0089]圖31.高度穩(wěn)定化的制劑中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶——使用成對堿性氨基酸蛋白酶活性測定分析的攪拌研究。高度穩(wěn)定化的制劑中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶樣品摻以不同量的聚山梨酯80。圖示出在攪拌三小時之前和之后的成對堿性氨基酸蛋白酶活性值。數據從最高活性至最低活性進行排序。誤差棒是±1標準偏差；n=4。各對中的左側條示出在時間O處的活性，各對中的右側條示出攪拌后的活性。
[0090]圖32.高度穩(wěn)定化的制劑中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶——使用SEC分析的攪拌研究。與圖31中相同的實驗。圖示出在攪拌三小時之前和之后的重組成對堿性氨基酸蛋白酶峰高。數據從最高至最低進行排序。各對中的左側條示出在時間O處的活性，各對中的右側條示出攪拌后的活性。
[0091]圖33.高度穩(wěn)定化的制劑中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶——使用成對堿性氨基酸蛋白酶活性測定分析的攪拌研究中聚山梨酯含量的作用。與圖32中相同的樣品。攪拌三小時后的成對堿性氨基酸蛋白酶活性相對于聚山梨酯80的含量進行繪圖。誤差棒是±1標準偏差；n=4。
[0092]圖34.高度穩(wěn)定化的制劑中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶——使用SEC分析的攪拌研究中聚山梨酯80的作用。與圖32中相同的樣品。攪拌三小時后的重組成對堿性氨基酸蛋白酶峰高相對于聚山梨酯80的含量進行繪圖。
[0093]圖35.對照制劑中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶——使用SEC分析的攪拌研究。色譜圖示出在280nm下SEC吸收特征的疊合圖，比較在攪拌三小時之前和之后對照制劑中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶樣品。攪拌的樣品的重組成對堿性氨基酸蛋白酶峰值顯著小于對照樣品。觀察到攪拌的樣品中高分子質量峰的缺乏(參見用于解釋的第3.5.1段)。
[0094]圖36.對照制劑中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶的UV光譜(與圖35中相同的樣品)。攪拌三小時后重組成對堿性氨基酸蛋白酶樣品的UV光譜與攪拌前的樣品相比顯示傾斜并且極度升高的特征，這指示攪拌的樣品中顯著水平的聚集體的存在。
[0095]圖37.無聚山梨酯80的高度穩(wěn)定化的制劑中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶樣品的UV光譜。攪拌三小時后重組成對堿性氨基酸蛋白酶樣品的UV光譜與攪拌前的樣品相比顯示升高的特征，這指示攪拌的樣品中顯著水平的聚集體的存在。
[0096]圖38.無聚山梨酯80的高度穩(wěn)定化的制劑中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶——使用SEC分析的攪拌研究。色譜圖示出在280nm下SEC吸收特征的疊合圖，比較在攪拌三小時之前和之后無聚山梨酯80的 高度穩(wěn)定化的制劑中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶樣品。攪拌的樣品的重組成對堿性氨基酸蛋白酶峰值顯著小于對照樣品。觀察到高分子質量峰的缺乏。
[0097]圖39.含有IOppm聚山梨酯80的高度穩(wěn)定化的制劑中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶樣品的UV光譜。攪拌三小時后重組成對堿性氨基酸蛋白酶樣品的UV光譜與攪拌前的樣品相比顯示稍微升高的特征，這指示攪拌的樣品中聚集體的存在。相對于在無聚山梨酯的樣品中見到的光譜(圖36和圖37)，“攪拌”的光譜與“攪拌前”的光譜接近，這指示聚集水平低于在無聚山梨酯的樣品中見到的聚集水平。
[0098]圖40.含有25ppm聚山梨酯80的高度穩(wěn)定化的制劑中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶樣品的UV光譜。攪拌三小時后重組成對堿性氨基酸蛋白酶樣品的UV光譜與攪拌前的樣品相比顯示稍微升高的特征，這指示攪拌的樣品中少量聚集體的存在。
[0099]圖41.含有50ppm聚山梨酯80的高度穩(wěn)定化的制劑中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶樣品的UV光譜。攪拌三小時后重組成對堿性氨基酸蛋白酶樣品的UV光譜顯示與攪拌前的樣品非常類似的特征。光譜既不傾斜也不升高，這指示樣品均不含有大量較大聚集體。
[0100]圖42.含有IOOppm聚山梨酯80的高度穩(wěn)定化的制劑中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶樣品的UV光譜。攪拌三小時后重組成對堿性氨基酸蛋白酶樣品的UV光譜顯示與攪拌前的樣品非常類似的特征。光譜既不傾斜也不升高，這指示樣品均不含有大量較大聚集體。
[0101]圖43.高度穩(wěn)定化的制劑 中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶——使用成對堿性氨基酸蛋白酶活性測定分析的冷凍/解凍研究。將高度穩(wěn)定化的制劑中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶樣品摻以不同量的聚山梨酯80。數據顯示在5個冷凍/解凍循環(huán)之前和之后樣品中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶活性。將數據從最高至最低進行排序。誤差棒是±I標準偏差；n=4。
[0102]圖44.高度穩(wěn)定化的制劑中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶——使用SEC分析的冷凍/解凍研究。與圖43中相同的樣品。數據顯示在5個冷凍/解凍循環(huán)之前和之后的重組成對堿性氨基酸蛋白酶峰高。將數據從最高至最低進行排序。
[0103]圖45.高度穩(wěn)定化的制劑中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶——使用SEC分析的冷凍/解凍研究。與圖44中相同的樣品。重組成對堿性氨基酸蛋白酶的相對峰高相對于冷凍/解凍循環(huán)次數進行繪圖。相對峰高以第一個冷凍/解凍循環(huán)前重組成對堿性氨基酸蛋白酶峰高的百分比的形式進行計算。
[0104]圖46.使用成對堿性氨基酸蛋白酶活性測定分析的在37°C下高度穩(wěn)定化的制劑中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶穩(wěn)定性。對照制劑抑或高度穩(wěn)定化的制劑中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶樣品在37°C下孵育4天。誤差棒是±1標準偏差；n=4。
[0105]圖47.使用成對堿性氨基酸蛋白酶活性測定分析的在37°C下高度穩(wěn)定化的制劑中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶穩(wěn)定性。重新計算與圖46中相同的樣品。各樣品的相對活性以其初始活性的百分比的形式進行計算。誤差棒是±1標準偏差；n=4。
[0106]圖48.使用SEC分析的在37°C下高度穩(wěn)定化的制劑中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶穩(wěn)定性。與圖46中相同的樣品。各樣品的重組成對堿性氨基酸蛋白酶的相對峰高以其初始峰高的百分比的形式進行計算。誤差棒是±1標準偏差；n=4。
[0107]圖49.溫度對高度穩(wěn)定化的制劑儲備緩沖液(500mM HEPES、400mM乙酸、ImMCaCl2, ρΗ6.0)的pH (B)和傳導率(A)的作用。
[0108]發(fā)明詳述
`[0109]1.前言
[0110]本公開是部分基于以下發(fā)現:成對堿性氨基酸蛋白酶水性組合物可以通過添加糖、糖醇、以及非離子型表面活性劑而針對各種化學和機械應力穩(wěn)定化。與缺乏糖、糖醇以及非離子型表面活性劑的類似成對堿性氨基酸蛋白酶組合物相比，本文所描述的成對堿性氨基酸蛋白酶水性組合物在室溫或高于室溫下儲存時以及在經受機械應力時顯著更穩(wěn)定。本公開還部分基于以下發(fā)現；向成對堿性氨基酸蛋白酶稀釋緩沖液添加非離子型表面活性劑能夠在所述酶稀釋至在制造不同重組生物制品(如VWF)過程中所使用的較低濃度時實現成對堿性氨基酸蛋白酶活性的較大恢復。
[0111]有利地，本文所描述的研究證明向成對堿性氨基酸蛋白酶組合物添加糖或糖醇使所述組合物在儲存一段時間時的穩(wěn)定性增強。例如，本文顯示成對堿性氨基酸蛋白酶水性制劑中包含僅2%糖或糖醇可以使所述組合物的穩(wěn)定性增加10%以上。進一步顯示成對堿性氨基酸蛋白酶水性制劑中包含10%糖或糖醇可以使所述組合物的穩(wěn)定性增加75%以上。
[0112]有利地，本文所描述的研究還證明向成對堿性氨基酸蛋白酶組合物添加非離子型表面活性劑使所述組合物在經受機械應力時的穩(wěn)定性增強。例如，本文顯示成對堿性氨基酸蛋白酶水性制劑中包含僅IOppm非離子型表面活性劑可以使所述組合物的穩(wěn)定性增加75%以上。
[0113]有利地，本文描述的研究還證明向成對堿性氨基酸蛋白酶稀釋緩沖液包含非離子型表面活性劑使成對堿性氨基酸蛋白酶稀釋后的活性恢復增加。例如，本文顯示成對堿性氨基酸蛋白酶稀釋緩沖液中包含75ppm非離子型表面活性劑使成對堿性氨基酸蛋白酶稀釋后的活性恢復增加3至4倍。
[0114]因此，本公開提供高度穩(wěn)定化的成對堿性氨基酸蛋白酶制劑的組合物。雖然本文的大部分討論是依據重組成對堿性氨基酸蛋白酶(recombinant furin)(重組成對堿性氨基酸蛋白酶(rfurin))的高度穩(wěn)定化的制劑,但應理解任何成對堿性氨基酸蛋白酶蛋白質(包括從受試者分離的成對堿性氨基酸蛋白酶或成對堿性氨基酸蛋白酶的任何衍生物或突變體)可以包含于本發(fā)明的制劑中。
[0115]—方面，本公開提供高度穩(wěn)定化的成對堿性氨基酸蛋白酶制劑，其在使制劑經受一種或多種應激物后測定時顯示出優(yōu)于對照制劑的改進的穩(wěn)定性，這一種或多種應激物包括但不限于使制劑暴露于一系列溫度、幾個冷凍/解凍循環(huán)、和/或攪拌。通常通過成對堿性氨基酸蛋白酶活性的水平來評定改進的穩(wěn)定性——例如，在高于環(huán)境室溫下儲存之后，與各自在儲存前(即，在時間=0時)的活性相比，高度穩(wěn)定化的成對堿性氨基酸蛋白酶制劑將顯示出比在相同條件下儲存的對照制劑更高的活性水平。本文描述用于評定成對堿性氨基酸蛋白酶制劑的穩(wěn)定性的方法。
[0116]在其它方面，本公開提供用于形成本發(fā)明的高度穩(wěn)定化的成對堿性氨基酸蛋白酶制劑的方法。所述方法包括用于針對儲存(包括冷凍儲存、在環(huán)境室溫或高于環(huán)境室溫下儲存、或凍干)使成對堿性氨基酸蛋白酶的制劑穩(wěn)定化的方法。
[0117]在又其它方面，本公開提供用于稀釋濃成對堿性氨基酸蛋白酶溶液的方法，所述方法在稀釋之后引起成對堿性氨基酸蛋白酶活性的增加的保留。與用缺乏非離子型表面活性劑的溶液稀釋的成對堿性氨基酸蛋白酶組合物相比，根據本文所提供的方法稀釋的成對堿性氨基酸蛋白酶的水性組合物保留多3至4倍的酶活性。
[0118]I1.定義`
[0119]如本文所用，術語“成對堿性氨基酸蛋白酶”是指具有成對堿性氨基酸蛋白酶活性(特別是裂解前馮.維勒布蘭德因子(前VWF)多肽的殘基Arg-763與Ser_764之間的肽鍵的能力)的任何蛋白質或多肽。在示例性實施方案中，成對堿性氨基酸蛋白酶是指包含與NP_002560.1 (人成對堿性氨基酸蛋白酶前蛋白原)的氨基酸序列相同或高度相同的氨基酸序列的多肽。在示例性實施方案中，成對堿性氨基酸蛋白酶是指包含與NP_002560.1的氨基酸25-794 (人成對堿性氨基酸蛋白酶蛋白原)相同或高度相同的氨基酸序列的多肽。在示例性實施方案中，成對堿性氨基酸蛋白酶是指包含與NP_002560.1的氨基酸108-794(人成熟成對堿性氨基酸蛋白酶蛋白質)相同或高度相同的氨基酸序列的多肽。如本文所用，成對堿性氨基酸蛋白酶多肽還包括具有VWF裂解活性的成對堿性氨基酸蛋白酶的天然變體以及具有VWF裂解活性的修飾的成對堿性氨基酸蛋白酶構建體。如本文所用，成對堿性氨基酸蛋白酶包涵保留一些基本活性(例如，與野生型成對堿性氨基酸蛋白酶的活性相比至少 1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或更高活性)的任何天然變體、替代序列、亞型或突變體蛋白。人群體中發(fā)現的成對堿性氨基酸蛋白酶突變的實例包括但不限于A43E、A43G、A43V、R50W、Y64C、L77P、R81C、E97A、E97V、V109M、V109L、R130W、A139V、P169T、N245S、E271K、Q339R、N407S、E457Q、R464W、K469R、S524Y、T536S、L570F、D624N、A642T、S685P、V7281、V7351、R745Q、P772L、以及 A793T。成對堿性氨基酸蛋白酶多肽還包括含有翻譯后修飾的多肽。例如，已經顯示成對堿性氨基酸蛋白酶在殘基S773和S775處磷酸化并且預測成對堿性氨基酸蛋白酶在殘基N387、N440、以及N553處糖基化。
[0120]在本公開的背景下，成對堿性氨基酸蛋白酶蛋白質包括重組成對堿性氨基酸蛋白酶多肽以及從源材料(例如，組織或血液)分離的天然成對堿性氨基酸蛋白酶多肽。成對堿性氨基酸蛋白酶多肽(重組和來源純化的)及其生物活性衍生物可以源自任何適合的生物體，例如哺乳動物，如靈長類動物、人類、猴子、兔、豬、嚙齒動物、小鼠、大鼠、倉鼠、沙鼠、犬、貓。還包涵具有VWF裂解活性的突變體和變體成對堿性氨基酸蛋白酶多肽以及功能片段以及包含成對堿性氨基酸蛋白酶多肽的融合蛋白。此外，本文所描述的成對堿性氨基酸蛋白酶多肽可以進一步包含有助于純化、檢測或二者的標簽。本文所描述的成對堿性氨基酸蛋白酶多肽可以進一步用治療性部分或適合用于體外或體內成像的部分進行修飾。
[0121]可以通過在細胞培養(yǎng)物(例如,哺乳動物細胞培養(yǎng)物)中表達來制備蛋白水解活性重組成對堿性氨基酸蛋白酶。用于制備重組成對堿性氨基酸蛋白酶的表達和純化方法的非限制性實例描述于W01991/06314、W01992/09698、美國專利號6，210, 929和6，596，526以及美國專利申請公布號2009/0181423和2009/0304669中，出于所有目的，所述文獻的內容特此以引用的方式整體并入。
[0122]如本文所用，“活性”是指成對堿性氨基酸蛋白酶或其部分的與全長(完全)蛋白質相關的一種或多種功能活性。功能活性包括但不限于生物活性，包括參與蛋白原底物的蛋白水解成熟過程和測試底物(如Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC(SEQ ID N0:1;AMC=7_氨基-4-甲氧基香豆素))的裂解。成對堿性氨基酸蛋白酶的底物包括馮？維勒布蘭德因子、甲狀旁腺激素原(proparathyroid hormone)、轉化生長因子β I前體、原白蛋白(proalbumin)、原β -分泌酶、膜I型基質金屬蛋白酶、以及原神經生長因子的β亞單位。在一個實施方案中，一個單位(U)的成對堿性氨基酸蛋白酶活性被定義為每分鐘使IpmolAMC從Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC(SEQ ID NO:1)釋放的成對堿性氨基酸蛋白酶的量。
[0123]如本文所用，術語“穩(wěn)定性”(如成對堿性氨基酸蛋白酶穩(wěn)定性或成對堿性氨基酸蛋白酶制劑穩(wěn)定性)用于結構背景(例如，與蛋白質的結構完整性有關)或功能背景(例如，與蛋白質隨時間推移保留其功能和/或活性的能力有關)中。應理解，所討論的蛋白質可以包含于根據本文所描述的方法和組合物的制劑內，并且所述蛋白質的穩(wěn)定性是指其在所述制劑中的穩(wěn)定性。在一個實施方案中，通過測量成對堿性氨基酸蛋白酶組合物的成對堿性氨基酸蛋白酶活性來測定所述組合物的穩(wěn)定性。例如，通過使用可檢測的成對堿性氨基酸蛋白酶底物，如 Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC(SEQ ID NO:1 ;例如，由 Enzo LifeSciences 出售的 ALX-260-040-M001)，例如在如 Malloy SS 等，J Biol Chem.1992 年 8 月15日；267 (23):16396-402中所描述的測定中，出于所有的目的，所述文獻的內容特此以引用的方式整體并入本文。在一個實施方案中，將如本文所描述的用糖、糖醇、和/或非離子型表面活性劑配制的成對堿性氨基酸蛋白酶組合物的穩(wěn)定性與未用糖、糖醇、和/或非離子型表面活性劑配制的成對堿性氨基酸蛋白酶組合物進行比較。
[0124]如本文所用，“儲存穩(wěn)定”的成對堿性氨基酸蛋白酶水性組合物是指已經被配制以便使蛋白質在給定儲存時間 內在溶液中的穩(wěn)定性增加(例如至少10%)的成對堿性氨基酸蛋白酶多肽溶液(例如，重組成對堿性氨基酸蛋白酶多肽溶液)。在本公開的背景下，可以通過添加糖、糖醇或非離子型表面活性劑作為穩(wěn)定劑來使成對堿性氨基酸蛋白酶多肽溶液(例如，重組成對堿性氨基酸蛋白酶多肽溶液)“儲存穩(wěn)定”。在一些實施方案中，可以(例如)通過監(jiān)測一段時期內聚集體的形成、整體酶活性的損失或降解產物的形成來測量成對堿性氨基酸蛋白酶多肽在任何給定制劑中的穩(wěn)定性。制劑的絕對穩(wěn)定性和糖、糖醇或非離子型表面活性劑的穩(wěn)定作用將取決于正穩(wěn)定化的具體組合物而變化。在一個實施方案中，通過測量成對堿性氨基酸蛋白酶組合物的成對堿性氨基酸蛋白酶活性來測定所述組合物的穩(wěn)定性。例如，通過使用可檢測的成對堿性氨基酸蛋白酶底物，如 Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC(SEQ ID N0:1;例如，由 Enzo Life Sciences 出售的 ALX-260-040-M001)，在(例如)如 Malloy SS 等，J Biol Chem.1992 年 8 月 15日；267 (23):16396-402中所描述的測定中，出于所有的目的，所述文獻的內容特此以引用的方式整體并入。在一個實施方案中，將如本文所描述的用糖、糖醇、和/或非離子型表面活性劑配制的成對堿性氨基酸蛋白酶組合物的穩(wěn)定性與未用糖、糖醇、和/或非離子型表面活性劑配制的成對堿性氨基酸蛋白酶組合物進行比較。
[0125]如本文中所用，“保質期”是指制劑在預定溫度下維持預定的穩(wěn)定性水平的一段時間。在具體實施方案中，預定溫度是指冷凍(例如，-80°C、-25°C、0°C )、冷藏(例如，(TC至IO0C )、或室溫(例如，18°C至32°C )儲存。
[0126]如本文所用，術語“穩(wěn)定性時間”是指制劑被認為是穩(wěn)定的持續(xù)時間。例如，制劑的穩(wěn)定性時間可以指制劑中的蛋白質聚集和/或降解的水平保持在某一閾值(例如，1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%,20%,等等)以下的持續(xù)時間，和/或制劑維持生物活性在某一閾值(例如，100%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%，等等)以上的持續(xù)時間，該閾值為在儲存期開始時制劑中所存在的活性的量的閾值。
[0127]在本公開的背景下，與未用糖、糖醇和/或非離子型表面活性劑配制的相同成對堿性氨基酸蛋白酶多肽的組合物相比，用糖、糖醇和/或非離子型表面活性劑配制的儲存穩(wěn)定的成對堿性氨基酸蛋白酶多肽(例如，重組成對堿性氨基酸蛋白酶多肽)的水性組合物將具有較長的穩(wěn)定性時間。在一些實`施方案中，儲存穩(wěn)定的成對堿性氨基酸蛋白酶多肽的水性組合物將具有比在缺乏糖、糖醇和/或非離子型表面活性劑的情況下配制的相同組合物的穩(wěn)定性時間高例如至少10%的穩(wěn)定性時間，或具有比在缺乏糖、糖醇和/或非離子型表面活性劑的情況下配制的相同組合物的穩(wěn)定性時間高至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、或至少 2 倍、或至少 2.5 倍、3.0 倍、3.5 倍、4.0 倍、4.5 倍、5.0 倍、
5.5倍、6.0倍、6.5倍、7.0倍、7.5倍、8.0倍、8.5倍、9.0倍、9.5倍、10倍或更多倍的穩(wěn)定性時間。
[0128]如本文所用，“儲存”意指制劑在制備后不立即施用至受試者或用于產生過程中，而在使用前在特定條件(例如，特定溫度)下保持一段時間。例如，成對堿性氨基酸蛋白酶制劑可以在施用至受試者之前在不同溫度(如冷凍(例如，-80°c, -25°c、0°c )、冷藏(例如，(TC至10°C)、或室溫(例如，18°C至32°C))下保持數天、數周、數月或數年。應理解，所述制劑可以是液體或凍干制劑。
[0129]如本文所用，術語“約”表示指定值加10%或減10%的近似范圍。例如，措辭“約20%”包涵18%至22%的范圍。
[0130]如本文所用，在提及組合物的單個組分的濃度時，短語“不大于X”和“O至X”是等效的并且是指O與X之間并且包括O和X的任何濃度。例如，短語“不大于2%的濃度”和“0%至2%的濃度”是等效的并且包括0%、1%以及2%。
[0131]如本文所用，在提及組合物的單個組分的濃度時，短語“不小于X”是指X或X以上的任何濃度。例如，短語“不小于98%的濃度”包括98%、99%以及100%。
[0132]如本文所用，在提及組合物的單個組分的濃度時，短語“X與Y之間”和“X至X”是等效的并且是指X與Y之間并且包括X和Y的任何濃度。例如，短語“49%與51%之間的濃度”和“49%至51%的濃度”是等效的并且包括49%、50%以及51%。
[0133]如本文所用，“糖”是指具有通式CxH2yOy (直鏈)或CxHi2y^Oy (環(huán)狀)的單糖和通過脫水反應形成的由兩個單糖單位組成的二糖。單糖可以根據它們所包含的碳原子數目分類為:乙糖(2)、丙糖(3)、丁糖(4)、戊糖(5)、己糖(6)、庚糖(7)，等等。因此，如本文所用，C(X)糖是指含有X數目的碳分子的糖。例如，C(5)糖是指戊糖，而C(6)糖是指己糖。可以用于本文所提供的制劑中的糖的非限制性實例包括:乙糖乙醇醛、丙糖甘油醛以及二羥基丙酮；丁糖，赤蘚糖(erythrose)、蘇糖(threose)、以及赤蘚酮糖(erythrulose)；戍糖，阿拉伯糖(arabinose)、來蘇糖(Iyxose)、核糖、木糖(xylose)、核酮糖、以及木酮糖(xylulose);己糖，阿洛糖(allose)、阿卓糖(altrose)、葡萄糖、甘露糖(mannose)、古洛糖(gulose)、艾杜糖(idose)、半乳糖、塔羅糖(talose)、阿洛酮糖(psicose)、果糖、山梨糖(sorbose)、以及塔格糖(tagatose);庚糖，景天庚酮糖(sedoheptulose)、甘露庚酮糖(mannoheptulose)、以及L-甘油-D-甘露-庚糖；以及由其形成的二糖的所有可能的組合，包括但不限于蔗糖、乳果糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、纖維二糖、曲二糖(kojibiose)、黑曲霉糖(nigerose)、異麥芽糖、β, β-海藻糖、α, β-海藻糖、槐糖(sophorose)、昆布二糖(Iaminaribiose)、龍膽二糖(gentiobiose)、松二糖(turanose)、麥芽酮糖(maltulose)、帕拉金糖(palatinose)、gentiobiulose、甘露二糖(mannobiose)、蜜二糖(melibiose)、車前二糖(melibiulose)、蕓香糖(rutinose)、rutinulose、以及木二糖(xylobiose)。
[0134]如本文所用，“糖醇”是指單糖或二糖的氫化形式，所述單糖或二糖的羰基已經被還原以便形成伯羥基或仲羥基。在一個實施方案中，糖醇具有約4至約8個碳原子?？梢杂糜诒疚乃峁┑闹苿┲械奶谴嫉姆窍拗菩詫嵗ㄒ叶?、甘油、赤蘚糖醇、蘇糖醇、核糖醇、巖藻糖醇(fucitol)、艾杜糖醇、倭勒米糖醇(volmitol)、異麥芽糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇(galactitol)、甜醇(dulcitol)、木糖醇、以及阿拉伯糖醇。
[0135]如本文所用，“藥學上可接受的鹽”是指藥物制劑中安全施用至受試者(例如，人)的鹽。藥學上可接受的鹽的選擇和使用是本領域中熟知的，例如，參見Stahl和 ffermuth, Pharmaceutical Salts!Properties, Selection, and Use,第二 修訂版，Wiley, Hoboken, New Jersey。在某些實施方案中，藥學上可接受的鹽是氯化鈉、氯化鉀、或其組合。
[0136]如本文所用，術語“非離子型表面活性劑”是指在生理相關條件下非離子化的表面活性劑。適用于本文所提供的穩(wěn) 定化的成對堿性氨基酸蛋白酶水性組合物的非離子型表面活性劑的非限制性實例包括:非離子型水溶性甘油單酯、甘油二酯及甘油三酯(例如，丙二醇二辛酸酯/ 二癸酸酯(例如MKiLYOIf 840)、中鏈甘油單酯和甘油二酯(例如CAPMULr和IMWITOR? 72)、中鏈甘油三酯(例如辛酸甘油三酯和癸酸甘油三酯，如 LAVRAFAC、MIGLYOL*: 810 或 812、CRODAMOL* GTCC-PN、以及 S0FTIS0N378)、
長鏈甘油單酯(例如甘油單油酸酯，如PEGEOI^和甘油單亞油酸酯，如MAlSlNEit+
)、聚氧乙烯蓖麻油(例如聚乙二醇蓖麻油酸酯、聚乙二醇羥基硬脂酸酯、聚乙二醇十六基十八基醚))；聚乙二醇的非離子型水溶性單脂肪酸酯和二脂肪酸酯；非離子型水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯(例如，脫水山梨糖醇單月桂酸酯，如聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單月桂酸酯(TWEEN20)和脫水山梨糖醇單月桂酸酯(SPAN20);脫水山梨糖醇單棕櫚酸酯，如聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單棕櫚酸酯(TWEEN40)和脫水山梨糖醇單棕櫚酸酯(SPAN40)；脫水山梨糖醇單硬脂酸酯，如聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單硬脂酸酯(TWEEN60)和脫水山梨糖醇單硬脂酸酯(SPAN60);脫水山梨糖醇單油酸酯，如聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯(TWEEN80)和脫水山梨糖醇單油酸酯(SPAN80);脫水山梨糖醇三油酸酯，如脫水山梨糖醇三油酸酯(SPAN85);以及脫水山梨糖醇三硬脂酸酯，如脫水山梨糖醇三硬
脂酸酯(SPAN65));聚乙二醇化甘油酯(例如，聚乙二醇-6甘油月桂酰酯(LabrafifM2130CS);聚乙二醇1000 丁二酸d-α-生育酚酯(TPGS)、聚乙二醇66012-羥基硬脂酸酯(SOLUTOL? HS15)、聚氧乙烯油酸酯和硬脂酸酯(例如PEG400單硬脂酸酯和PEG1750單硬脂酸酯))；非離子型水溶性三嵌段共聚物(例如聚(氧化乙烯)/聚(氧化丙烯)/聚(氧化乙烯)三嵌段共聚物，如甲基環(huán)氧乙烷與環(huán)氧乙烷的聚合物BHT( PLURONiC <F-127))。
[0137]在一個實施方案中，提供儲存穩(wěn)定的成對堿性氨基酸蛋白酶(例如，重組成對堿性氨基酸蛋白酶)的組合物，所述組合物包含選自以下的非離子型表面活性劑:非離子型水溶性甘油單酯、非離子型水溶性甘油二酯、非離子型水溶性甘油三酯、聚乙二醇的非離子型水溶性單脂肪酸酯、聚乙二醇的非離子型水溶性二脂肪酸酯、非離子型水溶性脫水山梨糖醇脂肪酸酯、非離子型聚乙二醇化甘油酯、非離子型水溶性三嵌段共聚物、以及其組合。
[0138]如本文所用，術語“生物活性衍生物”在成對堿性氨基酸蛋白酶多肽的背景下使用時還包涵經由重組DNA技術獲得的多肽。這種技術可以包括用于以下的本領域中已知的任何方法:⑴通過遺傳工程產生重組DNA，例如，經由反轉錄RNA和/或擴增DNA產生；(?)通過轉染將重組DNA引入原核細胞或真核細胞中，例如，經由電穿孔或顯微注射引入；(iii)培養(yǎng)所述轉化細胞，例如，以連續(xù)或分批方式培養(yǎng)；(iv)表達成對堿性氨基酸蛋白酶蛋白質，例如，組成性表達或在誘導后表達；以及(V)分離所述成對堿性氨基酸蛋白酶蛋白質，例如，從培養(yǎng)基或通過收獲轉化細胞分離；以便(vi)獲得大致上純化的重組成對堿性氨基酸蛋白酶蛋白質，例如，經由離子交換色譜法、尺寸排阻色譜法、親和色譜法、疏水相互作用色譜法等獲得。術語“生物活性衍生物”還包括嵌合分子，例如像成對堿性氨基酸蛋白酶蛋白質或其功能片段與第二多肽(例如，免疫球蛋白Fe結構域或白蛋白結構域)的組合，以便改進生物學/藥理學特性，例如像成對堿性氨基酸蛋白酶蛋白質在哺乳動物(特別是人)的循環(huán)系統(tǒng)中的半衰期。[0139]除非上下文另外清楚地規(guī)定，否則如本文和所附權利要求中所用，單數形式“一個/種(a)”、“一個/種(an)”以及“所述(the) ”包括復數指代物。因此，例如，提及“緩沖劑”是指一種試劑或所述試劑的混合物，并且提及“方法”包括提及本領域技術人員已知的等效步驟和方法，諸如此類。
[0140]除非另外定義，否則本文所用的所有技術和科學術語均具有與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同的含義。出于描述和公開描述于公布中并且可能與目前所描述的發(fā)明結合使用的裝置、組合物、制劑以及方法學的目的，本文所提及的所有公布均以引用的方式并入本文。
[0141]如果提供一定范圍的值，那么應理解除非上下文另外清楚地規(guī)定，否則本發(fā)明內包涵所述范圍的上限與下限之間的各插入值(至下限單位的十分之一)和在所陳述的范圍中的任何其它陳述值或插入值。本發(fā)明內還包涵可以獨立地包括于這些較小范圍中的所述較小范圍的上限和下限，從屬于所陳述的范圍中的任何具體排除的限值。如果所陳述的范圍包括一或兩個限值，那么排除任一個或兩個所包括的限制的范圍也包括于本發(fā)明中。
[0142]如本文所用，“BDS”是指“散裝原料藥”。
[0143]II1.重組成對堿性氨基酸蛋白酶的穩(wěn)定化水性組合物
[0144]一方面，本公開提供成對堿性氨基酸蛋白酶(例如，重組成對堿性氨基酸蛋白酶)的穩(wěn)定化水性制劑。以下實施方案是部分基于以下發(fā)現:與缺乏糖、糖醇和/或非離子型表面活性劑的組合物相比，糖、糖醇和/或非離子型表面活性劑的包含使成對堿性氨基酸蛋白酶水性組合物穩(wěn)定化。
[0145]如本領域技術人員將認識到，除明確公開的組分之外，根據本文所提供的實施方案配制的成對堿性氨基酸蛋白酶組合物(例如，重組成對堿性氨基酸蛋白酶組合物)還可以包含通過包含溶液組分或pH調節(jié)劑貢獻的平衡離子，例如，從乙酸鹽、氫氧化鈉或氫氧化鉀貢獻的鈉或鉀，或由氯化鈣或鹽酸貢獻的氯。在本公開的背景下，如在特定PH下的配制過程所需要，由給定制劑組成或主要上由給定制劑組成的儲存穩(wěn)定的成對堿性氨基酸蛋白酶組合物(例如，重組成對堿性氨基酸蛋白酶)可以進一步包含一種或多種平衡離子。
[0146]在一個實施方案中，本文所提供的儲存穩(wěn)定的成對堿性氨基酸蛋白酶組合物(例如，重組成對堿性氨基酸蛋白酶組合物)將在室溫(即，18°C與32°C之間)下穩(wěn)定一段時間。例如，在一個實施方案中，儲存穩(wěn)定的免疫球蛋白水性組合物在于室溫下儲存時將穩(wěn)定至少4天。在其它實施方案中，組合物將在室溫下穩(wěn)定至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、U、12、13、14、21、28天或更多天。在其它實施方案中，組合物將穩(wěn)定至少I個月。在又其它實施方案中，組合物將穩(wěn)定至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、
43、44、45、46、47、48個月或更多個月。在某些實施方案中，室溫是指在20°C與30°C之間、在21°C與29°C之間、在22°C與28°C之間、在23°C與27°C之間、在24°C與26°C之間、或約25°C。在具體實施方案中，組合物在于20°C與25°C之間的溫度下儲存時將穩(wěn)定延長的一段時間。
[0147]在一個實施方案中，本文所 提供的儲存穩(wěn)定的成對堿性氨基酸蛋白酶組合物(例如，重組成對堿性氨基酸蛋白酶組合物)將在冷藏溫度(即，2°C與10°C之間)下穩(wěn)定一段時間。例如，在一個實施方案中，儲存穩(wěn)定的水性免疫球蛋白組合物在于冷藏溫度下儲存時將穩(wěn)定至少4天。在其它實施方案中，組合物將在冷藏溫度下穩(wěn)定至少1、2、3、4、5、6、7、8、
9、10、11、12、13、14、21、28天或更多天。在其它實施方案中，組合物將穩(wěn)定至少I個月。在又其它實施方案中，組合物將穩(wěn)定至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、
19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、
44、45、46、47、48個月或更多個月。在具體實施方案中，組合物在于2°C與8°C之間的溫度下儲存時將穩(wěn)定延長的一段時間。
[0148]在一個實施方案中，本文所提供的儲存穩(wěn)定的成對堿性氨基酸蛋白酶組合物(例如，重組成對堿性氨基酸蛋白酶組合物)將在高溫(即，32°C與42°C之間)下穩(wěn)定一段時間。例如，在一個實施方案中，儲存穩(wěn)定的水性免疫球蛋白組合物在于高溫下儲存時將穩(wěn)定至少4天。在其它實施方案中，組合物將在高溫下穩(wěn)定至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13、14、21、28天或更多天。在其它實施方案中，組合物將穩(wěn)定至少I個月。在又其它實施方案中，組合物將穩(wěn)定至少 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、
23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48個月或更多個月。在具體實施方案中，組合物在于35°C與40°C之間的溫度下儲存時將穩(wěn)定延長的一段時間。
[0149]在一個實施方案中，只要儲存的成對堿性氨基酸蛋白酶組合物維持至少40%的在儲存期開始時(例如，在時間=0時)所存在的成對堿性氨基酸蛋白酶活性,所述組合物就被認為是儲存穩(wěn)定的。在另一個實施方案中，只要儲存的成對堿性氨基酸蛋白酶組合物維持至少45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多的在儲存期開始時(例如，在時間=0時)所存在的成`對堿性氨基酸蛋白酶活性，所述組合物就被認為是儲存穩(wěn)定的。在一個實施方案中，在如Malloy SS等，J Biol Chem.1992年8月15日；267 (23):16396-402中所描述的測定中測量成對堿性氨基酸蛋白酶活性。
[0150]在一個實施方案中，當在儲存一段時間后，與不含穩(wěn)定劑或含有較低量的穩(wěn)定劑的成對堿性氨基酸蛋白酶組合物相比，成對堿性氨基酸蛋白酶組合物包含多至少10%的成對堿性氨基酸蛋白酶活性時，所述組合物被認為已經通過添加穩(wěn)定劑(例如，糖、糖醇或非離子型表面活性劑)而穩(wěn)定化。在其它實施方案中，當在儲存一段時間后，與不含穩(wěn)定劑或含有較低量的穩(wěn)定劑的成對堿性氨基酸蛋白酶組合物相比，成對堿性氨基酸蛋白酶組合物包含多至少 15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或更大百分比的成對堿性氨基酸蛋白酶活性時，所述組合物被認為已經通過添加穩(wěn)定劑(例如，糖、糖醇或非離子型表面活性劑)而穩(wěn)定化。
[0151]在一個實施方案中，只要以聚集態(tài)存在的成對堿性氨基酸蛋白酶的百分比保持不大于50%，儲存的成對堿性氨基酸蛋白酶組合物就被認為是穩(wěn)定的。在其它實施方案中，只要以聚集態(tài)存在的成對堿性氨基酸蛋白酶的百分比保持不大于45%、40%、35%、30%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更少，儲存的成對堿性氨基酸蛋白酶組合物就被認為是穩(wěn)定的。
[0152]在一個實施方案中，當在儲存一段時間后，與不含穩(wěn)定劑或含有較低量的穩(wěn)定劑的成對堿性氨基酸蛋白酶組合物相比，成對堿性氨基酸蛋白酶組合物包含少至少10%的以聚集態(tài)存在的成對堿性氨基酸蛋白酶時，所述組合物被認為已經通過添加穩(wěn)定劑(例如，糖、糖醇或非離子型表面活性劑)而穩(wěn)定化。在其它實施方案中，當在儲存一段時間后，與不含穩(wěn)定劑或含有較低量的穩(wěn)定劑的成對堿性氨基酸蛋白酶組合物相比，成對堿性氨基酸蛋白酶組合物包含少至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或更大百分比的以聚集態(tài)存在的成對堿性氨基酸蛋白酶時，所述組合物被認為已經通過添加穩(wěn)定劑(例如，糖、糖醇或非離子型表面活性劑)而穩(wěn)定化。
[0153]在一個實施方案中，只要儲存的成對堿性氨基酸蛋白酶組合物在經受機械應力之后維持至少40%的起始成對堿性氨基酸蛋白酶活性(例如，在時間=0時)，所述組合物就被認為是穩(wěn)定的。在另一個實施方案中，只要儲存的組合物在經受機械應力之后維持45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多的起始成對堿性氨基酸蛋白酶活性(例如，在時間=0時)，所述組合物就被認為是穩(wěn)定的。在具體實施方案中，機械應力是攪拌(例如，振蕩)。
[0154]在一個實施方案中，當在經受機械應力之后，與不含穩(wěn)定劑或含有較低量的穩(wěn)定劑的成對堿性氨基酸蛋白酶組合物相比，成對堿性氨基酸蛋白酶組合物包含多至少10%的成對堿性氨基酸蛋白酶活性時，所述組合物被認為已經通過添加穩(wěn)定劑(例如，糖、糖醇或非離子型表面活性劑)而穩(wěn)定化。在其它實施方案中，當在經受機械應力之后，與不含穩(wěn)定劑或含有較低量的穩(wěn)定劑的成對堿性氨基酸蛋白酶組合物相比，成對堿性氨基酸蛋白酶組合物包含多至少 15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或更大百分比的成對堿性氨基酸蛋白酶活性時，所述組合物被認為已經通過添加穩(wěn)定劑(例如，糖、糖醇或非離子型表面活性劑)而穩(wěn)定化。在具體實施方案中，機械應力是攪拌(例如，振蕩)。
[0155]在一個實施方案中，在經受機械應力之后，只要以聚集態(tài)存在的成對堿性氨基酸蛋白酶的百分比保持不大于50%，儲存的成對堿性氨基酸蛋白酶組合物就被認為是穩(wěn)定的。在其它實施方案中，在經受機械應力之后，只要以聚集態(tài)存在的成對堿性氨基酸蛋白酶的百分比保持不大于 45%、40%、35%、30%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11 %、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、I % 或更少，儲存的成對堿性氨基酸蛋白酶組合物就被認為是穩(wěn)定的。在具體實施方案中，機械應力是攪拌(例如，振蕩)。
[0156]在一個實施方案中，當在經受機械應力之后，與不含穩(wěn)定劑或含有較低量的穩(wěn)定劑的成對堿性氨基酸蛋白酶組合物相比，成對堿性氨基酸蛋白酶組合物包含少至少10%的以聚集態(tài)存在的成對堿性氨基酸蛋白酶時，所述組合物被認為已經通過添加穩(wěn)定劑(例如，糖、糖醇或非離子型表面活性劑)而穩(wěn)定化。在其它實施方案中，當在經受機械應力之后，與不含穩(wěn)定劑或含有較低量的穩(wěn)定劑的成對堿性氨基酸蛋白酶組合物相比，成對堿性氨基酸蛋白酶組合物包含少至少 15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或更大百分比的以聚集態(tài)存在的成對堿性氨基酸蛋白酶時，所述組合物被認為已經通過添加穩(wěn)定劑(例如，糖、糖醇或非離子型表面活性劑)而穩(wěn)定化。在具體實施方案中，機械應力是攪拌(例如，振蕩)。
[0157] 雖然本申請中所描述的成對堿性氨基酸蛋白酶(例如，重組成對堿性氨基酸蛋白酶)制劑可以以指示的濃度凍干和復原，但應理解這些制劑還可以以更稀釋的形式復原。例如，為凍干的和/或通常以2mL溶液復原的根據本公開的制劑還可以以較大體積的稀釋劑(如5mL)復原。同樣地，凍干的成對堿性氨基酸蛋白酶(例如，重組成對堿性氨基酸蛋白酶)制劑還可以以更濃的形式復原。例如，為凍干的和/或通常以2ml溶液復原的根據本公開的制劑還可以以較小體積(如ImL)復原。
[0158]有利地，一方面，將本發(fā)明的高度穩(wěn)定化的成對堿性氨基酸蛋白酶(例如，重組成對堿性氨基酸蛋白酶)制劑與稀釋劑組合，所述稀釋劑在所得到的組合物用于產生方法，例如用于rVWF的成熟過程(本文還稱為“rVWF成熟方法”)中時賦予增加的成對堿性氨基酸蛋白酶恢復。前馮?維勒布蘭德因子(vWF)成熟至其活性形式需要在殘基763處的氨基二羧酸對(-Lys-Arg-)之后進行蛋白水解加工。已經顯示vWF優(yōu)選地通過成對氨基二羧酸裂解酶成對堿性氨基酸蛋白酶進行加工。因此，vWF的產生過程包括使用成對堿性氨基酸蛋白酶，優(yōu)選在高度穩(wěn)定化的制劑中。另一方面，與放置于對照稀釋劑中的對照制劑相比，在這種稀釋劑中的高度穩(wěn)定化的制劑使成對堿性氨基酸蛋白酶在rVWF成熟步驟中的活性恢復增加3至4倍。
[0159]在某些方面，本發(fā)明的高度穩(wěn)定化的制劑具有至少6個月的保質期。應理解，這種保質期可以是在冷凍溫度(即，-80°C、-25°C、0°C )、冷藏(0°C至10°C )、或室溫(20°C至32°C )下呈液體或凍干形式。在其它方面，本發(fā)明的高度穩(wěn)定化的制劑具有至少12、18、24、
30、36、42、48、54或 60個月的保質期。
[0160]在其它方面并且根據上述方面，通過在于任何上述溫度下儲存任何上述時間段之后剩余的百分比活性來測定保質期。在某些實施方案中，保質期意指與在于任何上述溫度下儲存任何上述時間量之前的活性相比，如通過本文所描述或本領域中已知的任何測定所測量，制劑保留至少 10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%的成對堿性氨基酸蛋白酶活性。
[0161]一方面，根據本公開的成對堿性氨基酸蛋白酶(例如，重組成對堿性氨基酸蛋白酶)的高度穩(wěn)定化的制劑包含:(a) 8，000U/mL至57，000U/mL成對堿性氨基酸蛋白酶(例如，重組成對堿性氨基酸蛋白酶)；(b) 190mM氯化鈉；(c) 0.92mM氯化鈣；(d) 10%w/w海藻糖二水合物；(e)75ppm 聚山梨酯 80 ； (f) 45mM 乙酸；以及(g) 46mMHEPES。
[0162]在某些方面，本公開的高度穩(wěn)定化的制劑包含以下組分:47mMHEPES、46mM乙酸、195mM氯化鈉、0.094mM氯化鈣、0.0075%聚山梨酯80、10%w/w海藻糖二水合物，pH6.0。
[0163]在其它方面，根據本公開的成對堿性氨基酸蛋白酶(包括重組成對堿性氨基酸蛋白酶)的高度穩(wěn)定化的制劑包含:(a)約5，500U/mL至55，000U/mL、6，000U/mL至50，000U/mL、6，500U/mL 至 45，000U/mL、7, 000U/mL 至 40，000U/mL、7, 500U/mL 至 35，000U/mL、8，OOOU/mL 至 30，000U/mL、8, 500U/mL 至 25，000U/mL、9, OOOU/mL 至 20，000U/mL、9, 500U/mL至15，000U/mL、或10，OOOU/mL成對堿性氨基酸蛋白酶；(b)約IOOmM至300mM、IlOmM至280mM、120mM 至 260mM、130mM 至 240mM、140mM 至 220mM、150mM 至 200mM、或 160mM 至 180mM氯化鈉；(c)約 0.5mM 至 9mM、ImM 至 8mM、1.5mM 至 7mM、2mM 至 6mM、2.5mM 至 5mM、或 3mM 至
4.5mM 氯化鈣；(d)約 0.5% 至 19%、1% 至 18%、1.5% 至 17%、2.0% 至 16%、2.5% 至 15%、3.0% 至14%,3.5% 至 13%、4.0% 至 12%、4.5% 至 11%,5.0% 至 10%,5.5% 至 9%、或 6.0% 至 8% 海藻糖二水合物；(e)約 0.5ppm 至 140ppm、1.0ppm 至 130ppm、IOppm 至 120ppm、20ppm 至 llOppm、30ppm 至 100ppm、40ppm 至 95ppm、50ppm 至 90ppm、55ppm 至 85ppm、60ppm 至 80ppm、或 70ppm至 75ppm 聚山梨酯 80 ; (f)約 25mM 至 90mM、30mM 至 80mM、35mM 至 70mM、40mM 至 60mM、或45mM 至 50mM 乙酸；以及(g) 15mM 至 95mM、20mM 至 90mM、25mM 至 85mM、30mM 至 80mM、35mM 至75mM、40mM 至 70mM、45mM 至 65mM、或 50mM 至 60mM HEPES。
[0164]一方面，本公開提供一種穩(wěn)定化的成對堿性氨基酸蛋白酶水性組合物(例如，重組成對堿性氨基酸蛋白酶)，所述組合物包含:成對堿性氨基酸蛋白酶(例如，重組成對堿性氨基酸蛋白酶)、2%至20%糖或糖醇、IOppm至200ppm非離子型表面活性劑、50mM至500mM藥學上可接受的鹽、0.5mM至IOmM鈣、緩沖劑，以及5.5至7.5的pH。在具體實施方案中，糖是戊糖或己糖。
[0165]在一個實施方案中，穩(wěn)定化的成對堿性氨基酸蛋白酶水性組合物(例如，重組成對堿性氨基酸蛋白酶)包含:成對堿性氨基酸蛋白酶(例如，重組成對堿性氨基酸蛋白酶)、100mM至300mM藥學上可接受的鹽、0.5mM至2mM鈣、2%至20%糖或糖醇、IOOppm至200ppm非離子型表面活性劑、IOmM至200mM緩沖劑，以及5.5至7.5的pH。在具體實施方案中，糖是戊糖或己糖。
[0166]在具體實施方案中，本發(fā)明的高度穩(wěn)定化的制劑包含以下組分:47mM HEPES、46mM乙酸、195mM氯化鈉、0.094mM氯化鈣、0.0075%聚山梨酯80、10%w/w海藻糖二水合物，pH6.0。
[0167]在另一個具體實施方案中，根據本發(fā)明的成對堿性氨基酸蛋白酶(例如，重組成對堿性氨基酸蛋白酶)的高度穩(wěn)定化的制劑包含:(a)8，000U/mL至57，000U/mL重組成對堿性氨基酸蛋白酶；(b) 190mM氯化鈉；(c)0.92mM氯化鈣；(d) 10%w/w海藻糖二水合物；
(e)75ppm 聚山梨酯 80 ； (f) 45mM 乙酸；以及(g) 46mM HEPES。
[0168]A.穩(wěn)定劑
[0169]有利地，據發(fā)現包含糖、糖醇以及非離子型表面活性劑使水性成對堿性氨基酸蛋白酶(例如，重組成對堿性氨基酸蛋白酶)組合物穩(wěn)定化。這些作用在本文所提供的實施例中證明。例如，添加這些試劑使液體`儲存后成對堿性氨基酸蛋白酶活性保留率增加、液體儲存后成對堿性氨基酸蛋白酶多肽的聚集減少、液體儲存后成對堿性氨基酸蛋白酶多肽的降解減少、成對堿性氨基酸蛋白酶水性組合物攪拌后成對堿性氨基酸蛋白酶活性的損失減少、并且使由攪拌成對堿性氨基酸蛋白酶水性組合物引起的聚集減少。
[0170]因此，在一個實施方案中，本公開提供一種成對堿性氨基酸蛋白酶水性組合物(例如,重組成對堿性氨基酸蛋白酶組合物)，所述組合物包含2%至20%糖或糖醇和IOppm至200ppm非離子型表面活性劑。在另一個實施方案中，組合物包含2%至10%糖或糖醇和IOppm至IOOppm非離子型表面活性劑。在另一個實施方案中，組合物包含10±2%糖或糖醇和75±25ppm非離子型表面活性劑。在具體實施方案中，組合物包含10%糖或糖醇和75ppm非離子型表面活性劑。在又其它實施方案中，組合物包含糖或糖醇與非離子型表面活性劑的組合，所述組合選自表1至表9中發(fā)現的變化形式I至變化形式6035。
[0171]表1.適用于成對堿性氨基酸蛋白酶(例如，重組成對堿性氨基酸蛋白酶)組合物的穩(wěn)定化的糖或糖醇與非離子型表面活性劑濃度的組合的示例性實施方案。
【權利要求】
1.一種重組成對堿性氨基酸蛋白酶(recombinant furin)(重組成對堿性氨基酸蛋白酶(rfurin))的穩(wěn)定化水性組合物，所述組合物包含: (a)8，000U/mL至500，000U/mL重組成對堿性氨基酸蛋白酶； (b)IOOmM至300mM藥學上可接受的鹽；
(c)0.5mM 至 2mM 鈣； (d)2%至20%糖或糖醇； (e)IOppm至200ppm非離子型表面活性劑； (f)IOmM至200mM緩沖劑；以及
(g)5.5 至 7.5 的 pH。
2.如權利要求1所述的組合物，其包含150mM至250mM藥學上可接受的鹽。
3.如權利要求2所述的組合物，其包含190±IOmM藥學上可接受的鹽。
4.如權利要求3所述的組合物，其包含190mM藥學上可接受的鹽。
5.如權利要求1至4中任一項所述的組合物，其中所述藥學上可接受的鹽是氯化鈉。
6.如權利要求1至4中任一項所述的組合物，其中所述藥學上可接受的鹽是氯化鉀。
7.如權利要求1至6中任 一項所述的組合物，其包含0.9±0.2mM鈣。
8.如權利要求7所述的組合物，其包含0.92mM鈣。
9.如權利要求1至8中任一項所述的組合物，其包含5%至15%糖或糖醇。
10.如權利要求9所述的組合物，其包含10±2%糖或糖醇。
11.如權利要求10所述的組合物，其包含10%糖或糖醇。
12.如權利要求1至11中任一項所述的組合物，其中所述糖或糖醇選自由以下各項組成的組:蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其組合。
13.如權利要求1至11中任一項所述的組合物，其中所述糖或糖醇是海藻糖。
14.如權利要求1至11中任一項所述的組合物，其中所述糖或糖醇是蔗糖。
15.如權利要求1至14中任一項所述的組合物,其包含IOppm至IOOppm非離子型表面活性劑。
16.如權利要求15所述的組合物,其包含50ppm至IOOppm非離子型表面活性劑。
17.如權利要求16所述的組合物，其包含75ppm非離子型表面活性劑。
18.如權利要求1至17中任一項所述的組合物，其中所述非離子型表面活性劑是聚山梨酯80。
19.如權利要求1至18中任一項所述的組合物，其包含50mM至150mM緩沖劑。
20.如權利要求19所述的組合物，其包含90±10mM緩沖劑。
21.如權利要求20所述的組合物，其包含91mM緩沖劑。
22.如權利要求1至21中任一項所述的組合物，其中所述緩沖劑包含乙酸鹽。
23.如權利要求1至21中任一項所述的組合物，其中所述緩沖劑包含HEPES。
24.如權利要求1至21中任一項所述的組合物，其中所述緩沖劑包含MES。
25.如權利要求1至21中任一項所述的組合物，其中所述緩沖劑包含乙酸鹽和HEPES。
26.如權利要求25所述的組合物，其包含25mM至75mM乙酸鹽和25mM至75mMHEPES。
27.如權利要求26所述的組合物，其包含45±5mM乙酸鹽和45±5mMHEPES。
28.如權利要求27所述的組合物，其包含45mM乙酸鹽和46mMHEPES。
29.如權利要求1至28中任一項所述的組合物，其具有5.5至7.0的pH。
30.如權利要求29所述的組合物，其具有5.5至6.5的pH。
31.如權利要求30所述的組合物，其具有6.0±0.2的pH。
32.如權利要求31所述的組合物，其具有6.0的pH。
33.如權利要求1至32中任一項所述的組合物，其中所述組合物在于37°C下儲存時與不包含糖或糖醇的重組成對堿性氨基酸蛋白酶組合物相比具有增加的穩(wěn)定性。
34.如權利要求33所述的組合物，其中所述組合物在于37°C下儲存時與不包含糖或糖醇的重組成對堿性氨基酸蛋白酶組合物相比維持較高的重組成對堿性氨基酸蛋白酶活性百分比。
35.如權利要求33或34所述的組合物，其中所述組合物在于37°C下儲存時與不包含糖或糖醇的重組成對堿性氨基酸蛋白酶組合物相比維持較高的重組成對堿性氨基酸蛋白酶單體含量百分比。
36.如權利要求1至35中任一項所述的組合物，其中所述組合物在攪拌時與不包含非離子型表面活性劑的重組成對堿性氨基酸蛋白酶組合物相比具有增加的穩(wěn)定性。
37.如權利要求36所述的組合物，其中所述組合物在攪拌時與不包含非離子型表面活性劑的重組成對堿性氨基酸蛋白酶組合物相比維持較高的重組成對堿性氨基酸蛋白酶活性百分比。
38.如權利要求36或37所述的組合物，其中所述組合物在攪拌時與不包含非離子型表面活性劑的重組成對堿性氨 基酸蛋白酶組合物相比維持較高的重組成對堿性氨基酸蛋白酶單體含量百分比。
39.如權利要求1至38中任一項所述的組合物，其中所述組合物在稀釋時與不包含非離子型表面活性劑的重組成對堿性氨基酸蛋白酶組合物相比具有增加的穩(wěn)定性。
40.如權利要求39所述的組合物，其中所述組合物在稀釋時與不包含非離子型表面活性劑的重組成對堿性氨基酸蛋白酶組合物相比維持較高的重組成對堿性氨基酸蛋白酶活性百分比。
41.如權利要求39或40所述的組合物，其中所述組合物在稀釋時與不包含非離子型表面活性劑的重組成對堿性氨基酸蛋白酶組合物相比維持較高的重組成對堿性氨基酸蛋白酶單體含量百分比。
42.一種重組成對堿性氨基酸蛋白酶(recombinant furin)(重組成對堿性氨基酸蛋白酶(rfurin))的穩(wěn)定化水性組合物，所述組合物包含: (a)8，000U/mL至500，000U/mL重組成對堿性氨基酸蛋白酶； (b)I9OmM氯化鈉；
(c)0.92mM 鈣； (d)10%海藻糖； (e)75ppm聚山梨酯80 ；
(f)45mM 乙酸；
(g)46mM HEPES ;以及
(g)5.5 至 7.5 的 pH。
43.如權利要求42所述的組合物，其具有5.5至7.0的pH。
44.如權利要求42所述的組合物，其具有5.5至6.5的pH。
45.如權利要求42所述的組合物，其具有6.0±0.2的pH。
46.如權利要求42所述的組合物，其具有6.0的pH。
47.一種用于稀釋重組成對堿性氨基酸蛋白酶水性組合物的方法，所述方法包括向所述重組成對堿性氨基酸蛋白酶水性組合物添加包含IOppm至200ppm非離子型表面活性劑的稀釋緩沖液，從而形成稀釋的重組成對堿性氨基酸蛋白酶組合物。
48.如權利要求43所述的方法，其中所述稀釋緩沖液包含IOppm至IOOppm非離子型表面活性劑。
49.如權利要求48所述的方法,其中所述稀釋緩沖液包含50ppm至IOOppm非離子型表面活性劑。
50.如權利要求49所述的方法，其中所述稀釋緩沖液包含75ppm非離子型表面活性劑。
51.如權利要求43至50中任一項所述的方法，其中所述稀釋緩沖液具有5.5至7.5的pH。
52.如權利要求51所述的方法，其中所述稀釋緩沖液具有5.5至6.5的pH。
53.如權利要求52所述的方法，其中所述稀釋緩沖液具有6.0±0.2的pH。
54.如權利要求53所述的方法，其中所述稀釋緩沖液具有6.0的pH。
55.如權利要求43至51中 任一項所述的方法，其中所述稀釋的重組成對堿性氨基酸蛋白酶組合物包含至少50%在稀釋前存在于所述重組成對堿性氨基酸蛋白酶水性組合物中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶活性。
56.如權利要求55所述的方法，其中所述稀釋的重組成對堿性氨基酸蛋白酶組合物包含至少75%在稀釋前存在于所述重組成對堿性氨基酸蛋白酶水性組合物中的重組成對堿性氨基酸蛋白酶活性。
【文檔編號】A61K47/12GK103889454SQ201280038218
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年6月4日 優(yōu)先權日:2011年6月2日
【發(fā)明者】M·哈斯拉赫爾, A·齊特科維茲, C·懷特, K·弗蘭克 申請人:巴克斯特國際公司, 巴克斯特保健股份有限公司