專利名稱：一種磁珠富集法開發(fā)菜豆ssr引物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種磁珠富集法開發(fā)菜豆SSR引物的制備方法， 該方法適用于所有的菜豆品種、品系或種質(zhì)資源材料。
背景技術(shù)：
SSR標(biāo)記雖然效果好，可靠性高，但其關(guān)鍵點(diǎn)又在于SSR引物的開發(fā)。只有在有一定數(shù)量的SSR引物之后，才可能對某一物種進(jìn)行SSR標(biāo)記的分析。特別是對于沒有測序過的生物物種，對于其DNA堿基序列知之甚少或一無所知的物種只能利用一些特殊的方法得到這種重復(fù)序列以及其兩邊的側(cè)翼序列來設(shè)計SSR引物。目前SSR引物的來源，概括起來有以下四種途徑1.關(guān)文獻(xiàn)；2.近緣種的引物(例如同屬不同種)；3.數(shù)據(jù)庫搜尋法在 GenBank等公共數(shù)據(jù)庫中搜尋SSR序列，根據(jù)側(cè)翼序列設(shè)計引物；4.自己從研究對象基因組文庫中篩選SSR位點(diǎn)兩翼序列設(shè)計引物。針對那些大多數(shù)測序很少的物種第4種方法幾乎是唯一途徑，也是最根本、有效的方法。從基因組文庫得到SSR位點(diǎn)的方法目前又包括了經(jīng)典方法、富集法和省略篩庫法。建立所研究物種的基因組文庫，然后用含有SSR的探針與之雜交，篩選陽性克隆， 測序，根據(jù)SSR兩側(cè)的DNA序列設(shè)計引物。該傳統(tǒng)方法又可分為兩種一是一種是篩選大插入片段基因組文庫，顯示出與探針有強(qiáng)雜交信號的克隆被進(jìn)一步純化，分成亞克隆， 然后又一次雜交篩選含重復(fù)序列的克隆。另一種是將基因組DNA用限制性內(nèi)切酶消化成 200-1500bp的小片段，也可以用超聲波處理基因組DNA，得到的片段相對更小，200-600bp， 再用DNA聚合酶I的Klenow大片段將它補(bǔ)平。構(gòu)建和篩選小插入片段基因組文庫。兩種方法各有缺點(diǎn)，第一種對大的亞克隆難以測序，第二種得到SSR陽性克隆的得率很低，只有 2% _3%。這種傳統(tǒng)經(jīng)典方法開發(fā)引物的效率很低，但操作簡單，易掌握，在現(xiàn)已獲得的SSR 標(biāo)記中，四分之三以上的是利用經(jīng)典方法開發(fā)出的。富集法通過建立和篩選微衛(wèi)星富集文庫，提高了 SSR克隆的得率。它又分為利用含SSR的PCR引物進(jìn)行PCR富集(即引物法富集)和用含SSR的探針進(jìn)行雜交富集(即雜交法富集)兩種方法。引物法富集微衛(wèi)星一般是指使用同目的微衛(wèi)星重復(fù)互補(bǔ)的寡核苷酸作為引物，通過PCR反應(yīng)在文庫構(gòu)建前或構(gòu)建后富集微衛(wèi)星位點(diǎn)。Elaine等以狗的基因組DNA為材料， 采用經(jīng)典方法先獲得一個小插入片段的初級基因組文庫，然后以5'磷酸化的核苷酸(CA) η為引物進(jìn)行一步PCR，轉(zhuǎn)化到細(xì)菌，得到一個含(CA)n富集文庫。隨機(jī)挑取單克隆培養(yǎng)后轉(zhuǎn)膜，雜交，再次篩選，得到的結(jié)果是40% -50%都是陽性克隆，比之前的傳統(tǒng)方法效率提高了 50 倍(Elaine et al.，1992)。目前使用較多的引物開發(fā)策略是基于選擇性雜交的富集方法，具有代表性的是兩種雜交方法，根據(jù)所使用的介質(zhì)不同分為尼龍膜法和磁珠富集法。尼龍膜法通過吸附在尼龍膜上的許多微衛(wèi)星探針來富集基因組中的微衛(wèi)星片段；洗脫結(jié)合片段；進(jìn)行PCR擴(kuò)增；連接載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌；陽性克隆測序。應(yīng)用尼龍膜法，eiovarmim用11個微衛(wèi)星重復(fù)探針從Saccharum spp中篩選微衛(wèi)星位點(diǎn)，富集效率提高了 40%。磁珠富集法的基本原理是首先用生物素標(biāo)記重復(fù)序列特異探針并與基因組DNA酶切片段雜交，再利用生物素與鏈親和素親和性強(qiáng)的特性，用包被鏈親和素的磁珠進(jìn)行磁力吸附完成重復(fù)序列目標(biāo)片段的富集。經(jīng)過磁珠富集后使克隆測序量大幅下降且使獲得具有重復(fù)序列的片段的效率大幅度提高，因此，成為SSR引物開發(fā)極其有效的方法而迅速得到廣泛應(yīng)用。目前利用磁珠富集法開發(fā)SSR 引物的報道有很多。李炬等將馬尾松核基因組DNA用Sau3A I酶切后回收300_1000bp片段，連接接頭， PCR后與用生物素標(biāo)記的微衛(wèi)星探針(AC) 15、(AG) 15雜交；運(yùn)用磁珠富集含有微衛(wèi)星序列的DNA片段。將獲得的序列通過PCR擴(kuò)增后，連接pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌，得到微衛(wèi)星序列文庫。然后用PCR法直接對文庫進(jìn)行擴(kuò)增，獲得58個陽性克隆，經(jīng)測序分析， 獲微衛(wèi)星序列33個，最后成功設(shè)計出馬尾松微衛(wèi)星引物19對(李炬等，2007)。孫效文等將草魚(Ctenopharyngodon idella)基因組DNA經(jīng)Sau3AI酶切，回收純化400-900bp片段，連上接頭，構(gòu)建“基因組PCR文庫”。用生物素標(biāo)記的(CA) 15作探針與其雜交，雜交復(fù)合物結(jié)合到包被有鏈霉親和素的磁珠上，經(jīng)一系列的洗滌過程，富集含有微衛(wèi)星的片段。PCR擴(kuò)增放大微衛(wèi)星片段，再進(jìn)行克隆和測序，根據(jù)微衛(wèi)星兩端的保守序列設(shè)計引物，并且還通過同位素標(biāo)記的探針(CA) 15進(jìn)行二次雜交篩選，獲得陽性克隆132個，所得到的陽性克隆經(jīng)測序，86. 36%含有微衛(wèi)星序列，共獲得130個微衛(wèi)星DNA序列，設(shè)計SSR 引物83對(孫效文等，2005)。從報道的文獻(xiàn)來看磁珠富集法只要通過幾步簡單的操作就能得到富含微衛(wèi)星位點(diǎn)的DNA片段，減低了實驗成本，縮短了實驗周期，且成功率高，是目前較為簡單有效的SSR 引物開發(fā)方法。菜豆(Phaseolus vulgaris L.)是世界上種植面積最大的食用豆類之一。菜豆原產(chǎn)中南美洲，中國栽培的菜豆是15世紀(jì)直接從美洲引入，“中國中心”被認(rèn)為是菜豆的次級起源中心，具有豐富的遺傳多樣性。菜豆是我國重要蔬菜種類，在我國栽培歷史悠久。普通菜豆在我國分布地區(qū)廣泛，品種資源非常豐富。中國大部分省(市、區(qū))有菜豆分布，但主要分布于黑龍江、內(nèi)蒙古、山西、陜西、湖北、四川、貴州、云南等省區(qū)。據(jù)不完全統(tǒng)計中國普通菜豆播種面積近120. 51萬公頃。目前已進(jìn)行了農(nóng)藝性狀鑒定并編入中國食用豆類品種資源目錄的普通菜豆資源有4480份，這些資源已入國家種質(zhì)庫保存。M. R. Escribano等對種植在西班牙西北部4種不同環(huán)境中的56個菜豆品種的18個農(nóng)藝性狀進(jìn)行了遺傳多樣性研究結(jié)果顯示品種間所有性狀均有顯著差異且多數(shù)性狀有顯著的基因環(huán)境互作效應(yīng)。欒非時等對60個菜豆品種資源黑龍江省43個栽培種國際熱帶農(nóng)業(yè)中心13個半野生種和波蘭4個矮生品種的形態(tài)標(biāo)記進(jìn)行了聚類分析結(jié)果將之分為兩大類即矮生種為一類蔓生種及半野生種合為一類。中國農(nóng)科院蔬菜花卉所張赤紅等對3M份普通菜豆種質(zhì)資源的10個農(nóng)藝性狀進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，我國普通菜豆種質(zhì)資源具有豐富的形態(tài)多樣性，平均多樣性指數(shù)為 1. 632，高于國外材料，并利用36對SSR引物對332份國內(nèi)普通菜豆、16份國外普通菜豆和 29份野生菜豆的遺傳多樣性進(jìn)行了分析。徐兆生等對38份菜豆種質(zhì)進(jìn)行了田間綜合鑒定評價，以選出綜合性狀優(yōu)良的優(yōu)異種質(zhì)，提供生產(chǎn)和科研利用。中國農(nóng)科院作物品種資源研究所、蔬菜花卉所、江蘇省沿海地區(qū)農(nóng)科所、東北農(nóng)大等單位進(jìn)行了菜豆品種資源的收集，并對資源進(jìn)行了綜合評價，認(rèn)為我國普通菜豆種質(zhì)資源具有豐富的形態(tài)多樣性，平均多樣性指數(shù)高于國外材料，菜豆種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)較寬，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳變異主要存在于蔓生種群內(nèi)部，菜豆變種群內(nèi)遺傳多樣性較為豐富，可以作為育種材料儲備種質(zhì)資源。并從中篩選出一批抗病性強(qiáng)、嫩莢蛋白質(zhì)含量高的優(yōu)良種質(zhì)材料。分子育種包括分子標(biāo)記輔助選擇(MAQ和利用基因工程手段育種。分子標(biāo)記輔助選擇是分子標(biāo)記技術(shù)用于作物改良的重要領(lǐng)域，是傳統(tǒng)育種技術(shù)和現(xiàn)代生物技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。有很多重要性狀(如產(chǎn)量和后期葉部或穗部病害抗性等)只有在成熟植株上才能表現(xiàn)出來，因此采用傳統(tǒng)方法在播種后數(shù)月或數(shù)年均不能對其進(jìn)行選擇。而利用分子標(biāo)記就可以對幼苗(甚至對種子)進(jìn)行檢測，從而大大節(jié)省培育植株所浪費(fèi)的人力、物力和財力。在眾多的分子標(biāo)記中SSR分子標(biāo)記具有共顯性、多態(tài)性豐富、在豆類基因組中分布廣等眾多優(yōu)點(diǎn)。目前只是對已知的編碼序列的微衛(wèi)星進(jìn)行了篩選和鑒定，大量的非編碼區(qū)的微衛(wèi)星還有待開發(fā)和利用。因此本發(fā)明以中國菜豆為研究對象開在整個基因組范圍內(nèi)開發(fā)出更多菜豆品種的SSR引物。綜上所述，菜豆在我國需求量非常大，在蔬菜中占有重要的地位，同時我國的菜豆種質(zhì)資源豐富，遺傳多樣性多，因此急需開發(fā)更多的SSR引物，將分子標(biāo)記輔助育種與常規(guī)育種結(jié)合起來才能加速菜豆育種的進(jìn)程，培育新品種，迅速實現(xiàn)社會和經(jīng)濟(jì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種磁珠富集法開發(fā)菜豆SSR引物的制備方法，利用磁珠法進(jìn)行SSR引物開發(fā)，能夠簡單、快速地篩選菜豆整個基因組中的微衛(wèi)星序列，在短時間內(nèi)能開發(fā)大量的SSR引物，只有開發(fā)一定數(shù)量的SSR引物之后，才可能對某一物種進(jìn)行 SSR標(biāo)記的分析。因此，本發(fā)明能為菜豆遺傳圖譜的構(gòu)建以及基因定位等工作需要大量的 SSR分子標(biāo)記的實現(xiàn)提供了保障。一種磁珠富集法開發(fā)菜豆SSR引物的制備方法，包括下列步驟1.菜豆基因組DNA的提取選取具有菜豆一般特征的菜豆品種。按照常規(guī)的栽培管理和肥水措施種植，待小苗長出5-6片葉子，取嫩葉0. 4克利用CTAB法提取基因組DNA。所述的菜豆，又稱蕓豆(俗稱二季豆或四季豆)，豆科科菜豆屬。蕓豆適宜在溫帶和熱帶高海拔地區(qū)種植，比較耐冷喜光屬異花授粉菜豆、短日照作物，蕓豆根系發(fā)達(dá)，葉綠色，互生，心臟形，花為蟲葉形花，總狀花序，花梗長15-18厘米。開花多結(jié)莢少。它營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量高，即是蔬菜又是糧食，還可作糕點(diǎn)和豆餡，是出口創(chuàng)匯的重要農(nóng)副產(chǎn)品。蕓豆學(xué)名菜豆，蝶形花科菜豆屬。2.提取基因組DNA濃度的檢測提取基因組DNA的濃度用分光光度計檢測。能夠進(jìn)行SSR引物開發(fā)的基因組DNA 濃度要達(dá)到100ng-lug/ul。3.酶切基因組DNA 用Mse I對菜豆基因組DNA進(jìn)行酶切，利用AFLP擴(kuò)增原理在酶切片斷的兩端加上單鏈寡核苷酸接頭，并用與接頭配套的接頭引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增放大，創(chuàng)建基因組PCR文庫， 對文庫進(jìn)行純化。
4. Mse I酶切片段加接頭酶切DNA 產(chǎn)物用 Mse I 接頭(接頭序列01igo_MseI A5-TACTCAGGACTCAT-3‘, Oligo-Mse I B 5-GACGATGAGTCCTGAG-3，)加 T4 DNAligase 進(jìn)行連接，混勻后，置 16°C恒溫水浴鍋溫浴過夜，然后放在4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?.酶切連接的PCR預(yù)擴(kuò)增以步驟4酶切連接好的產(chǎn)物為模板，以MseI-N :5，-GATGAGTCCTGAGTAAN-3，為弓丨物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件第一步1個循環(huán)，94°C 5min，第二步18個循環(huán)，94°C lmin, 53°C lmin,72°C lmin，第三步1個循環(huán)72°C 10min，4°C保存。反應(yīng)產(chǎn)物使用1%W/V瓊脂糖電泳檢測，剛好出現(xiàn)彌散區(qū)即可，如圖1。6. PCR預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物與生物素探針雜交在合適的溫度(66_70°C )下使得PCR文庫與所選用的生物素標(biāo)記的重復(fù)O堿基重復(fù)10-15次，3或4堿基重復(fù)5-8次)序列探針進(jìn)行雜交；由于磁珠的表面包被有一層鏈霉親和素，并且這種鏈霉親和素與生物素有很強(qiáng)的親和力，因此生物素標(biāo)記的探針與含重復(fù)序列單元的DNA片斷雜交結(jié)合以后，就可以很容易地被磁珠吸附，通過非嚴(yán)格洗脫和嚴(yán)格洗脫(見下文)并用磁場固定，可以很容易地去除未被雜交的DNA片斷其他成分，從而達(dá)到高度富集微衛(wèi)星序列的目的；在變性條件下含重復(fù)序列的微衛(wèi)星DNA被TE緩沖液洗脫； 將洗脫液純化以后作為DNA模板。雜交體系總體積為100 μ L，總共平行配制2管(分別為(AC)13(AG)13)然后分裝， 進(jìn)行雜交。在PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序為95°C變性5min ；最適雜交溫度(66_70°C )下保持 l_2h。雜交反應(yīng)完畢后往反應(yīng)體系中加入300 μ L TEmOO溶液，混勻后置于4°C保存?zhèn)溆谩?將加有300 μ L ΤΕΝ100的雜交混合液加入到經(jīng)過預(yù)處理的磁珠中，室溫Q0_25°C，以下相同)上放置30min，期間不時輕輕地攪動或吹打溶液，避免磁珠沉淀從而更有效地吸附雜交后的DNA。然后對雜交的磁珠進(jìn)行非嚴(yán)格洗脫(用400 μ L ΤΕΝ1000于室溫下洗滌磁珠3 次，每次5min，不時攪動或吹打混合物。3次漂洗后再用400 μ L預(yù)熱至55°C的TEmOOO溶液洗滌 1 次)和嚴(yán)格洗滌(用 400 μ L 0. 2XSSC(3M NaCl，0· 3M Na3C6H5O7. 2H20 ；pH7. 0，以下相同)+0. 1% (0. Ig SDS，100ml 2d H2O,以下相同)SDS溶液于室溫下洗滌磁珠3次，每次5min，不時攪動或吹打混合物。三次漂洗后再用400 μ L預(yù)熱至55°C的0. 2 X SSC+0. 1 % SDS溶液洗滌1次。用磁架固定磁珠，移去洗滌液)。加入50 μ L ΤΕ8.0，用移液器吸打均勻，然后于95°C下水浴5min。不時攪動或吹打混合物。用磁架固定磁珠，迅速吸出上清液， 凍存于-20°C，取得目的DNA片段。以洗脫產(chǎn)物為底物，以MseI-N為引物，用純化后的5 μ L 目的DNA洗脫片段用于PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件與上面的PCR預(yù)擴(kuò)增條件一致，擴(kuò)增30個循環(huán)。7.連接轉(zhuǎn)化克隆將純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到T載體上進(jìn)行克隆。具體操作依照TaKaRa公司提供的PMD 18-T載體連接試劑盒(購自!Iomega)使用說明書。連接反應(yīng)體系為10μ L，其構(gòu)成見表1。連接條件為16 °C Ihr。表IDNA片段與T載體連接反應(yīng)體系
7反應(yīng)成分體積
^ ,Ligation buffer5
pMD 18-T vector1
PCR 產(chǎn)物(<100ng)4Total_^_于-70°C冰箱中取出一管感受態(tài)細(xì)胞(M15，100 μ L)，立即置于冰浴中使其剛剛?cè)诨?如果是新鮮制作的感受態(tài)細(xì)胞，可以直接加入連接混合物)。然后加入5yL連接產(chǎn)物， 冰浴30min。冰浴結(jié)束后42°C熱激90sec，再冰浴5min，然后加入ImL預(yù)冷的液體LB培養(yǎng)基 (不含氨芐)，于37°C的搖床(150rpm)上復(fù)蘇培養(yǎng)45min。復(fù)蘇培養(yǎng)結(jié)束后于4°C IOOOOrpm 離心lmin，以沉淀細(xì)胞；去上清，剩余200-300 μ L培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。往每個LB平板上加入4yL IPTG和40 μ L X_gal，涂布均勻，每100 μ L菌液涂一個平板，待液體吸收完畢后 (15min左右)，將平板倒置于37°C過夜(12_16hr)。8.陽性克隆的挑取、培養(yǎng)、篩選和測序挑選陽性克隆用載體通用引物測序，得到的插入片斷的DNA序列，挑選出合適的微衛(wèi)星DNA序列。將培養(yǎng)好的平板(菌落生長良好并且分布均勻)在4°C放置若干小時，使菌落充分顯色。用無菌牙簽挑取白色克隆到500 μ L(含50 μ LAmp)液體培養(yǎng)基中。37°C搖床上以200rmp轉(zhuǎn)速培養(yǎng)過夜，4°C保存菌液。取1 μ L 菌液用于 PCR 模板。擴(kuò)增條件為95 "C 5min ；94 "C 40s ；54 "C 30s ； 720C Imin ；循環(huán)30次；72°C 7min。取2 μ L產(chǎn)物于1 % ff/V瓊脂糖凝膠上電泳，用全自動凝膠成像分析系統(tǒng)記錄電泳結(jié)果；瓊脂糖凝膠上電泳，并用全自動凝膠成像分析系統(tǒng)記錄電泳結(jié)果。將含有插入片段并且大小合適G50_800bp)的陽性克隆取一半菌液送北京華大中生科技發(fā)展有限公司測序(圖2)。另一半加入20% V/V滅菌甘油，混勻后于-70°C凍存?zhèn)浞荨Ｓ肕13+通用引物測序，測序在ABI 3730XL DNA kquencer上進(jìn)行，所用反應(yīng)試劑為 ABI PRISM BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction KitMEM^i^^i 長度可達(dá)700-800bp左右。對于含有較好重復(fù)片段的序列，用M13引物從另外一段進(jìn)行測序，并將正反向測序結(jié)果進(jìn)行拼接，以確保序列的準(zhǔn)確性。9.序列分析和微衛(wèi)星位點(diǎn)的分類與設(shè)計用軟件SSRHunter (version 1. 3. 0 ；李強(qiáng))從得到的序列中查找出含有重復(fù)單元的微衛(wèi)星序列。反其中重復(fù)次數(shù)較多O堿基重復(fù)10-15次，3或4堿基重復(fù)5-8次)、測序結(jié)果非常好、并且重復(fù)區(qū)域兩翼具有足夠保守區(qū)的序列作為微衛(wèi)星位點(diǎn)。下圖顯示一個理想的微衛(wèi)星位點(diǎn)的DNA序列(圖3)及其測序峰形圖(圖4)根據(jù)Weber (1990)提出的標(biāo)準(zhǔn)將微衛(wèi)星分為3類完美型(perfect)，指沒有中斷的或附近沒有其它種類重復(fù)序列的重復(fù)序列；非完美型(imperfect)，指2個或以上的同種重復(fù)序列被3個堿基以下的非重復(fù)序列所間隔；復(fù)合型(compound)，指一種重復(fù)序列與其它種類的重復(fù)序列被3個以下的非重復(fù)序列所間隔。先將挑選出的微衛(wèi)星序列用在線工具VecScreen (http://www. ncbi.nlm.nih.Rov/VecScreen/)去除載體序列，然后在序列上標(biāo)記出Mse I接頭(A和B)的位置，再用引物設(shè)計軟件Primer Premier 5. 0(Rozen and Skaletsky 1988)在兩端接頭和核心重復(fù)區(qū)域之間設(shè)計正向和反向PCR擴(kuò)增引物，用于相應(yīng)位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增。10.微衛(wèi)星引物有效性檢驗對每個位點(diǎn)引物的有效性合多態(tài)性進(jìn)行篩選，得到有效的微衛(wèi)星位點(diǎn)。隨機(jī)挑選兩個質(zhì)量較好的DNA模板對所有合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，退火溫度優(yōu)先使用設(shè)計引物時的默認(rèn)溫度為50-62°C，若得不到擴(kuò)增產(chǎn)物或者擴(kuò)增效果不好，則對退火溫度進(jìn)行調(diào)整。微衛(wèi)星PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為15 μ L，其構(gòu)成如下表。擴(kuò)增條件為94°C 5min ； 94°C 40s, Tm 30s, 72°C 40s,35cycles ；72°C 7min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物按照 5 :1 以體積比例加入上樣緩沖液，95°C變性5分鐘后迅速置于冰上，然后在8%變性聚丙烯酰胺凝膠上加樣檢測。在上樣的同時往其中一個加樣孔加入0. lgPBR322/Msp I Marker，作為擴(kuò)增產(chǎn)物的相對分子量標(biāo)準(zhǔn)。最后用銀染的方法染色讀帶。將能夠正常擴(kuò)增的引物對用挑選出的DNA模板在最適退火溫度(50-62°C )下進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果在聚丙烯酰胺膠上電泳的結(jié)果讀帶，選擇帶型清晰，至少有兩個或兩個以上等位基因的引物篩選出來。通過本實驗共得到20對多態(tài)性好的SSR引物。本發(fā)明的特點(diǎn)磁珠富集法的是利用生物素標(biāo)記重復(fù)序列特異探針并與基因組 DNA酶切片段雜交，再利用生物素與鏈親和素親和性強(qiáng)的特性，用包被鏈親和素的磁珠進(jìn)行磁力吸附完成重復(fù)序列目標(biāo)片段的富集。經(jīng)過磁珠富集后使克隆測序量大幅下降且使獲得具有重復(fù)序列的片段的效率大幅度提高，因此，成為SSR引物開發(fā)極其有效的方法而迅速得到廣泛應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)通過幾步簡單的操作就能得到富含微衛(wèi)星位點(diǎn)的DNA片段， 減低了實驗成本，縮短了實驗周期，且成功率高，是目前較為簡單有效的SSR引物開發(fā)方法。本發(fā)明共挑取了 105個陽性克隆進(jìn)行測序，其中有48個測序序列能設(shè)計引物，從48對引物中得到了 20對有效的引物，有效引物得率為19% (20/105) M Matthew W Blair等通過基因組的對3123個EST篩選引物的得到120個有效的SSR引物，有效引物得率為3. 8% (120/3123)，由此可見本發(fā)明開發(fā)SSR引物效率高，且簡單易行，能為大批量的開發(fā)SSR引物提供保障。


圖1為一種預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物示意圖(PCR不同循環(huán)次數(shù))。“1”和“2”為不同的菜豆品種經(jīng)過酶切與接頭連接的產(chǎn)物為模板，以MseI-N: 5，-GATGAGTCCTGAGTAAN-3，為引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增；其中的 14*，16*，18*，22* 分別指 PCR 循環(huán)14次，16次，18次，22次。圖2為一種菌液PCR產(chǎn)物示意圖。圖中不同的加樣孔為以挑去的不同陽性克隆為模板，以M13為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果。選取500以上的條帶進(jìn)行測序。圖3為一種AG重復(fù)測序序列之一。該序列為完美序列，TC兩堿基重復(fù)13次，微衛(wèi)星序列位于474-499之間。圖4為一種AG重復(fù)測序峰形示意圖。TC兩堿基重復(fù)13次的微衛(wèi)星序列位于474-499之間，在它的兩側(cè)可以設(shè)計引物，就是本方法要開發(fā)的SSR引物序列之一。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。實施例1 一種磁珠富集法開發(fā)菜豆SSR引物的制備方法，其步驟是A、提取菜豆基因組DNA，對基因組進(jìn)行酶切，建立AFLP-PCR文庫菜豆品種喬育(由武漢市蔬菜科學(xué)研究所提供優(yōu)良菜豆品種，蔓生，葉色綠，花色淺黃)。這個品種是優(yōu)質(zhì)的菜豆品種，具有菜豆品種的一般特征。按照常規(guī)的栽培管理和肥水措施種植，待小苗長出5-6片葉子，取嫩葉0. 4克利用CTAB法提取基因組DNA。(I)IOml的Eppeddorf管中加入3 X CTAB提取液(含0.2% β-巰基乙醇(W/ V)，在65°C水浴鍋中預(yù)熱。(2)取0. 4克菜豆的嫩葉放到研缽中，加入適當(dāng)液氮迅速多次研磨成細(xì)粉，轉(zhuǎn)入預(yù)熱的CTAB提取液中，將離心管蓋緊以防止巰基乙醇揮發(fā)。放回水浴中保溫 (650C )40min，保溫過程中輕晃幾次，保持搖勻。(3)取出Eppenddorf管，置于冰上迅速冷卻到室溫，加入等體積的氯仿/異戊醇 (24 1)，輕微混合均勻且充分，使其徹底地混合成為乳狀液，然后4°C下離心12000rpm lOmin，輕輕將上清液吸取Iml放于1. 5ml離心管中，放于_20°C冰箱中備用。(4)上面提取的DNA中加入1倍體積冰冷的100% (V/V)乙醇。(5) 4°C，IOOOOrpm離心IOmin后，小心倒掉上清液，室溫風(fēng)干5min。(6)加入 ImlTE 和 1 μ 1 RNase (10mg/ml)，在 37°C 中保溫 40min。(7)加入等體積氯仿/異戊醇抽提一次。12000rpm離心lOmin，吸取上清液轉(zhuǎn)入另外一個Eppendorf管中，加入1/10體積的醋酸鈉和2倍體積冰冷的無水乙醇，_20°C放置 Ih0(8) IOOOOrpm離心lOmin，小心倒掉上清液。(9)加入 70% (V/V)的乙醇 Iml 洗滌 3 次，150 μ 1 TE 重懸 DNA。(10)放于-20°C冰箱中保存。提取基因組DNA的濃度用分光光度計檢測。用MseI對菜豆基因組DNA進(jìn)行酶切， 酶切反應(yīng)在PCR儀或者水浴鍋37°C反應(yīng)3h，然后65°C處理20min以滅活MseI酶。配置配 20ul 的反應(yīng)體系(NEB buffer 2 :2. O μ L，100 X NEB BSA :0. 2 μ L，MseI lOU/ul :0. 5 μ L， DNA :10 μ L，ddH20 補(bǔ)至20 μ L),酶切瓊脂糖檢測。Mse I ^ 頭 ψ 歹lj :01igo_MseI A 5-TACTCAGGACTCAT-3‘, Oligo-MseI B5-GACGATGAGTCCTGAG-3，。制備接頭將 Oligo-Mse I A 和 Oligo-Mse I B 分別配成 50 μ M 貯存液，充分溶解后，取出等體積Oligo-MseI A和Oligo-MseI B各50 μ L，充分混勻后于 94°C變性5min，取出后緩慢冷卻至室溫，保存于_20°C備用至濃度為25uM。連接體系總體系 20ul(7ul 酶切 DNA 產(chǎn)物+1. 5ul IOXligase buffer+4ul T4DNA1 igase (3U/ul)+2. 5ul MseI混合接頭)?；靹蚝螅?6°C恒溫水浴鍋溫浴過夜，然后放在4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩、酶切連接的PCR預(yù)擴(kuò)增(I)Mse I-N 引物序列 5，-GAT GAG TCC TGA GTA AN-3，(N = A，T，G，C)共四對組成混合引物。(2)預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)總體積為20 μ L，總共平行配制3管。然后分裝后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)構(gòu)成如表2 表2預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1. 一種磁珠富集法開發(fā)菜豆SSR引物的制備方法，包括下列步驟A、菜豆基因組DNA的提取選取菜豆品種，按照常規(guī)的栽培管理和肥水措施種植，小苗長出5-6片葉子，取嫩葉 0. 4克利用CTAB法提取基因組DNA ；B、提取基因組DNA濃度的檢測提取基因組DNA的濃度用分光光度計檢測，進(jìn)行SSR引物開發(fā)的基因組DNA濃度要達(dá)至Ij 100ng-lug/ul ；C、酶切基因組DNA:用Mse I對菜豆基因組DNA進(jìn)行酶切，利用AFLP擴(kuò)增原理在酶切片斷的兩端加上單鏈寡核苷酸接頭，并用與接頭配套的接頭引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增放大，創(chuàng)建基因組PCR文庫，對文庫進(jìn)行純化；D、MseI酶切片段加接頭酶切 DNA產(chǎn)物用 Mse I 接頭接頭序列 Oligo-MseI A5-TACTCAGGACTCAT-3，，Oligo-Mse I B 5-GACGATGAGTCCTGAG-3，加T4 DNAligase進(jìn)行連接，混勻后，置16°C恒溫水浴鍋溫浴過夜，然后放在4°C冰箱中保存?zhèn)溆?；E、酶切連接的PCR預(yù)擴(kuò)增以步驟D酶切連接好的產(chǎn)物為模板，以MseI-N :5，-GATGAGTCCTGAGTAAN-3，為引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件第一步1個循環(huán)，94°C 5min，第二步18個循環(huán)，94°C lmin,53°C lmin, 72°C lmin，第三步1個循環(huán)72°C lOmin，4°C保存，反應(yīng)產(chǎn)物使用W/V瓊脂糖電泳檢測；F、PCR預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物與生物素探針雜交在66-70°C下使得PCR文庫與所選用的生物素標(biāo)記的重復(fù)序列探針進(jìn)行雜交；磁珠的表面包被有一層鏈霉親和素，生物素標(biāo)記的探針與含重復(fù)序列單元的DNA片斷雜交結(jié)合以后，通過洗滌過程并用磁場固定，在變性條件下含重復(fù)序列的微衛(wèi)星DNA被TE緩沖液洗脫； 將洗脫液純化以后作為DNA模板；雜交體系總體積為100 μ L，總共平行配制2管分裝，進(jìn)行雜交，在PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序為95°C變性5min ；雜交66_70°C下保持l_2h，雜交反應(yīng)完畢后往反應(yīng)體系中加入300 μ L TENlOO溶液，混勻后置于4°C保存?zhèn)溆?，將加?00 μ L TENlOO的雜交混合液加入到經(jīng)過預(yù)處理的磁珠中，室溫上放置30min，然后對雜交的磁珠進(jìn)行洗脫，SDS溶液于室溫下洗滌磁珠3次，每次5min，三次漂洗后再用400 μ L預(yù)熱至55°C的0. 2 X SSC+0. 1 % SDS溶液洗滌1 次，加入50 μ L ΤΕ8. 0，用移液器吸打均勻，然后于95°C下水浴5min，凍存于_20°C，取得目的DNA片段，以洗脫產(chǎn)物為底物，以MseI-N為引物，用純化后的5 μ L目的DNA洗脫片段用于PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件與上面的PCR預(yù)擴(kuò)增條件一致，擴(kuò)增30個循環(huán)；G、連接轉(zhuǎn)化克隆將純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到T載體上進(jìn)行克隆，操作依照pMD 18-T載體連接， 連接反應(yīng)體系為10yL，連接條件為16°C lhr，于-70°C冰箱中取出一管感受態(tài)細(xì)胞，置于冰浴中融化，加入5 μ L連接產(chǎn)物，冰浴30min，冰浴結(jié)束后42°C熱激90seC，再冰浴5min， 然后加入ImL預(yù)冷的液體LB培養(yǎng)基，于37°C的搖床上復(fù)蘇培養(yǎng)45min，復(fù)蘇培養(yǎng)結(jié)束后于 40C IOOOOrpm離心lmin，以沉淀細(xì)胞；去上清，剩余200-300 μ L培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，往每個LB 平板上加入4 μ LIPTG和40 μ L X-gal，涂布均勻，每100 μ L菌液涂一個平板，待液體吸收完畢后，將平板倒置于37°C過夜；H、陽性克隆的挑取、培養(yǎng)、篩選和測序挑選陽性克隆用載體通用引物測序，得到的插入片斷的DNA序列，挑選出微衛(wèi)星DNA序列，將培養(yǎng)好的平板在4°C放置，使菌落顯色，用無菌牙簽挑取白色克隆到500 μ L液體培養(yǎng)基中，37°C搖床上以200rmp轉(zhuǎn)速培養(yǎng)過夜，4°C保存菌液；取 1 μ L 菌液用于 PCR 模板，擴(kuò)增條件為:95°C 5min ；94°C 40s ；54°C 30s ；72°C Imin ；循環(huán)30次；72°C 7min。取2 μ L產(chǎn)物于1 % W/V瓊脂糖凝膠上電泳，用全自動凝膠成像分析系統(tǒng)記錄電泳結(jié)果；將含有插入片段并且大小的陽性克隆取一半菌液測序，另一半加入20% V/V菌甘油， 混勻后于_70°C凍存?zhèn)浞?，用M13+通用引物測序，測序在ABI 3730XLDNA Sequencer上進(jìn)行，所用反應(yīng)試劑為ABI PRISM BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit，每反應(yīng)的有效長度達(dá)700-800bp，用M13引物從另外一段進(jìn)行測序，并將正反向測序結(jié)果進(jìn)行拼接；J、序列分析和微衛(wèi)星位點(diǎn)的分類與設(shè)計用軟件SSRHimter從得到的序列中查找出含有重復(fù)單元的微衛(wèi)星序列，測序，根據(jù) Weber提出的標(biāo)準(zhǔn)將微衛(wèi)星分為3類完美型，指沒有中斷的或附近沒有其它種類重復(fù)序列的重復(fù)序列；非完美型，指2個或以上的同種重復(fù)序列被3個堿基以下的非重復(fù)序列所間隔；復(fù)合型，指一種重復(fù)序列與其它種類的重復(fù)序列被3個以下的非重復(fù)序列所間隔，將挑選出的微衛(wèi)星序列去除載體序列，在序列上標(biāo)記出Mse I接頭的位置，再用引物設(shè)計軟件 Primer Premier 5. 0在兩端接頭和核心重復(fù)區(qū)域之間設(shè)計正向和反向PCR擴(kuò)增引物，用于相應(yīng)位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增； K、微衛(wèi)星引物檢驗對每個位點(diǎn)引物的有效性合多態(tài)性進(jìn)行篩選，得到有效的微衛(wèi)星位點(diǎn)，挑選兩個DNA 模板對所有合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，退火溫度使用設(shè)計引物時的默認(rèn)溫度為50-62°C， 微衛(wèi)星PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為15 μ L，擴(kuò)增條件為94°C 5min ；94°C 40s, Tm 30s, 72°C 40s， 35cycles ；72°C 7min，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物按照5 :1以體積比例加入上樣緩沖液，95°C變性5分鐘后置于冰上，在8%變性聚丙烯酰胺凝膠上加樣檢測，在上樣的同時往其中一個加樣孔加入 0. lgPBR322/Msp I Marker,正常擴(kuò)增的引物對用挑選出的DNA模板在退火50_62°C下進(jìn)行 PCR擴(kuò)增的結(jié)果在聚丙烯酰胺膠上電泳的結(jié)果讀帶，選擇帶型清晰，至少有兩個或兩個以上等位基因的引物篩選出來。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種磁珠富集法開發(fā)菜豆SSR引物的制備方法，其步驟首先用MseI對菜豆基因組DNA進(jìn)行酶切，利用AFLP擴(kuò)增原理創(chuàng)建文庫；第二，基因組PCR文庫與生物素標(biāo)記的重復(fù)序列探針進(jìn)行雜交；第三，通過對雜交混合液加入到表面包被有一層鏈霉親和素的磁珠中；第四，將洗脫液純化的微衛(wèi)星DNA作為DNA模板，用PCR擴(kuò)增方法使得微衛(wèi)星DNA片斷得到放大；第五，將純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到T載體上克隆，得到插入片斷的DNA序列；第六，重復(fù)核心區(qū)兩側(cè)設(shè)計引物，進(jìn)行引物篩選，得到有效的微衛(wèi)星位點(diǎn)。且簡單易行，引物效率高，從48對引物中得到了20對有效的引物，為大批量的開發(fā)SSR引物提供保障。
文檔編號C12Q1/68GK102533727SQ20111043709
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月23日
發(fā)明者丁毅, 周國林, 姚芳, 林處發(fā), 汪愛華, 王斌才, 胡偵華, 鄧耀華, 黃興學(xué) 申請人:武漢市蔬菜科學(xué)研究所