一種篩選公共引物的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種篩選公共引物的方法，具體為選擇待擴(kuò)增靶序列作為模板，設(shè)計(jì)一對特異引物與m條正向公共引物、n條反向公共引物，在特異引物的5'端分別連接公共引物、酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基組合成“長引物”，然后用“長引物”對模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到與公共引物序列同源的PCR產(chǎn)物，將這段模板序列導(dǎo)入質(zhì)粒載體，通過轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒轉(zhuǎn)移進(jìn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，獲得公共引物的質(zhì)粒模板；利用此質(zhì)粒模板，通過排列組合可實(shí)現(xiàn)m×n對公共引物的敏感性篩選。因此，本發(fā)明可以達(dá)到高效篩選公共引物的目的，具有高效、快速和操作簡單的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】一種篩選公共引物的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種篩選公共引物的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 多重 PCR (multiplex polymerasechainreaction，MPCR)是在常規(guī) PCR 基礎(chǔ)上改 進(jìn)并發(fā)展起來的一種新型PCR擴(kuò)增技術(shù)，即可以在一個(gè)反應(yīng)體系中加入兩對以上引物，同 時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段。但是由于各種條件的限制(如引物之間二聚體概率增加、產(chǎn)物大小 難以區(qū)分等)，每個(gè)反應(yīng)體系中能擴(kuò)增的引物對數(shù)量是有限的。針對多重PCR的技術(shù)瓶頸， 現(xiàn)已有在多重引物5'端添加公共引物的方法改善其檢測通量。"公共引物"即在每條多重 PCR引物的5'末端添加一段10-30個(gè)堿基的單鏈寡核苷酸片段，公共引物與擴(kuò)增靶序列 的特異引物連接構(gòu)成嵌合引物。在常用的多重PCR反應(yīng)混合體系中（PCR反應(yīng)液、Taq酶、 dNTP)，加入公共引物、嵌合引物、模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。公共引物的使用降低了嵌合引物的 用量，減少了引物之間二聚體的形成，因此可提高多重PCR的檢測通量。該多重PCR方法最 終是由公共引物進(jìn)行大量擴(kuò)增的，公共引物作為整個(gè)體系的核心技術(shù)，其質(zhì)量好壞決定整 個(gè)多重PCR體系的成敗，因此，公共引物的設(shè)計(jì)和選擇對多重PCR體系至關(guān)重要。 目前引物的設(shè)計(jì)大都通過計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行，運(yùn)用相應(yīng)的軟件和數(shù)據(jù)庫，如Primer5. 0、 〇 I i go6、NCBI數(shù)據(jù)庫等，遵循引物設(shè)計(jì)的基本原則和注意事項(xiàng)，經(jīng)過b I as t比對分析確定引 物的堿基序列，然后進(jìn)行合成和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。但實(shí)驗(yàn)過程中，由于各種原因（如模板問題，引物 可行性、敏感性和特異性等)，理論合成的引物與實(shí)際操作的結(jié)果總會(huì)出現(xiàn)不符。
[0003] 目前，對于引物的分析，都要有明確的靶序列，才可以構(gòu)建質(zhì)粒模板進(jìn)行檢測分 析。公共引物的設(shè)計(jì)不依賴于靶序列，因此，現(xiàn)有的分析方法不適用于公共引物的篩選。同 時(shí)，在多重PCR反應(yīng)中，公共引物貫穿整個(gè)實(shí)驗(yàn)，對整個(gè)PCR體系起決定作用，當(dāng)建立"公共 引物"介導(dǎo)的多重PCR體系時(shí)，首先需要考慮公共引物的選擇，一般不會(huì)輕易變動(dòng)公共引物， 但如果實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)公共引物不合適，除了更換公共引物，還要考慮體系中其它特異引 物的調(diào)動(dòng)，很容易"牽一發(fā)而動(dòng)全身"，因此，對于公共引物，如果沒有合適的篩選方法，既容 易耗費(fèi)財(cái)力，又費(fèi)時(shí)費(fèi)力。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種篩選公共引物的方法，由此可以高效、準(zhǔn)確的選出適合 具體多重PCR擴(kuò)增體系的公共引物。
[0005] 為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種篩選公共引物對的方法，包 括以下步驟： (1) 針對待擴(kuò)增靶序列，設(shè)計(jì)1對特異引物以及m條正向公共引物和η條反向公共引 物;m+n 為 3~10 ; (2) 在特異引物對的正向引物序列的5'末端依次連接m條正向公共引物、酶切位點(diǎn)序 列、保護(hù)堿基序列，得到長引物對中的正向引物； 在特異引物對的反向引物序列的5'末端依次連接η條反向公共引物、酶切位點(diǎn)序列、 保護(hù)堿基序列，得到長引物對中的反向引物； 長引物對中的正向引物與長引物對中的反向引物組成長引物對； (3) 以待擴(kuò)增靶序列為模板，用步驟（1)的特異引物對進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，得到第一 PCR產(chǎn)物；然后以第一 PCR產(chǎn)物為模板，用步驟（2)的長引物對進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，得到第 二PCR產(chǎn)物；然后將第二PCR產(chǎn)物導(dǎo)入質(zhì)粒載體；再通過轉(zhuǎn)化將該質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌 感受態(tài)細(xì)胞；然后培養(yǎng)菌種，再提取質(zhì)粒模板； (4) 通過排列組合，將步驟（1)的m條正向公共引物和η條反向公共引物配對成mXη 對公共引物； (5) 以步驟（3)的質(zhì)粒模板為模板，分別對步驟（4)的各個(gè)公共引物對進(jìn)行敏感性分 析，完成公共引物的篩選。
[0006] 上述技術(shù)方案中，步驟（1)中特異引物的設(shè)計(jì)為現(xiàn)有技術(shù)，根據(jù)引物設(shè)計(jì)的常用規(guī) 則設(shè)計(jì)，如堿基數(shù)目在15_30bp，GC含量一般為40%-60%，3'末端盡量避免以堿基A結(jié)尾， 退火溫度基本一致，避免引物內(nèi)或引物間二聚體的產(chǎn)生等；針對所要擴(kuò)增的靶序列設(shè)計(jì)一 對特異性引物。
[0007] 上述技術(shù)方案中，步驟（1)中公共引物的設(shè)計(jì)參照中國專利申請 CN201410153342. 7中的公共引物設(shè)計(jì)原理和方法。
[0008] 上述方案中，步驟（2)酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基的選擇，參照一般雙酶切的方法和原 貝1J，如目的基因片段內(nèi)部不能含有所選擇的酶切位點(diǎn)，所使用的載體應(yīng)含有所選擇的酶切 位點(diǎn)，兩個(gè)酶切位點(diǎn)不能靠的太近，避免選擇同尾酶，盡量使用有共同buffer的酶等。
[0009] 上述技術(shù)方案中，步驟（3)中，第一次PCR擴(kuò)增與第二次PCR擴(kuò)增條件一樣，都 采用25yL反應(yīng)體系：10μΜ的正向引物與反向引物各lyL，5U/yL的Taq polymerase 0· 15 μ L，25mM 的 MgCl2 2 μ L，IOmM 的 dNTP 0· 5 μ L，IOxTaqBuffer 2· 5μ?，DNA 模板 1 μ L， 滅菌ddH2016. 85 yL;PCR反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性5min;95°C變性30s，55°C退火30s， 72°C延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。
[0010] 上述技術(shù)方案中，步驟（3)中，所述質(zhì)粒載體為PMD19-T。將第二PCR產(chǎn)物導(dǎo) 入質(zhì)粒載體具體為：首先對PMD19-T載體和回收的第二PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝 膠電泳，純化回收載體大片段和目的片段，然后將二者連接起來。采用50 μ 1酶切體系， 包括：10Xbuffer 5yl，DNA 2yg，XbaI lyl，SphI Ιμ?，滅菌 CldH2O 至 50yl，37°C水 浴 1.5-2h;采用 25μ1 連接體系，包括：10XT4 DNA ligase buffer 2·5μ1，目的 DNA 0.3pmol，載體 DNA 0.1pmol，T4 DNA Iigase Ιμ?，滅菌 ddH20 至 25yl，16°C連接過夜。
[0011] 上述技術(shù)方案中，步驟（3)中通過轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 具體為：取10 μ 1連接反應(yīng)液加入50 μ I DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置15min。然后42°C 加熱45s，再在冰中放置5min，加入800 μ I Amp陰性LB液體培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)lh。 然后將全部轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含Amp的LB固體培養(yǎng)基上，待菌液吸干后，倒置培養(yǎng)皿，于37°C 恒溫箱中培養(yǎng)過夜。挑取單個(gè)菌落，分別接種于5ml Amp陽性LB液體培養(yǎng)基中，37°C震蕩 培養(yǎng)過夜，然后取2μ 1菌液進(jìn)行PCR檢測，取結(jié)果陽性的菌液進(jìn)行測序驗(yàn)證。
[0012] 上述技術(shù)方案中，步驟（3)中提取質(zhì)粒模板按照質(zhì)粒DNA提取試劑盒的說明書進(jìn) 行操作。
[0013] 上述技術(shù)方案中，步驟（5)中，敏感性分析具體為：將公共引物經(jīng)過排列組合后得 到mXn對公共引物，分別對mXn對公共引物進(jìn)行敏感性檢測。更具體為將含公共引物序 列的質(zhì)粒從大腸桿菌中提取后得到質(zhì)粒模板，再用去離子水進(jìn)行10倍梯度稀釋，依次得到 ΙΟ7、ΙΟ6、ΙΟ5、ΙΟ4、ΙΟ3、10 2、10 copies/ μ 1稀釋度的質(zhì)粒模板溶液。每個(gè)稀釋度取1 μ 1作為 模板，分別對mXη對公共引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系25 μ 1包括：10 μ M的正向公共引 物與反向公共引物各 1 μ l，5U/y L 的 Taq polymerase 0.15 μ L，25mM 的 MgCl2 2 μ L，IOmM 的 dNTP (λ 5 μ L，IOxTaqBuffer 2· 5μ?，DNA 模板 1 μ L，滅菌 ddH20 16. 85 μ L。反應(yīng)條件為： 95°C預(yù)變性5min;95°C變性30s，50°C退火30s，72°C延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin0
[0014] 上述技術(shù)方案中，根據(jù)步驟（4)的各個(gè)公共引物對的敏感性分析結(jié)果可以篩選適 合的公共引物對。為了使結(jié)果更準(zhǔn)確，可以對各個(gè)公共引物對分別進(jìn)行2?5次敏感性分 析，篩選出結(jié)果最接近，尤其是相同的公共引物對，即為適合多重PCR擴(kuò)增體系的公共引物 對。
[0015] 由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)： (1)、本發(fā)明首次公開了一種篩選公共引物對的方法，用少量的公共引物條數(shù)（m+n 條），就可以實(shí)現(xiàn)對多數(shù)公共引物對(mXn對）的篩選工作，達(dá)到降低成本，高效篩選目的。
[0016] (2)、本發(fā)明將多條公共引物序列導(dǎo)入同一質(zhì)粒載體中，避免模板差異影響的同 時(shí)，可以一次性區(qū)分多對公共引物擴(kuò)增的敏感性，根據(jù)分析結(jié)果的優(yōu)劣順序有效篩選合適 的公共引物對，既減少了工作量，又縮短了時(shí)間，具有操作簡單、快速、有效等優(yōu)點(diǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1是實(shí)施例一中含公共引物序列的目的DNA片段的結(jié)構(gòu)示意圖； 圖2是實(shí)施例一中構(gòu)建的質(zhì)粒模板部分測序結(jié)果圖； 圖3是實(shí)施例一中A公共引物對的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖； 圖4是實(shí)施例一中B公共引物對的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖； 圖5是實(shí)施例一中C公共引物對的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖； 圖6是實(shí)施例一中D公共引物對的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖； 圖7是實(shí)施例一中E公共引物對的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖； 圖8是實(shí)施例一中F公共引物對的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖； 圖9是實(shí)施例一中G公共引物對的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖； 圖10是實(shí)施例一中H公共引物對的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖； 圖11是實(shí)施例一中I公共引物對的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。

【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合實(shí)施例與附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述 實(shí)施例一以人類β-actin基因序列作為待擴(kuò)增靶序列，篩選公共引物 1.引物的設(shè)計(jì)合成 選擇一段人類β-actin基因序列作為模板，設(shè)計(jì)一對特異引物，即SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2,產(chǎn)物大小為553bp。參照中國專利申請CN201410153342. 7中公共引物設(shè)計(jì)原理 和方法設(shè)計(jì)3條正向公共引物（SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5)與3條反向公共 引物（SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 8)，在特異引物 SEQ ID No. I 的 5' 端分別依 次連接SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4共3條公共引物序列、限制性內(nèi)切酶SphI 和保護(hù)堿基，構(gòu)成長引物SEQ ID No. 9;在特異引物SEQ ID No. 2的5'端分別依次連接SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 7共3條公共引物序列、限制性內(nèi)切酶XbaI和保護(hù)堿 基，構(gòu)成長引物SEQ ID No. 10, SphI的保護(hù)堿基和酶切位點(diǎn)為ACATGCATGC，XbaI的保護(hù)堿 基和酶切位點(diǎn)為GCTCTAGA。公共引物、特異引物和長引物序列見表1。
[0019] 表1公共引物、特異引物和長引物序列

【權(quán)利要求】
1. 一種篩選公共引物的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 針對待擴(kuò)增靶序列，設(shè)計(jì)1對特異引物以及m條正向公共引物和η條反向公共引 物；m+n為3?10 ; (2) 在特異引物對的正向引物序列的5'末端依次連接m條正向公共引物、酶切位點(diǎn)序 列、保護(hù)堿基序列，得到長引物對中的正向引物； 在特異引物對的反向引物序列的5'末端依次連接η條反向公共引物、酶切位點(diǎn)序列、 保護(hù)堿基序列，得到長引物對中的反向引物； 長引物對中的正向引物與長引物對中的反向引物組成長引物對； (3) 以待擴(kuò)增靶序列為模板，用步驟（1)的特異引物對進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，得到第一 PCR產(chǎn)物；然后以第一 PCR產(chǎn)物為模板，用步驟（2 )的長引物對進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，得到第 二PCR產(chǎn)物；然后將第二PCR產(chǎn)物導(dǎo)入質(zhì)粒載體；再通過轉(zhuǎn)化將該質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌 感受態(tài)細(xì)胞；然后培養(yǎng)菌種，再提取質(zhì)粒模板； (4) 通過排列組合，將步驟（1)的m條正向公共引物和η條反向公共引物配對成mXη 對公共引物； (5) 以步驟（3)的質(zhì)粒模板為模板，分別對步驟（4)的各個(gè)公共引物對進(jìn)行敏感性分 析，完成公共引物的篩選。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述篩選公共引物的方法，其特征在于：步驟（3)中，第一次PCR 擴(kuò)增與第二次PCR擴(kuò)增條件一樣，都采用25 μ 1反應(yīng)體系：10 μ Μ的正向引物與反向引物 各 lyl，5U/yL 的 Taq polymerase 0.15yL，25mM 的MgCl2 2yL，10mM 的 dNTP 0.5yL， lOxTaqBuffer 2· 5μ?，DNA 模板 1 μ L，滅菌 ddH20 16. 85 μ L ;PCR 反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性 5min;95°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述篩選公共引物對的方法，其特征在于：步驟（3)中，所述質(zhì)粒載 體為PMD19-T質(zhì)粒載體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述篩選公共引物對的方法，其特征在于：步驟（5)中各個(gè)公共引物 對進(jìn)行2?5次敏感性分析。
【文檔編號】C12Q1/68GK104293962SQ201410556794
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月20日
【發(fā)明者】孫萬平, 段欠欠, 王萃, 胡穎熹, 沈蘇南, 朱雪明 申請人:蘇州大學(xué)