檢測(cè)s100a11的納米磁珠分選-時(shí)間分辨免疫熒光試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】試劑盒包括：30nm粒徑的超順磁性復(fù)合微粒；偶聯(lián)液；封閉液；洗滌液；加樣緩沖液；熒光增強(qiáng)液；檢測(cè)緩沖液；捕獲抗體；檢測(cè)抗體；Eu3＋標(biāo)記的鏈親和霉素；標(biāo)準(zhǔn)品。其使用包括：該試劑盒采用納米磁珠分選和以雙抗體夾心法為基礎(chǔ)的時(shí)間分辨免疫熒光原理來(lái)檢測(cè)樣品中的S100A11蛋白的濃度。用偶聯(lián)有S100A11捕獲抗體的納米磁珠富集樣品中的S100A11，并加入檢測(cè)抗體孵育，洗滌后加入Eu3＋標(biāo)記的鏈親和霉素孵育，通過(guò)再次洗滌加入熒光增強(qiáng)液，振蕩5分鐘后用337nm波長(zhǎng)光激發(fā)，延時(shí)200微秒在615nm波長(zhǎng)處檢測(cè)發(fā)射熒光值；通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和相應(yīng)的熒光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，待檢樣品中的S100A11濃度就可以通過(guò)它的熒光值并對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到。待檢樣品還可以用于下一個(gè)目的蛋白的檢測(cè)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】檢測(cè)S100A11的納米磁珠分選-時(shí)間分辨免疫熒光試劑盒
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種納米磁珠分選和時(shí)間分辨免疫熒光的串聯(lián)檢測(cè)方法，具體為運(yùn)用納米磁珠與S100A11抗體偶聯(lián)來(lái)特異性捕獲檢測(cè)樣品中S100A11蛋白，然后應(yīng)用時(shí)間分辨免疫熒光方法進(jìn)一步檢測(cè)所捕獲S100A11蛋白的濃度。人外周血中S100A11蛋白濃度的增加與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)聯(lián)，運(yùn)用本試劑盒能夠?qū)σ认侔┑陌l(fā)生發(fā)展起到診斷作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)血清標(biāo)本的重復(fù)使用，并能提高對(duì)血清S100A11的檢測(cè)靈敏度。
[0003]

【背景技術(shù)】
[0004]S100A11 (Calgizzarin)是具有EF手型的SlOO蛋白家族的成員之一，參與細(xì)胞周期活動(dòng)、細(xì)胞分化、腫瘤生長(zhǎng)以及細(xì)胞外基質(zhì)分泌活動(dòng)的鈣結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白，它與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。S100A11最初由豬的心肌細(xì)胞和雞砂囊平滑肌細(xì)胞中純化出來(lái)，稱(chēng)S100C或鈣囊素，屬酸性蛋白，分子量在10?12kDa，主要在脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)，在人類(lèi)SlOO蛋白的基因大部分在染色體lq21區(qū)，腫瘤在此區(qū)的基因常頻繁重組，易引起SlOO基因表達(dá)失控。S100A11與鈣結(jié)合之后，蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變，暴露出疏水區(qū)，然后與靶蛋白結(jié)合。其主要功能是轉(zhuǎn)導(dǎo)鈣依賴(lài)性的細(xì)胞調(diào)節(jié)信號(hào)，參與細(xì)胞的增殖、分化、細(xì)胞凋亡和癌癥的形成和進(jìn)展。S100A11可能作為一種潛在的抑癌基因在胰腺癌的早期致癌階段中表達(dá)增加，在隨著腫瘤的發(fā)展在后期表達(dá)減少，分析胰液中的S100A11表達(dá)水平可以作為篩選有可能發(fā)展成為癌癥的高危病人和檢測(cè)早期胰腺癌病人的有效手段。
[0005]我們運(yùn)用MALD1-T0F-MS質(zhì)譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)S100A11在人胰腺癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，并且它的表達(dá)水平與胰腺癌的分期及預(yù)后相關(guān)。我們的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，胰腺癌中S100A11表達(dá)陽(yáng)性率為86.11%，明顯高于癌旁組織(28.16%) (P〈0.01 )，且強(qiáng)陽(yáng)性主要集中在胰腺癌組織，而癌旁組織均為弱陽(yáng)性表達(dá)，提示S100A11可能在胰腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著較重要作用。
[0006]時(shí)間分辨免疫熒光檢測(cè)方法是一種成熟的免疫分析方法，具有高特異、高靈敏的優(yōu)點(diǎn)，是在臨床醫(yī)學(xué)和檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)等諸多方面得到十分廣泛的應(yīng)用，是目前取代放射性免疫分析的一種定量檢測(cè)方法。它的基本原理是利用三價(jià)稀土離子(如Eu3+)作為示蹤物，延遲檢測(cè)壽命較長(zhǎng)的特異性激發(fā)熒光以排除非特異性及背景熒光的干擾，即測(cè)定復(fù)合物中的稀土離子被激發(fā)的延遲熒光強(qiáng)度，從而確定待測(cè)蛋白的濃度。
[0007]然而，時(shí)間分辨免疫熒光需要消耗一定數(shù)量的血清，并且該血清不可重復(fù)使用，因此患者提供的血清僅能檢測(cè)有限的指標(biāo)，這也對(duì)臨床血清標(biāo)本庫(kù)的建立和使用形成一大限制。如何使得患者提供的血清能夠無(wú)限次地檢測(cè)不同的標(biāo)志物，這是一個(gè)對(duì)臨床和科研都具有意義的研究問(wèn)題。因此，我們開(kāi)發(fā)了納米磁珠分選一時(shí)間分辨免疫熒光串聯(lián)分析方法，首先通過(guò)包被有S100A11的納米磁珠來(lái)吸附富集血清中(如500微升血清)S100A11蛋白，然后將收集到的S100A11蛋白釋放到一個(gè)微小體積的檢測(cè)液中(如5微升)，使得樣本一次濃縮100倍，從而將檢測(cè)靈敏度提高了 2個(gè)數(shù)量級(jí)。并且，對(duì)于同一個(gè)檢測(cè)樣本，可以用不同抗體標(biāo)記的納米磁珠先后進(jìn)行富集篩選，從而達(dá)到高通量檢測(cè)的目的。
[0008]本發(fā)明將納米磁珠分選和時(shí)間分辨免疫熒光檢測(cè)串聯(lián)起來(lái)，初步實(shí)現(xiàn)了對(duì)患者血清的重復(fù)使用目的，并且提高了靈敏度高，為臨床的腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)和TRFIA高通量檢測(cè)提供了良好的平臺(tái)。
[0009]目前，國(guó)際上還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道，更沒(méi)有專(zhuān)門(mén)用于檢測(cè)S100A11的納米磁珠分選一時(shí)間分辨免疫熒光試劑盒提供，因此，該試劑盒的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，是填補(bǔ)了這方面的空白。
[0010]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的是提供一種能夠使得被檢測(cè)樣本可以重復(fù)利用的、并且靈敏特異的檢測(cè)試劑盒，以此來(lái)確定樣本中S100A11蛋白濃度。
[0012]本發(fā)明的目的是通過(guò)以下方法實(shí)現(xiàn)的:用S100A11抗體偶聯(lián)30nm粒徑的超順磁性復(fù)合微粒，在500微升檢測(cè)樣品中捕獲富集目的蛋白，洗滌后加入檢測(cè)抗體孵育，隨后加入Eu3 +標(biāo)記的鏈親和霉素孵育，再次洗滌后釋放該磁珠至檢測(cè)板中，并加入熒光增強(qiáng)液，振蕩5分鐘后用337nm波長(zhǎng)光激發(fā)，延時(shí)200微秒在615nm波長(zhǎng)處檢測(cè)發(fā)射熒光值；通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和相應(yīng)的熒光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，待檢樣品中的S100A11濃度就可以通過(guò)它的熒光值并對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到。
[0013]本發(fā)明檢測(cè)S100A11的納米磁珠分選-時(shí)間分辨免疫熒光試劑盒，其包括以下組成:
(1)30nm粒徑的超順磁性復(fù)合微粒；
(2)偶聯(lián)緩沖液；
(3)磷酸鹽緩沖液(PBS)，其成分為140mM NaCl, 2.7mM KCl, 1mM Na2HPO4,1.8mMKH2PO4, pH 值為 7.4 ;
(4)封閉液為含1%BSA的PBS，其成分為PBS，1%BSA；
(5)洗滌液為含0.05%Tween-20的Tris-HCl緩沖液(TBS)，其成分為50mM的Tris-HCl緩沖液(pH 7.8),0.05%Tween-20 ；
(6)加樣緩沖液的成分為含1%BSA的PBS，其成分為PBS，1%BSA；
(7)突光增強(qiáng)液(EnhancementSolut1n)；
(8)檢測(cè)緩沖液(AssayBuffer)為50mM的Tris-HCl緩沖液(pH 7.8)，其中含有1%BSA,l%bovine globulin,0.05%Tween 40, DTPA ；
(9)包被抗體為單克隆小鼠抗人S100A11抗體(MonoclonalAnt1-Human S100A11Antibody)，儲(chǔ)存濃度為 I μ g/ μ I ;
(10)檢測(cè)抗體為生物素化的羊抗人S100A11多抗(B1tinylatedAnt1-Human S100A11Antibody)，儲(chǔ)存濃度為 50ng/l.! I ；
(11)Eu3 +標(biāo)記的鏈親和霉素(Eu3 + -1abeled streptavidin),儲(chǔ)存濃度為 0.1 μ g/
μ I ;(12)標(biāo)準(zhǔn)品，重組人 S100A11 蛋白(Recombinant Human S100A11)，濃度為 100 μ g/
μ I。
[0014]
本發(fā)明檢測(cè)S100A11的時(shí)間分辨免疫熒光試劑盒的使用步驟如下:
(1)用Iml偶聯(lián)液溶解500μ g單克隆小鼠抗人S100A11抗體，加入30nm粒徑的超順磁性復(fù)合微粒，輕搖混勻，置于恒溫?fù)u床，370C、180 rpm振蕩反應(yīng)20min。反應(yīng)完畢，磁性分離2 min ；
(2)在上述離心管中加入Iml洗滌液，輕搖混勻，磁性分離，重復(fù)該清洗操作I次；
(3)在離心管中加入3ml封閉液，置于恒溫?fù)u床，37°C、180 rpm振蕩反應(yīng)2 h。磁性分離，棄上清。
[0015](4)在離心管中加入I ml洗滌液，輕搖混勻，磁性分離，棄上清。重復(fù)該清洗操作3次；
(5)在500μI待測(cè)培養(yǎng)上清樣品和倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品中加入納米磁珠偶聯(lián)的抗體2 μ 1，混合均勻，置于37°C搖床180rpm，lh ；
(6)將上述1.5ml Ep管置于磁性分離器上，磁性分離2min，然后將500ul血清全部取出后凍存；
(7)將上述1.5ml Ep管置于磁性分離器上，用500 μ I PBS-0.05%Tween20洗滌三次；
(8)加入稀釋好的檢測(cè)抗體B1tinylated Ant1-Human S100A11 Antibody (DetectAntibody) 100 μ I/ 管，混合均勻，置于 37°C搖床 180rpm, Ih ；
(9)將上述1.5ml Ep管重新置于磁性分離器上，磁性分離2min，然后棄去檢測(cè)抗體，用500 μ I Wash Buffer 洗滌三次；
(10)加入用Assay Buffer 配制的 Eu-labeled streptavidin 100 μ I/孔,混合均勻,置于37°C搖床180rpm，避光，Ih ；
(11)將上述1.5ml Ep管重新置于磁性分離器上，磁性分離2min，然后棄去Eu-labeledstreptavidin, 500 μ I/ 孔 Wash Buffer 洗漆四次；
(12)加入EnhancementSolut1n 200 μ I/孔，混合均勻后，將200 μ I液體加于96孔檢測(cè)板中，室溫避光孵育45min并Slowly Shaking 5min ；
(13)讀板:設(shè)定激發(fā)光波長(zhǎng)(Excitat1nwavelength)為337nm,發(fā)射光波長(zhǎng)(Emiss1n wavelength)為615nm,延時(shí)200微秒測(cè)定615nm處的突光值；
(14)利用統(tǒng)計(jì)學(xué)繪圖軟件根據(jù)測(cè)定的值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；
(15)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和未知濃度樣品的熒光值計(jì)算待測(cè)樣品中的S100A11的濃度。
[0016]本試劑盒采用納米磁珠分選-時(shí)間分辨免疫熒光串聯(lián)法，運(yùn)用30nm粒徑的超順磁性復(fù)合微粒，其核為納米磁性粒子，核表面是金的殼層。借助磁性分離器，納米金磁微?？梢詮膽腋〗橘|(zhì)中分離出來(lái)。利用其表面金的性質(zhì)，不需共價(jià)偶聯(lián)試劑，可一步將S100A11抗體偶聯(lián)在納米金磁微粒表面，偶聯(lián)有S100A11抗體的納米金磁微?？梢詮难逯蟹蛛x出S100A11，將S100A11標(biāo)準(zhǔn)蛋白系列稀釋?zhuān)趌-100ng/ml范圍內(nèi)成線(xiàn)性關(guān)系，分離后的血清可以進(jìn)一步加入第二種抗體偶聯(lián)磁珠，來(lái)進(jìn)行下一個(gè)標(biāo)志物的檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)同一血清標(biāo)本的重復(fù)利用，這是該試劑盒的一個(gè)最顯著特色和創(chuàng)新。
[0017]在本發(fā)明中，采用了抗體標(biāo)記的納米磁珠分選技術(shù)，它能從體積較大的標(biāo)本中(如500微升)富集篩選出目的蛋白，并重新釋放到微小體積的檢測(cè)液中(如5微升)，使得樣本一次濃縮100倍，從而將檢測(cè)靈敏度提高了 2個(gè)數(shù)量級(jí)。
[0018]本發(fā)明還具有良好的穩(wěn)定性，操作時(shí)間短，成本低。
[0019]

【具體實(shí)施方式】
[0020]本發(fā)明中的一些術(shù)語(yǔ)與縮寫(xiě):TRF:時(shí)間分辨免疫熒光；BSA:牛血清白蛋白；Tween-20:吐溫20 ；Tween-40:吐溫40 ；PBS:磷酸鹽緩沖液；TBS =Tris-HCl 緩沖液；bovineglobulin:牛球蛋白；DTPA:二乙烯三胺五乙酸。
[0021]試劑配方:
1.緩沖液:
包被緩沖液:為磷酸鹽緩沖液(PBS)，其成分為140mM NaCl,2.7mM KCl, 1mM Na2HPO4,1.8mM KH2PO4, pH 值為 7.4 ；
洗滌液:為含0.05%Tween-20的Tris-HCl緩沖液(TBS)，其成分為50mM的Tris-HCl緩沖液(pH 7.8),0.05%Tween-20 ；
封閉液:為含1%BSA的PBS，其成分為PBS，1%BSA ；
加樣緩沖液:為含1%BSA的PBS，其成分為PBS，1%BSA ；
檢測(cè)緩沖液:為50mM的Tris-HCl緩沖液(pH 7.8)，其中含有1%BSA, l%bovineglobulin,0.05%Tween 40, DTPA ；
2.標(biāo)準(zhǔn)品蛋白:
重組人SlOOAlI蛋白
4.酶標(biāo)板:
Coastar 96孔圓底板具體操作步驟:
(1)用Iml偶聯(lián)液溶解500μ g單克隆小鼠抗人S100A11抗體，加入30nm粒徑的超順磁性復(fù)合微粒，輕搖混勻，置于恒溫?fù)u床，370C、180 rpm振蕩反應(yīng)20min。反應(yīng)完畢，磁性分離2 min ；
(2)在上述離心管中加入Iml洗滌液，輕搖混勻，磁性分離，重復(fù)該清洗操作I次；
(3)在離心管中加入3ml封閉液，置于恒溫?fù)u床，37°C、180 rpm振蕩反應(yīng)2 h。磁性分離，棄上清。
[0022](4)在離心管中加入I ml洗滌液，輕搖混勻，磁性分離，棄上清。重復(fù)該清洗操作3次；
(5)在500μI待測(cè)培養(yǎng)上清樣品和倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品中加入納米磁珠偶聯(lián)的抗體2 μ 1，混合均勻，置于37°C搖床180rpm，lh ；
(6)將上述1.5ml Ep管置于磁性分離器上，磁性分離2min，然后將500ul血清全部取出后凍存；
(7)將上述1.5ml Ep管置于磁性分離器上，用500 μ I PBS-0.05%Tween20洗滌三次；
(8)加入稀釋好的檢測(cè)抗體B1tinylated Ant1-Human S100A11 Antibody (DetectAntibody) 100 μ I/ 管，混合均勻，置于 37°C搖床 180rpm, Ih ； (9)將上述1.5ml Ep管重新置于磁性分離器上，磁性分離2min，然后棄去檢測(cè)抗體，用500 μ I Wash Buffer 洗滌三次；
(10)加入用Assay Buffer 配制的 Eu-labeled streptavidin 100 μ I/孔,混合均勻,置于37°C搖床180rpm，避光，Ih ；
(11)將上述1.5ml Ep管重新置于磁性分離器上，磁性分離2min，然后棄去Eu-labeledstreptavidin, 500 μ I/ 孔 Wash Buffer 洗漆四次；
(12)加入EnhancementSolut1n 200 μ I/孔，混合均勻后，將200 μ I液體加于96孔檢測(cè)板中，室溫避光孵育45min并Slowly Shaking 5min ；
(13)讀板:設(shè)定激發(fā)光波長(zhǎng)(Excitat1nwavelength)為337nm,發(fā)射光波長(zhǎng)(Emiss1n wavelength)為615nm,延時(shí)200微秒測(cè)定615nm處的突光值；
(14)利用統(tǒng)計(jì)學(xué)繪圖軟件根據(jù)測(cè)定的值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；
(15)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和未知濃度樣品的熒光值計(jì)算待測(cè)樣品中的S100A11的濃度。
【權(quán)利要求】
1.檢測(cè)S100A11的納米磁珠分選-時(shí)間分辨免疫熒光試劑盒，其特征在于包括以下組成: (1)30nm粒徑的超順磁性復(fù)合微粒； (2)偶聯(lián)緩沖液； (3)磷酸鹽緩沖液(PBS)，其成分為140mM NaCl, 2.7mM KCl, 1mM Na2HPO4,1.8mMKH2PO4, pH 值為 7.4 ; (4)封閉液為含1%BSA的PBS，其成分為PBS，1%BSA； (5)洗滌液為含0.05%Tween-20的Tris-HCl緩沖液(TBS)，其成分為50mM的Tris-HCl緩沖液(pH 7.8),0.05%Tween-20 ； (6)加樣緩沖液的成分為含1%BSA的PBS，其成分為PBS，1%BSA； (7)突光增強(qiáng)液(EnhancementSolut1n)； (8)檢測(cè)緩沖液(AssayBuffer)為50mM的Tris-HCl緩沖液(pH 7.8)，其中含有1%BSA,l%bovine globulin,0.05%Tween 40, DTPA ； (9)包被抗體為單克隆小鼠抗人S100A11抗體(MonoclonalAnt1-Human S100A11Antibody)，儲(chǔ)存濃度為 I μ g/ μ I ; (10)檢測(cè)抗體為生物素化的羊抗人S100A11多抗(B1tinylatedAnt1-Human S100A11Antibody)，儲(chǔ)存濃度為 50ng/l.! I ； (11)Eu3 +標(biāo)記的鏈親和霉素(Eu3 + -1abeled streptavidin),儲(chǔ)存濃度為 0.1 μ g/μ I ; (12)標(biāo)準(zhǔn)品，重組人S100A11 蛋白(Recombinant Human S100A11)，濃度為 100 μ g/μ I。
2.如權(quán)利要求1所述檢測(cè)S100A11的納米磁珠分選-時(shí)間分辨免疫熒光試劑盒的使用方法，其特征在于以下步驟: (1)用Iml偶聯(lián)液溶解500μ g單克隆小鼠抗人S100A11抗體，加入30nm粒徑的超順磁性復(fù)合微粒，輕搖混勻，置于恒溫?fù)u床，370C、180 rpm振蕩反應(yīng)20min，反應(yīng)完畢，磁性分離2 min ； (2)在上述離心管中加入Iml洗滌液，輕搖混勻，磁性分離，重復(fù)該清洗操作I次； (3)在離心管中加入3ml封閉液，置于恒溫?fù)u床，37°C、180 rpm振蕩反應(yīng)2 h，磁性分離，棄上清； (4)在離心管中加入Iml洗滌液，輕搖混勻，磁性分離，棄上清，重復(fù)該清洗操作3次； (5)在500μI待測(cè)培養(yǎng)上清樣品和倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品中加入納米磁珠偶聯(lián)的抗體2μ 1，混合均勻，置于37°C搖床180rpm，Ih ； (6)將上述1.5ml Ep管置于磁性分離器上，磁性分離2min，然后將500ul血清全部取出后凍存； (7)將上述1.5ml Ep管置于磁性分離器上，用500 μ I PBS-0.05%Tween20洗滌三次； (8)加入稀釋好的檢測(cè)抗體B1tinylated Ant1-Human S100A11 Antibody (DetectAntibody) 100 μ I/ 管，混合均勻，置于 37°C搖床 180rpm, Ih ； (9)將上述1.5ml Ep管重新置于磁性分離器上，磁性分離2min，然后棄去檢測(cè)抗體，用500 μ I Wash Buffer 洗滌三次； (10)加入用Assay Buffer 配制的 Eu-labeled streptavidin 100 μ I/孔，混合均勻，置于37°C搖床180鄺111，避光，Ih ； (11)將上述1.5ml Ep管重新置于磁性分離器上，磁性分離2min，然后棄去Eu-1abeledstreptavidin, 500 μ I/ 孔 Wash Buffer 洗搽四次； (12)加入EnhancementSolut1n 200 μ I/孔，混合均勻后，將200 μ I液體加于96孔檢測(cè)板中，室溫避光孵育45min并Slowly Shaking 5min ； (13)讀板:設(shè)定激發(fā)光波長(zhǎng)(Excitat1nwavelength)為337nm，發(fā)射光波長(zhǎng)(Emiss1n wavelength)為615nm，延時(shí)200微秒測(cè)定615nm處的焚光值； (14)利用統(tǒng)計(jì)學(xué)繪圖軟件根據(jù)測(cè)定的值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)； (15)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和未知濃度樣品的熒光值計(jì)算待測(cè)樣品中的S100A11的濃度。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104515856SQ201310462415
【公開(kāi)日】2015年4月15日 申請(qǐng)日期:2013年10月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月8日
【發(fā)明者】倪潤(rùn)洲 申請(qǐng)人:倪潤(rùn)洲