專利名稱：Melk基因的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物工程技術領域，尤其涉及一種MELK基因的用途。
背景技術：
MELK基因(又名HPK38，NM_014791)位于染色體9ql3.2區(qū)段，編碼母體-胚胎亮氨酸拉鏈激酶，屬于Ser/Thr蛋白激酶類,是近年來新發(fā)現的AMPK蛋白激酶家族新成員，主要在有絲分裂過程中起作用。有研究表明MELK與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。表達譜芯片數據提示MELK在包括肺癌、宮頸癌、腸癌、食管癌等在內的19種腫瘤中顯著上調表達，其中在腸癌中上調表達最為明顯，在腸癌、乳腺癌、胰腺癌細胞系中抑制MELK表達，觀察到細胞生長速度下降和明顯的G2/M期阻滯，提示其作為廣譜的腫瘤治療靶點的可能性。MELK在乳腺癌中上調表達并與預后相關，提示其作為乳腺癌診斷標志物的可能性。但是，目前尚沒有關于MELK基因作為肝癌診斷標志物的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種MELK基因的用途，MELK基因可作為診斷肝癌的分子標志物。為了解決上述技術問題，本發(fā)明通過如下技術方案實現:在本發(fā)明的一個方面，提供了一種MELK基因的用途，用于制備診斷肝癌的產品。

優(yōu)選的，所述診斷肝癌的產品包括:用半定量RT-PCR、基因芯片檢測、或免疫檢測診斷肝癌的產品。所述用半定量RT-PCR診斷肝癌的產品至少包括一對特異擴增MELK基因的引物。所述用基因芯片檢測診斷肝癌的產品包括:與MELK基因的核酸序列雜交的探針。所述用免疫檢測診斷肝癌的產品包括:與MELK蛋白特異性結合的抗體。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種用于診斷肝癌的試劑盒，所述試劑盒包含特異性針對MELK基因的引物或探針，或包含特異性結合MELK蛋白的抗體。利用本發(fā)明的試劑盒，可以檢測病人MELK基因的表達情況，從而診斷病人是否患有肝癌。在本發(fā)明中，術語“引物”是指一種寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成的，它可以作為在一定條件下誘發(fā)DNA合成的起始點，在合適條件下誘發(fā)合成與核酸鏈互補的引物擴增產物，即在四種不同的三磷酸脫氧核糖核苷及一種聚合試劑(即DNA聚合酶或逆轉錄酶)存在下，在一種合適的緩沖液中并在合適的溫度下進行擴增反應。優(yōu)選的引物是單股寡脫氧核糖核苷酸。引物的合適長度取決于該引物的設計用途，但一般在15 25個核苷酸之間。在本發(fā)明中，所述探針可以是 DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其它衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結合，任何長度都可以。在本發(fā)明中，可以使用一系列本領域已知的方法來制備針對MELK蛋白特異的抗體。例如，將提純的人MELK基因產物或它的抗原片段或人工合成的含有與MELK蛋白有連續(xù)5個相同的氨基酸的多肽片段注射入動物體內以產生多抗體。同樣，表達人MELK蛋白或它的抗原片段的細胞也可以用來對動物致免疫而產生抗體。根據本發(fā)明制備的抗體也可以是單克隆抗體，這些單克隆抗體可用雜交瘤技術制備。經實驗證明，本發(fā)明MELK基因在肝癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，因此MELK基因可作為診斷肝癌的特異標志基因，使肝癌診斷更加準確、快速。


下面結合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步詳細的說明。圖1是本發(fā)明實施例1的MELK基因在人肝癌組織和癌旁組織中差異表達的半定量RT-PCR結果圖。
具體實施方式
下列實施例中，未注明具體條件的實驗方法，通常按常規(guī)條件，如《精編分子生物學實驗指南》(F.M.奧斯伯，R.E.金斯頓，J.G.塞德曼等主編，馬學軍，舒躍龍的譯.北京:科學出版社，2004)中所述的方法進行。實施例1用半定量RT-PCR方法檢測肝癌樣本中MELK基因的表達變化半定量反轉錄-聚合酶鏈反應(SqRT-PCR)是近年來常用的一種簡捷、特異的定量RNA測定方法，通過mRNA反轉錄成cDNA，再進行PCR擴增，并測定PCR產物的數量，可以推測樣品中特異mRNA的相對數量。以半定量RT-PCR為基礎建立起來的mRNA含量測定技術，較含內標化的RT-PCR定量測定的mRNA的方法更為簡便可行。運用半定量RT-PCR方法，檢測20對肝癌樣本中MELK基因的表達變化，發(fā)現其在肝癌組織中呈明顯的上調表達趨勢。具體實驗步驟如下:1.組織分離實驗用組織來源于HBV陽性并表達甲胎蛋白的原發(fā)性肝癌的手術病人(RT-PCR證實AFP在肝癌均為陽性而癌旁為陰性)。手術切除的肝臟一經離體，迅速切取病灶及周圍5公分外癌旁組織，放入液氮中(-80°C)保存。癌和癌旁的診斷均以病理診斷為最終依據。2.RNA 抽提采用TAKARA公司的Trizol (D9108)對20對肝癌樣本(癌和癌旁)組織進行抽提，并用安捷倫2100對產物的純度和濃度進行檢測。具體操作是:將碾杵和勻漿器等器皿在200°C干烤4h，去除RNA酶，冷卻；加入液氮中預冷，將組織從液氮中迅速取出，碾成粉末；用刮匙將組織放入預先加入TRIzoI試劑的勻漿器中，勻漿數分鐘；將勻漿后的液體轉入無RNA酶的離心管中，加入氯仿后，4°C離心分層；將上層水相轉入一無RNA酶的離心管中，加入氯仿后，4°C離心分層；將上層水相轉入一無RNA酶的離心管中，加異丙醇，4°C離心沉淀RNA ;用75%乙醇洗滌沉淀2次；用無RNA酶的去離子水溶解沉淀。抽提的RNA進行質量鑒定(用安捷倫2100測定RNA濃度、純度和完整性)，結果見下表I。質量鑒定好的RNA存放在_80°C冰箱待用。
表I 20對肝癌樣本的RNA抽提質量檢測結果
權利要求
1.一種MELK基因的用途，其特征在于，用于制備診斷肝癌的產品。
2.根據權利要求1所述的用途，其特征在于，所述診斷肝癌的產品包括:用半定量RT-PCR、基因芯片檢測、或免疫檢測診斷肝癌的產品。
3.根據權利要求2所述的用途，其特征在于，所述用半定量RT-PCR診斷肝癌的產品至少包括一對特異擴增MELK基因的引物。
4.根據權利要求2所述的用途，其特征在于，所述用基因芯片檢測診斷肝癌的產品包括■ 與MELK基因的核酸序列雜交的探針。
5.根據權利要求2所述的用途，其特征在于，所述用免疫檢測診斷肝癌的產品包括 與MELK蛋白特異性結合的抗體。
6.一種用于診斷肝癌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含特異性針對MELK基因的引物對。
7.一種用于診斷肝癌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含特異性針對MELK基因的探針。
8.一種用于診斷肝癌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含特異性結合MELK蛋白的抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開一種MELK基因的用途，用于制備診斷肝癌的產品。本發(fā)明還公開了一種用于診斷肝癌的試劑盒，該試劑盒包含特異性針對MELK基因的引物或探針，或包含特異性結合MELK蛋白的抗體。本發(fā)明的MELK基因，可作為診斷肝癌的特異標志基因，使肝癌診斷更加準確、快速。
文檔編號C12Q1/68GK103173527SQ20111043691
公開日2013年6月26日 申請日期2011年12月22日 優(yōu)先權日2011年12月22日
發(fā)明者黃健, 劉星 申請人:上海生物芯片有限公司