專利名稱：Cd157 基因的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及⑶157基因的用途。
背景技術(shù)：
結(jié)核病(Tuberculosis, TB)是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的慢性傳染性疾病，結(jié)核分枝桿菌不僅可引起肺結(jié)核(85%)，而且可引起肺外多種器官的結(jié)核病。盡管目前已有有效的抗結(jié)核藥物，但結(jié)核病仍然是當(dāng)前感染性疾病的頭號(hào)殺手，全球每年約200萬人死于結(jié)核病；全球約三分之一的人口感染結(jié)核分枝桿菌，在這些被稱為結(jié)核菌潛伏感染(LTBI)的人群中，有約10%最終將進(jìn)展為活動(dòng)性結(jié)核病。
由于目前缺乏有效的結(jié)核病疫苗，結(jié)核病的預(yù)防控制主要依賴于早期發(fā)現(xiàn)、治療、 隔離活動(dòng)性結(jié)核病人。然而，現(xiàn)今診斷活動(dòng)性結(jié)核病的檢測(cè)技術(shù)存在嚴(yán)重不足，不能滿足臨床和結(jié)核病預(yù)防控制的要求1)痰結(jié)核分枝桿菌微生物檢查特異性高，是當(dāng)前診斷活動(dòng)性肺結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn)，但存在敏感性低(不足40%)，耗時(shí)長(zhǎng)(結(jié)核菌培養(yǎng)耗時(shí)I 一 2個(gè)月)，實(shí)驗(yàn)室生物安全要求高的缺點(diǎn)。2)結(jié)核分枝桿菌基因檢測(cè)，雖然實(shí)現(xiàn)了快速診斷的目的(I天)，但直接從痰標(biāo)本進(jìn)行的基因檢測(cè)在敏感性方面沒有顯著提高，且存在假陰性，假陽性的問題。3)免疫學(xué)檢測(cè)中抗體檢測(cè)被世界衛(wèi)生組織認(rèn)定不適合結(jié)核病的診斷；細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)包括結(jié)核菌素皮試(TST)和結(jié)核菌干擾素釋放試驗(yàn)(IGRA)，不能有效區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核患者和結(jié)核菌潛伏感染者，雖然后者在活動(dòng)性結(jié)核患者檢測(cè)的敏感性顯著高于其他檢測(cè)。
CD157 也叫 ADP-ribosyl cyclase 2, BST-1, Cyclic ADP-ribosehydrolase 2,它位于人基因組的14q32. 3，其的氨基酸序列與⑶38有33%的一致性。⑶157是一個(gè)胞外酶， 同時(shí)具有ADP核糖環(huán)化酶和ADP核糖水解酶的活性，可以催化NAD+成cADPR。同時(shí)它也存在于細(xì)胞膜，作為一個(gè)受體。在單核細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞等都有表達(dá)。研究表明， CD157在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中有高量的表達(dá)，并可以促進(jìn)B細(xì)胞前體的生長(zhǎng)。 CD 157可作為一個(gè)受體，具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。當(dāng)配體與CD157結(jié)合時(shí)，可以誘導(dǎo)黏著斑激酶的酪氨酸磷酸化。同時(shí)它在調(diào)節(jié)體內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)、促進(jìn)中心粒細(xì)胞的極化以及調(diào)節(jié)(V的產(chǎn)量都扮演著重要的作用。
目前尚沒有關(guān)于⑶157基因作為結(jié)核診斷標(biāo)志物的報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種CD157基因的用途，CD157基因可作為判別結(jié)核潛伏感染和活動(dòng)性結(jié)核的分子標(biāo)志物。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
本發(fā)明提供了一種CD157基因的用途，用于制備判別結(jié)核潛伏感染和活動(dòng)性結(jié)核的產(chǎn)品。
所述判別結(jié)核潛伏感染 和活動(dòng)性結(jié)核的產(chǎn)品優(yōu)選包括用實(shí)時(shí)定量PCR或基因芯片檢測(cè)判別結(jié)核潛伏感染和活動(dòng)性結(jié)核的產(chǎn)品。
所述用實(shí)時(shí)定量PCR判別結(jié)核潛伏感染和活動(dòng)性結(jié)核的產(chǎn)品至少優(yōu)選包括一對(duì)特異擴(kuò)增CD157基因的引物。
所述特異擴(kuò)增⑶157基因的引物，優(yōu)選為
CD157-F :5’ -GCTGGAACATGAACGATGTG-3’，
CD157-R:5， -GAAGCCAGCACCAGAAAGAG-3，；
所述用基因芯片檢測(cè)判別結(jié)核潛伏感染和活動(dòng)性結(jié)核的產(chǎn)品優(yōu)選包括 與CD157 基因的核酸序列雜交的探針。
利用本發(fā)明的試劑盒，可以檢測(cè)病人CD157基因的表達(dá)情況，從而診斷病人是否患有活動(dòng)性結(jié)核病。
在本發(fā)明中，術(shù)語“引物”是指一種寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成的，它可以作為在一定條件下誘發(fā)DNA合成的起始點(diǎn)，在合適條件下誘發(fā)合成與核酸鏈互補(bǔ)的引物擴(kuò)增產(chǎn)物，即在四種不同的三磷酸脫氧核糖核苷及一種聚合試劑(即DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶)存在下，在一種合適的緩沖液中并在合適的溫度下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。優(yōu)選的引物是單股寡脫氧核糖核苷酸。引物的合適長(zhǎng)度取決于該引物的設(shè)計(jì)用途，但一般在15 25個(gè)核苷酸之間。
在本發(fā)明中，所述探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其它衍生物。所述探針的長(zhǎng)度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié)合，任何長(zhǎng)度都可以。
經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明⑶157基因在結(jié)核病人血液中的表達(dá)明顯高于健康人群以及潛伏感染人群，因此CD157基因可作為診斷結(jié)核的特異標(biāo)志基因，使結(jié)核診斷更加準(zhǔn)確、 快速。


下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
圖1是本發(fā)明實(shí)施例1的⑶157基因在人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中差異表達(dá)的定量RT-PCR結(jié)果圖。
圖2是本發(fā)明實(shí)施例2的⑶157基因在PBMC中差異表達(dá)`的芯片結(jié)果圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述
實(shí)施例1
本實(shí)施例將人群分為三組結(jié)核病患者、潛伏感染人群和健康人群(各20例)，通過檢測(cè)每例外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中⑶157基因mRNA變化，發(fā)現(xiàn)其在結(jié)核病患者中呈明顯的上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。
本實(shí)施例用定量RT-PCR方法檢測(cè)每例⑶157基因的表達(dá)變化。具體步驟如下
步驟一外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)懸液的制備
在離心管中加入淋巴細(xì)胞分離液(Fresenius Kabi NOrgeAs:LYS3773) 5ml ;取上述確診的結(jié)核病患者，潛伏感染病人以及健康人群的肝素抗凝靜脈血各2ml與等量IM的磷酸緩沖液(PBS)充分混勻得到混合液，用移液器將混合液沿管壁緩慢疊加于淋巴細(xì)胞分離液液面上，保持清晰的界面，2000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘；用吸管吸取中間云霧層置入另一離心管后接著加入5倍體積的IM PBS, 1500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘洗滌細(xì)胞，棄上清，相同條件重復(fù)洗滌細(xì)胞一次，接著加入含小牛血清體積百分比為10%的的RPMI 1640 (Thermo scientific SH30807. 01b) lml,重懸細(xì)胞，得到三組人群的各20例PBMC懸液；每例取 20 μ I的PBMC懸液于血球計(jì)數(shù)板上，計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度。
步驟二 RNA抽提
采用Qiagene公司的RNeasy Mini Kit (貨號(hào)74106)對(duì)上述得到的三組人群的各20例PBMC懸液進(jìn)行RNA抽提。具體操作是取上述含I X IO6個(gè)細(xì)胞的PBMC懸液于去 DNA酶和RNA酶的離心管中，3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，棄上清；在細(xì)胞沉淀中加入350 μ I Buffer RLT,充分混勻裂解；加入250 μ I無水乙醇，混勻，把液體轉(zhuǎn)移到RNeasy柱子中， 8，OOOg離心30秒，棄廢液；加入350 μ I Buffer Rffl以8，OOOg離心30秒，棄廢液；加入 80 μ I DNase 溶液(10μ1 DNase+70 μ I BufferRDD)，柱上消化 15min，8，OOOg 離心 30 秒，棄廢液；加入350μ1 BufferRWl,8，OOOg離心30秒，棄廢液；加入500μ I Buffer RPE,8, OOOg 離心30秒，棄廢液；空甩，8，OOOg離心I分鐘；把柱子轉(zhuǎn)移到一個(gè)去DNA酶和RNA酶的1. 5ml 離心管，加入40 μ I無RNase的ddH20,10，OOOg離心I分鐘，收集三組人群的各20例的RNA 于-80° C保存、待用。
步驟三反轉(zhuǎn)錄
采用TAKARA公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(DRR047)，取步驟二得到的RNA O. 5 μ g進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，該試劑盒較傳統(tǒng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒增加了去除基因組DNA的步驟，可在最大程度上保證 RNA的純度和擴(kuò)增的特異性。分步如下
(I)基因組DNA的去除反應(yīng)
表I
權(quán)利要求
1.一種CD157基因的用途，其特征在于，用于制備判別結(jié)核潛伏感染和活動(dòng)性結(jié)核的產(chǎn)品
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CD157基因的用途，其特征在于，所述判別結(jié)核潛伏感染和活動(dòng)性結(jié)核的產(chǎn)品包括用實(shí)時(shí)定量PCR或基因芯片檢測(cè)判別結(jié)核潛伏感染和活動(dòng)性結(jié)核的產(chǎn)品
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的CD157基因的用途，其特征在于，所述用實(shí)時(shí)定量PCR判別結(jié)核潛伏感染和活動(dòng)性結(jié)核的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增⑶157基因的引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的⑶157基因的用途，其特征在于，所述特異擴(kuò)增CD157基因的引物，為CD157-F :5’ -GCTGGAACATGAACGATGTG-3’，CD157-R :5，-GAAGCCAGCACCAGAAAGAG-3，。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的CD157基因的用途，其特征在于，所述用基因芯片檢測(cè)判別結(jié)核潛伏感染和活動(dòng)性結(jié)核的產(chǎn)品包括與CD157基因的核酸序列雜交的探針。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種CD157基因的用途，用于制備判別結(jié)核潛伏感染和活動(dòng)性結(jié)核的產(chǎn)品。所述判別結(jié)核潛伏感染和活動(dòng)性結(jié)核的產(chǎn)品優(yōu)選包括用實(shí)時(shí)定量PCR或基因芯片檢測(cè)判別結(jié)核潛伏感染和活動(dòng)性結(jié)核的產(chǎn)品。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明CD157基因在結(jié)核病人血液中的表達(dá)明顯高于健康人群以及潛伏感染人群，因此CD157基因可作為診斷結(jié)核的特異標(biāo)志基因，使結(jié)核診斷更加準(zhǔn)確、快速。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103060446SQ20121058066
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月28日
發(fā)明者陳心春, 蔡毅, 周伯平, 楊倩婷, 張明霞 申請(qǐng)人:深圳市第三人民醫(yī)院