人精原干細胞體外分化為功能精子細胞的三維誘導方法。

背景技術：

目前，全世界約有15%育齡夫婦不孕不育，其中男性因素占50%；研究表明，歐洲20%男性不育患者屬于無精子癥。無精子癥在中國男性不育患者中高達25%。而且，因為“晚婚晚育”等社會問題，這一疾病正逐年加劇。因此在體外獲得有受精能力的生殖細胞一直是生殖生物學和生殖醫(yī)學領域的難題和熱點。精子發(fā)生（Spermatogenesis）是指精原干細胞（Spermatogonial stem cells，SSCs）自我更新并分化為成熟精子細胞的過程。很多無精癥患者有精原干細胞，但由于體內睪丸微環(huán)境的缺失或破壞，導致無法獲得功能性精子。因此，如果能將精原干細胞體外誘導分化成有功能的精子，可為無精癥病人提供種子細胞，治療男性不育，使男性不育患者擁有自己孩子的夢想得以實現(xiàn)。然而，目前尚未有從精原干細胞體外誘導分化為精子的相關報道。

Sousa等將分離獲得的非梗阻性無精子癥（Nonobstructive Azoospermic，NOA）病人生殖細胞和體細胞（包括精原干細胞、精母細胞和支持細胞），在腎細胞（Vero細胞）條件培養(yǎng)基中添加促卵泡素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）、睪酮，培養(yǎng)2-3周后，檢測到6.9%細胞進入減數(shù)分裂，22.7%細胞發(fā)育至精子細胞；將獲得的圓形精子注射到卵母細胞（ROSI），胚胎受精率為37.5%，囊胚率28.6%。

Yang等誘導隱睪病人的精原干細胞體外分化為有受精和發(fā)育潛能的精子細胞，但是其起始細胞包含有少量精母細胞，且分化效率比較低。

目前的研究方法起始細胞純度不夠，不是單一的精原干細胞，不能明確表明是精子是從精原干細胞分化而來。

Ribooldi等將非梗阻型無精子癥（NOA）病人睪丸細胞中CD49F-陽性細胞與睪丸支持細胞共培養(yǎng)5天后檢測到單倍體細胞，但是，CD49F不是特異的人精原干細胞表面標記物，人支持細胞也表達CD49F。并且，其存在以下不足：第一，由于CD49F不是特異的人精原干細胞表面標記物，起始細胞純度不夠；第二，只是檢測到了精子，沒有明確誘導效率；第三，沒有進行功能檢測，不能確定誘導獲得精子細胞是否具有功能。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術的不足，而提供一種人精原干細胞體外分化為功能精子細胞的三維誘導方法，該方法對精原干細胞進行體外誘導，獲得了具有受精能力的精子細胞。

本發(fā)明采用如下技術方案：

人精原干細胞體外分化為功能精子細胞的三維誘導方法，包括如下步驟：

1)稱取睪丸組織置于DMEM/F12中，剪成組織小塊，用DMEM/F12清洗，除去殘留的血細胞；

2）將步驟1）所得睪丸組織剪至半液態(tài)，添加DMEM/F12，將睪丸組織轉移到容器內；

3）向步驟2）的睪丸組織中加入酶消化液Ⅰ，置于水浴搖床中進行孵育；

4）鏡檢，確保所有組織塊均已消化成單個生精小管，將含有生精小管的消化液轉移至另一新的離心管中，加入新鮮的DMEM/F12和10%FBS終止消化；

5）靜置，移除上清液，加入新鮮的DMEM/F12，充分清洗生精小管，重復操作數(shù)次；

6）向步驟5）得到的生精小管中加入酶消化液Ⅱ；

7）將步驟6）中的混合液轉移至另一新的離心管中，置于水浴搖床中進行孵育；

8）消化后，用移液管輕輕吹打數(shù)次，鏡檢，確保生精小管全部消化為單個細胞；

9）加入新鮮DMEM/F12和10%FBS終止消化，靜置10min，收集上清液進行離心；

10）棄上清液，加入DMEM/F12重懸細胞，靜置，收集上清液進行離心；

11）棄上清液，加入新鮮的DMEM/F12重懸細胞，濾網(wǎng)過濾，除去細胞團；

12）將步驟11）得到的細胞懸液進行離心，棄上清液，加入新鮮DMEM/F12；

13）將步驟12）得到的細胞懸液進行培養(yǎng)，分離生殖細胞和支持細胞；

14）將步驟13）中分離的生殖細胞經(jīng)磁珠激活細胞分選術（MACS）分離獲得GPR125-陽性精原干細胞；

15) 將步驟14）中分離的GPR125-陽性精原干細胞與絲裂霉素處理過的人支持細胞用DMEM/F12懸浮后，按1：3的比例混合，將混合細胞和Matrigel混合均勻，放入12孔培養(yǎng)板中；

16）將步驟15）中鋪好細胞的12孔板放入培養(yǎng)箱孵育，待Matrigel膠凝固后，緩慢加入誘導培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天更換新的誘導培養(yǎng)基；

17）誘導20天后，采用流式細胞術（FACS）分離得到單倍體精子細胞。

進一步，所述的人精原干細胞體外分化為功能精子細胞的三維誘導方法，包括如下步驟：

1)稱取0.8~1.5g睪丸組織置于10mL DMEM/F12中，剪成體積約3 × 3 × 3 mm³組織小塊，用DMEM/F12清洗3次，除去殘留的血細胞；

2）用剪刀將睪丸組織剪至半液態(tài)，添加20mL DMEM/F12，然后將組織轉移到120mL容器內；

3）向步驟2）的睪丸組織中加入酶消化液Ⅰ，置于34℃水浴搖床中，孵育10~15min；

4）鏡檢，確保所有組織塊均已消化成單個生精小管，將含有生精小管的消化液轉移至另一新的50mL離心管，加入30mL新鮮的DMEM/F12終止消化；

5）靜置5min，用25mL玻璃移液管移除上清液，加入50mL新鮮的DMEM/F12充分清洗生精小管，重復操作3次；

6）向步驟5）得到的生精小管中加入酶消化液Ⅱ；

7）將步驟6）中的混合液用10mL玻璃移液管轉移至另一新的離心管中，置于34℃水浴搖床，孵育15min；

8）消化后，用10mL玻璃移液管輕輕吹打10~15次，鏡檢，確保生精小管全部消化為單個細胞；

9）加入30mL新鮮的DMEM/F12和10%FBS終止消化，靜置10min，收集上清液，用1000rpm離心5min；

10）棄上清液，加入50mL DMEM/F12重懸細胞，靜置10min，收集上清液，1000rpm離心5min；

11）棄上清液，加入適量新鮮DMEM/F12重懸細胞，用40μm尼龍網(wǎng)過濾，除去細胞團；

12）將步驟11）得到的細胞懸液1000rpm離心5min，棄上清液，加入新鮮DMEM/F12；

13）將0.1%明膠3mL加入到25cm²的培養(yǎng)瓶中，34°C培養(yǎng)箱孵育1小時，去掉明膠后，將步驟12）得到的細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)3小時后，分離生殖細胞和支持細胞；

14）將步驟13）中分離的生殖細胞經(jīng)免疫磁珠激活細胞分選術分離GPR125-陽性精原干細胞；

15)將10ng/mL絲裂霉素加入生長密度為80%的人支持細胞上，34°C培養(yǎng)箱孵育2小時，PBS清洗6次后，用0.25%胰酶消化3min，加入10%FBS的DMEM/F12終止，1000rpm離心5min，棄上清液，收集絲裂霉素處理的支持細胞。

16)將步驟14）中分離的GPR125-陽性精原干細胞與步驟15）收集的絲裂霉素處理過的人支持細胞用DMEM/F12懸浮后，按1:3比例混合，0.4mL 10⁶個混合細胞和0.4mL Matrigel于冰上混合均勻，然后放入12孔板中；

17）將步驟16）中接種好細胞的12孔培養(yǎng)板放入34°C培養(yǎng)箱孵育1小時，待Matrigel膠凝固后，緩慢加入1mL誘導培養(yǎng)基，34°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天更換新的誘導培養(yǎng)基；

18）誘導20天后，采用流式細胞術分離得到單倍體精子細胞。

其中，步驟3）中所述的酶溶液Ⅰ由終濃度為2mg/mL 的膠原酶溶液和1μg/μl的DNaseⅠ組成，配制后過濾除菌，其中所述膠原酶為IV型膠原酶。

步驟6）中所述的酶消化液Ⅱ由終濃度為4mg/mL的膠原酶溶液、2.5mg/mL的透明質酸酶和2mg/mL的胰蛋白酶組成，配制后過濾除菌，其中所述膠原酶為IV型膠原酶。

步驟13）所述的分離生殖細胞和支持細胞，具體方法如下：將細胞懸液接種于25cm²培養(yǎng)瓶中，34°C培養(yǎng)3小時，支持細胞首先貼于培養(yǎng)瓶底，而生殖細胞仍懸浮于培養(yǎng)基中，收集培養(yǎng)基后1000rpm離心5min，棄上清液，收集生殖細胞。

步驟14）中所述的免疫磁珠激活細胞分選術（MACS）分離獲得GPR125-陽性精原干細胞，具體步驟如下：

a）將步驟13）中得到的生殖細胞重懸于1mL DMEM培養(yǎng)液，在1mL細胞懸液中加入25μL GPR125抗體，4°C旋轉培養(yǎng)過夜；

b）孵育后，用0.4%臺盼藍拒染法檢測細胞活力，然后用BSA-EDTA-PBS緩沖液將細胞洗滌3次，5min/次，最后將細胞重懸于80μL BSA-EDTA-PBS緩沖液中；

c）將20μL 磁性微珠加入細胞懸液，4°C旋轉培養(yǎng)，時間不超過20min，補加400μL BSA-EDTA-PBS緩沖液，終體積為500μL；

d）取5μL 細胞懸液，用0.4%臺盼藍拒染法檢測細胞活力；

e）將步驟c）得到的細胞懸液經(jīng)MACS預分離器過濾后，轉入BSA-EDTA-PBS緩沖液平衡的分離柱中，同時將分離柱置于磁場中，BSA-EDTA-PBS緩沖液為含有終濃度0.5%BSA和2mM EDTA的冰冷PBS緩沖液，配制后過濾除菌；

f）用BSA-EDTA-PBS緩沖液沖洗分離柱3次，0.5mL/次，收集未被標記的細胞GPR125-陰性細胞；

g）將分離柱脫離磁場，添加1mL BSA-EDTA-PBS緩沖液，并輕輕按下柱塞避免產生氣泡，收集GPR125-陽性精原干細胞，為提高細胞純度，可將收集的細胞進行二次MACS分離。

步驟17）中所述誘導培養(yǎng)基配置如下：DMEM/F12、10% 血清替代物(KSR)、2μM 視黃酸 (RA)、100ng/mL 干細胞生長因子（SCF）、

100ng/mL BMP4和10^-6M 睪酮。

步驟18）中采用流式細胞術分選單倍體精子細胞，具體步驟如下：

a）誘導20天后，將誘導培養(yǎng)基去掉，加入Disperse孵育1.5小時，使細胞從凝膠中分離出來，1200rpm離心5min，棄上清，

b）將步驟a得到的細胞用BSA-EDTA-PBS緩沖液懸浮，加入10μg/mL Hoechst 33342，34°C孵育40min；

c）將步驟b的混合細胞通過流式分選儀分選出單倍體精子細胞。

本發(fā)明通過免疫細胞化學法鑒定誘導獲得的精子細胞，其步驟如下：

a）將收集的單倍體細胞經(jīng)甩片機，1000rpm，離心5min進行細胞涂片；

b）室溫下，用PBS將細胞涂片沖洗2次，3min/次，用200μl 10%正常山羊血清封閉30min；

c）將一抗用100μL PBS按1:200稀釋，34°C孵育1小時或4°C孵育過夜，所述一抗為ACROSIN、PRM2、正常兔IgG或小鼠IgG，陰性對照由PBS代替一抗；

d）孵育后，細胞用PBS沖洗3次，200μl/次；

e）細胞用熒光素標記的羊抗兔IgG或羅丹明標記的羊抗兔或羅丹明標記的羊抗小鼠IgG二抗孵育1小時，并用DAPI進行細胞核染色，在熒光顯微鏡下觀察細胞。

本發(fā)明通過熒光原位雜交技術（FISH）檢測誘導獲得的精子細胞染色體數(shù)目，其步驟如下：

A）將收集到的單倍體細胞加入固定液，吹勻靜置10min，所述固定液為甲醇與乙酸按照體積比3:1配制的混合液；

B）1500rpm離心10min，去上清，再次加入固定液，吹勻靜置10min；

C）1500rpm離心10min，去上清，留20μL液體；

D)將步驟C的細胞吹勻，滴到載玻片上，56°C烤片25min；

E)將步驟D的載破片放入下面液體中依次浸泡：1mol/L氫氧化鈉 2min，2×SSC 10min，75%乙醇2min，85%乙醇2min，100%乙醇2min；

F)將步驟E的載玻片晾干，滴加探針10μL，用18×18蓋玻片封片，78°C 8min，42°C過夜進行變性雜交；

G）將步驟F的載玻片放入2×SSC 2min去掉蓋玻片，然后依次放入以下液體中處理：50%甲酰胺2min，2×SSC 2min，0.1%NP40 3min，70%乙醇2min，100%乙醇3min；

H）將步驟G的載玻片晾干，DAPI孵育10min，鏡檢觀察。

本發(fā)明通過圓形精子顯微注射法（ROSI）檢測誘導獲得的精子細胞的授精能力，其步驟如下：

用0.1%的透明質酸酶將小鼠卵母細胞周圍的顆粒細胞去掉，選擇帶有第一極體的卵子待用，通過帶有脈沖儀的顯微操作系統(tǒng)將誘導獲得的圓形精子細胞注射到卵子中，然后移入37°C培養(yǎng)箱觀察胚胎的發(fā)育情況。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明利用免疫磁珠激活細胞分選術（MACS）獲得了純度達99%的精原干細胞，并通過Matrigel構建了三維體系，并添加誘導分化的關鍵因子，對精原干細胞進行體外誘導，獲得的了具有受精能力的精子細胞。

建立功能性精子體外發(fā)生的三維培養(yǎng)體系不僅可為研究人類精子發(fā)生的分子機理提供優(yōu)良的模型，并且，可以為無精癥病人提供功能配子細胞，將使男性不育患者擁有自己遺傳背景的孩子。

附圖說明

圖1為誘導20天后流式分選單倍體精子圖；

圖2為免疫熒光檢測誘導獲得的精子的標記物，其中A、D為ACROSIN蛋白染色，B、E為DAPI染色顯示的細胞核，C為A和B圖的合并結果，F(xiàn)為D和E圖的合并結果，G、J為PRM2蛋白染色，H、K為DAPI染色顯示的細胞核，I為G和H圖的合并結果，L為J和K圖的合并結果；

圖3為FISH技術檢測誘導獲得的精子的染色體數(shù)目，其中A為細胞中18號染色體的數(shù)目，B為細胞中X染色體數(shù)目，C為Y染色體的數(shù)目，D為DAPI染色顯示的細胞核，E為上述4幅圖合并的結果；

圖4為顯微注射驗證誘導獲得的精子的受精能力，其中A為顯微注射6小時后，胚胎發(fā)育到原核期，B為胚胎發(fā)育到2細胞期，C為胚胎發(fā)育到4-8細胞期胚胎。

具體實施方式

下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述。

本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā)明的范圍。

實施例1

人精原干細胞體外分化為功能精子細胞的三維誘導方法，包括如下步驟：

1)稱取1.0g睪丸組織置于10mL DMEM/F12中，剪成體積約3 × 3 × 3 mm³組織小塊，用DMEM/F12清洗3次，除去殘留的血細胞；

2）用剪刀將睪丸組織剪至半液態(tài)，添加20mL DMEM/F12，然后將組織轉移到120mL容器內；

3）向步驟2）的睪丸組織中加入酶消化液Ⅰ，置于34℃水浴搖床中，孵育10~15min，所述的酶溶液Ⅰ由終濃度為2mg/mL 膠原酶溶液和1μg/μL的DNaseⅠ組成，配制后過濾除菌，其中所述膠原酶為IV型膠原酶；

4）鏡檢，確保所有組織塊均已消化成單個生精小管，將含有生精小管的消化液轉移至另一新的50mL離心管，加入30mL新鮮的DMEM/F12終止消化；

5）靜置5min，用25mL玻璃移液管移除上清液，加入50mL新鮮的DMEM/F12充分清洗生精小管，重復操作3次；

6）向步驟5）得到的生精小管中加入酶溶液Ⅱ，所述的酶溶液Ⅱ由終濃度為4mg/mL的膠原酶溶液、2.5 mg/mL的透明質酸酶和2mg/mL的胰蛋白酶組成，配制后過濾除菌，其中所述膠原酶為IV型膠原酶；

7）將步驟6）中的混合液用10mL玻璃移液管轉移至另一新的離心管中，置于34℃水浴搖床，孵育15min；

8）消化后，用10mL玻璃移液管輕輕吹打10~15次，鏡檢，確保生精小管全部消化為單個細胞；

9）加入30mL新鮮的DMEM/F12和10%FBS終止消化，靜置10min，收集上清液，用1000rpm離心5min；

10）棄上清液，加入50mL DMEM/F12重懸細胞，靜置10min，收集上清液，1000rpm離心5min；

11）棄上清液，加入適量新鮮DMEM/F12重懸細胞，用40μm尼龍網(wǎng)過濾，除去細胞團；

12）將步驟11）得到的細胞懸液1000rpm離心5min，棄上清液，加入新鮮DMEM/F12；

13）將0.1%明膠3mL加入到25cm²的培養(yǎng)瓶中，34℃培養(yǎng)箱孵育1小時，去掉明膠后，將步驟12）得到的細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)3小時后，分離生殖細胞和支持細胞，具體方法如下：將細胞懸液接種于25cm²培養(yǎng)瓶中，34℃培養(yǎng)3小時，支持細胞首先貼于培養(yǎng)瓶底，而生殖細胞仍懸浮于培養(yǎng)基中，收集培養(yǎng)基后1000rpm離心5min，棄上清液，收集生殖細胞；

14）將步驟13）中分離的生殖細胞經(jīng)免疫磁珠激活細胞分選術（MACS）分離GPR125-陽性精原干細胞，具體步驟如下：

a）將步驟13）中得到的生殖細胞重懸于1mL DMEM培養(yǎng)液，在1mL細胞懸液中加入25μL GPR125抗體，4°C旋轉培養(yǎng)過夜；

b）孵育后，用0.4%臺盼藍拒染法檢測細胞活力，然后用BSA-EDTA-PBS緩沖液將細胞洗滌3次，5min/次，最后將細胞重懸于80μL BSA-EDTA-PBS緩沖液中；

c）將20μL 磁性微珠加入細胞懸液，4°C旋轉培養(yǎng)，時間不超過20min，補加400μL BSA-EDTA-PBS緩沖液，終體積為500μL；

d）取5μL 細胞懸液用0.4%臺盼藍拒染法檢測細胞活力；

e）將步驟c）得到的細胞懸液經(jīng)MACS預分離器（30μm）過濾后，轉入BSA-EDTA-PBS緩沖液平衡的分離柱中，同時將分離柱置于磁場中，BSA-EDTA-PBS緩沖液為含有終濃度0.5%BSA和2mM EDTA的冰冷PBS緩沖液，配制后過濾除菌；

f）用BSA-EDTA-PBS緩沖液沖洗分離柱3次，0.5mL/次，收集未被標記的細胞（GPR125陰性細胞）；

g）將分離柱脫離磁場，添加1mL BSA-EDTA-PBS緩沖液，并輕輕按下柱塞避免產生氣泡，收集GPR125-陽性精原細胞，為提高細胞純度，將收集的細胞進行第二次MACS分離；

15)將10ng/mL絲裂霉素加入生長密度為80%的支持細胞上，34°C培養(yǎng)箱孵育2小時，PBS清洗6次后用0.25%胰酶消化3min，加入10%FBS的DMEM/F12終止，1000rpm離心5min，棄上清液，收集絲裂霉素處理的人支持細胞。

16)將步驟14）中分離的GPR125-陽性精原干細胞與步驟15）收集的絲裂霉處理過的人支持細胞用DMEM/F12懸浮后，按1:3比例混合，0.4mL 10⁶個混合細胞和0.4mL Matrigel于冰上混合均勻，然后放入12孔培養(yǎng)板中；

17）將步驟16）中鋪好細胞的12孔培養(yǎng)板放入34°C培養(yǎng)箱孵育1小時，待Matrigel膠凝固后，緩慢加入1mL誘導培養(yǎng)基，34°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天更換新的誘導培養(yǎng)基，所述誘導培養(yǎng)基配置如下：DMEM/F12、10% 血清替代物(KSR)，2μM 視黃酸 (RA)、100ng/mL 干細胞生長因子（SCF）、100ng/mL BMP4和10^-6M 睪酮；

18）誘導20天后，采用流式細胞術（FACS）分離得到單倍體精子細胞，具體步驟如下：

a）誘導20天后，將誘導培養(yǎng)基去掉，加入Disperse孵育1.5小時，使細胞從凝膠中分離出來，1200rpm離心5min，棄上清，

b）將步驟a得到的細胞用BSA-EDTA-PBS緩沖液懸浮，加入10μg/mL Hoechst 33342，34°C孵育40min；

c）將步驟b的混合細胞通過流式分選儀分選出單倍體精子細胞。

如圖1所示，誘導20天后通過流式分選獲得單倍體的效率為17.9％，其中，Hoechst33342為染料名稱。

實施例2

通過免疫細胞化學法鑒定實施例1誘導獲得的精子細胞，其步驟如下：

a）將收集的單倍體細胞經(jīng)抹片機，1000rpm，離心5min進行涂片；

b）室溫下，用PBS將細胞涂片沖洗2次，3min/次，用200μl 10%正常山羊血清封閉30min；

c）將一抗用100μL PBS按1:200稀釋，34°C孵育1小時或4℃孵育過夜，所述一抗為ACROSIN、PRM2、正常兔IgG或小鼠IgG，陰性對照由PBS代替一抗；

d）孵育后，細胞用PBS沖洗3次，200μL/次；

e）細胞用熒光素(FITC)標記的羊抗兔IgG或羅丹明標記的羊抗兔或羅丹明標記的羊抗小鼠IgG二抗孵育1小時，并用DAPI進行細胞核染色，在熒光顯微鏡下觀察細胞。

如圖2所示：該圖為通過免疫熒光檢測獲得的單倍體是否是精子，該結果表明，誘導獲得的細胞具有精子細胞特異性表達的蛋白ACOSIN和PRM2，為精子細胞。

實施例3

通過熒光原位雜交技術（FISH）檢測實施例1誘導獲得的精子細胞染色體數(shù)目，其步驟如下：

A）將收集到的單倍體細胞加入固定液，吹勻靜置10min，所述固定液為甲醇與乙酸按照體積比3:1配制的混合液；

B）1500rpm離心10min，去上清，再次加入固定液，吹勻靜置10min；

C）1500rpm離心10min，去上清，留20 μL液體；

D)將步驟C)的細胞吹勻，滴到載玻片上，56°C烤片25min；

E)將步驟D）的載破片放入下面液體中依次浸泡：1mol/L氫氧化鈉 2min，2×SSC 10min，75%乙醇2min，85%乙醇2min，100%乙醇2min；

F)將步驟E）的載玻片晾干，滴加探針10μL，用18×18蓋玻片封片，78°C 8min，42°C過夜進行變性雜交；

G）將步驟F）的載玻片放入2×SSC 2min去掉蓋玻片，然后依次放入以下液體中處理：50%甲酰胺2min，2×SSC 2min，0.1%NP40 3min，70%乙醇2min，100%乙醇3min；

H）將步驟G)的載玻片晾干，DAPI孵育10min，鏡檢觀察。

如圖3所示，該圖為通過FISH技術檢測誘導獲得的精子的染色體數(shù)目，其中A為細胞中18號染色體的數(shù)目，B為細胞中X染色體數(shù)目，C為Y染色體的數(shù)目，D為DAPI染色顯示的細胞核，E為上述4幅圖合并的結果，該結果表示誘導獲得的精子細胞具有正常的染色體數(shù)目。

實施例4

通過圓形精子顯微注射法（ROSI）檢測實施例1誘導獲得的精子細胞的授精能力，其步驟如下：

用0.1%的透明質酸酶將小鼠卵母細胞周圍的顆粒細胞去掉，選擇帶有第一極體的卵子待用，通過帶有脈沖儀的顯微操作系統(tǒng)將誘導獲得的圓形精子注射到卵子中，然后移入37°C培養(yǎng)箱觀察胚胎發(fā)育情況。

如圖4所示：將本發(fā)明誘導獲得的精子顯微注射小鼠卵母細胞后，對其胚胎發(fā)育情況檢測，其中A為顯微注射6小時后，胚胎發(fā)育到原核期； B為胚胎發(fā)育到2細胞期；C為胚胎發(fā)育到4-8細胞期胚胎。由圖可見，體外誘導獲得的精子細胞具有受精的能力。

本行業(yè)的技術人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等效物界定。