本發(fā)明屬于病原培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于培養(yǎng)副豬嗜血桿菌的液體培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
豬副豬嗜血桿菌病，又稱豬革拉斯氏病(disease)，是由副豬嗜血桿菌引起的以多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為特征的傳染病，是近年來嚴(yán)重危害世界養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要細(xì)菌性傳染病之一。目前，已經(jīng)證實(shí)副豬嗜血桿菌在我國絕大多數(shù)豬場存在和流行，主要影響5～8周齡的仔豬，發(fā)病率一般為l0％～15％，嚴(yán)重時(shí)死亡率可達(dá)50％以上，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。但目前針對副豬嗜血桿菌的培養(yǎng)存在很多問題，比如培養(yǎng)基成本高、營養(yǎng)要求高、pH值要求嚴(yán)格，培養(yǎng)密度低等。這都對該疫苗的研究造成嚴(yán)重影響，因此研制一種副豬嗜血桿菌的高密度培養(yǎng)基，具有十分重要的意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的發(fā)明目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種高效能、低成本的副豬嗜血桿菌液體培養(yǎng)基的制備，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。
本發(fā)明的液體培養(yǎng)基，其包含有如下的組分：胰蛋白胨、大豆蛋白胨、氯化鈉、磷酸氫二鉀、葡萄糖、酵母粉、牛血清和輔酶Ⅰ，其pH值為7.2～7.4。
其組分濃度為胰蛋白胨18～25.0g/L、大豆蛋白胨3.0～5.0g/L、氯化鈉5.0g/L、磷酸氫二鉀3.0～4.0g/L、葡萄糖2.0～3.0g/L、酵母粉1.0～5.0g/L、滅活牛血清30ml/L～100ml/L、輔酶Ⅰ1.0～30g/L，pH值調(diào)至7.2～7.4。
作為優(yōu)選，其組分濃度為胰蛋白胨22.0g/L、大豆蛋白胨4.0g/L、氯化鈉5.0g/L、磷酸氫二鉀3.0g/L、葡萄糖2.5g/L、酵母粉3.0g/L、滅活牛血清50ml/L、輔酶Ⅰ0.1g/L，pH值調(diào)至7.2～7.4。
上述培養(yǎng)基的制備方法如下：
分別稱取胰蛋白胨，大豆蛋白，氯化鈉，磷酸氫二鉀，葡萄糖，酵母粉，加入去離子水，定容后充分搖勻溶解，調(diào)pH值至7.2～7.4，121℃高壓蒸汽滅菌15min；冷卻后，按無菌要求加入滅活牛血清和過濾除菌的1％NAD輔酶Ⅰ。
本發(fā)明的培養(yǎng)基通過補(bǔ)充各種微生物所需要的營養(yǎng)成分，并通過氫氧化鈉有效控制培養(yǎng)基中的pH值，有利于副豬嗜血桿菌的生長，活菌數(shù)均不低于109CFU/ml，并將副豬嗜血桿菌菌液制備滅活疫苗，其安全性和免疫效力均良好。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。
實(shí)施例1按照不同配方制備本發(fā)明培養(yǎng)基
1培養(yǎng)基制備按不同的培養(yǎng)基配方配制6種不同成分的培養(yǎng)基。具體配方見表1。
表1液體培養(yǎng)基制備方法
實(shí)施例2不同配方液體培養(yǎng)基的篩選：
將副豬嗜血桿菌YBH05株(副豬嗜血桿菌已于2011年11月23日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為：CGMCC No.5480)的菌液，分別按5％接種上述6種液體培養(yǎng)基，置37℃，150r/min振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間均為24小時(shí)，于培養(yǎng)不同時(shí)間分別取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。不同配方液體培養(yǎng)基的篩選試驗(yàn)結(jié)果表明，按照配方三、配方四制備的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)效果較好，14～16小時(shí)活菌數(shù)均不低于109CCU/ml，配方五和配方六因?yàn)榕囵B(yǎng)基中的血清等輔液成分加入量較高，使培養(yǎng)基營養(yǎng)過于豐富，導(dǎo)致YBH05株生長過快，衰亡也較快，且血清等輔液成分加入量高，也增加了生產(chǎn)成本；配方一和配方二培養(yǎng)菌液密度較低。綜合考慮，最終選擇配方三制備的液體培養(yǎng)基來驗(yàn)證培養(yǎng)效果。結(jié)果見表2。
表2：6種液體培養(yǎng)基培養(yǎng)不同時(shí)間活菌計(jì)數(shù)結(jié)果
實(shí)施例3：本發(fā)明培養(yǎng)基與胰蛋白胨大豆肉湯液體培養(yǎng)基培養(yǎng)效果比較
將YBH05株凍干種子復(fù)蘇純化后，按3-5％分別接種胰蛋白胨大豆肉湯液體培養(yǎng)基和本發(fā)明的配方三的液體培養(yǎng)基，分別置37℃，150r/min振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，于培養(yǎng)不同時(shí)間分別取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。試驗(yàn)結(jié)果表明，應(yīng)用本發(fā)明培養(yǎng)基，不同培養(yǎng)時(shí)間的活菌量均高于胰蛋白胨大豆肉湯液體培養(yǎng)基。不同培養(yǎng)時(shí)間的活菌量結(jié)果見表3。
表3：培養(yǎng)基的選擇試驗(yàn)結(jié)果
實(shí)施例4：
本發(fā)明培養(yǎng)基的驗(yàn)證應(yīng)用本發(fā)明配方三的培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)3批YBH05株菌液，分別進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，以驗(yàn)證培養(yǎng)工藝的可行性。驗(yàn)證結(jié)果表明，YBH05株的菌液活菌量為2.5～3.0×109CFU/ml，本發(fā)明培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果確實(shí)可行。結(jié)果見表4。
表4本發(fā)明驗(yàn)證結(jié)果
使用其它副豬嗜血桿菌作為種子的培養(yǎng)效果也表明本發(fā)明的培養(yǎng)基也具有很好的效果。
由上述試驗(yàn)結(jié)果可以看出本發(fā)明培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中培養(yǎng)時(shí)間短，生長快、活菌量高，非常適合副豬嗜血桿菌的大規(guī)模生產(chǎn)培養(yǎng)。