本申請是申請日為2004年11月05日和發(fā)明名稱為“穩(wěn)定的α螺旋肽及其用途”的201310178526.4號發(fā)明專利申請的分案申請。

優(yōu)先權(quán)的請求

本申請在35usc§119(e)下要求于2003年11月5日提交的u.s.專利申請系列號60/517,848和于2004年7月27日提交的u.s.專利申請系列號60/591,548的優(yōu)先權(quán)，其每個申請的全部內(nèi)容在此并入作為參考。

背景

細胞凋亡或程序性細胞死亡在所有的多細胞生物體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的發(fā)展和保持中發(fā)揮重要的作用。對細胞凋亡的敏感性在細胞當中是顯著不同的，并且受外部和內(nèi)部細胞事件的影響。已經(jīng)定義了介導(dǎo)細胞命運的正反調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，并且已經(jīng)在廣譜的人類疾病，包括各種癌癥的發(fā)病中證明了這些蛋白質(zhì)信號網(wǎng)絡(luò)的失調(diào)。bcl-2是這個細胞凋亡蛋白質(zhì)家族的基本成員，并且首先在t(14；18)(q32；q21)淋巴瘤的染色體斷裂點被鑒定出來(bakhashietal.1985cell41:899；clearyetal.1985proc.nat’l.acad.sci.usa82:7439)。

基因重排將bcl-2置于免疫球蛋白重鏈基因座的轉(zhuǎn)錄調(diào)控下，產(chǎn)生bcl-2的不適當高水平且導(dǎo)致病理性細胞存活。已經(jīng)在淋巴細胞和粒細胞性白血病和許多其他的惡性腫瘤的細胞凋亡中鑒定出這種失常，并且它已經(jīng)與腫瘤進展和對化療-誘導(dǎo)的細胞凋亡的獲得性耐受力有關(guān)。bcl-2家族的蛋白質(zhì)已有相當多的闡述，并且包括提供控制細胞死亡敏感性的制約與平衡的促-和抗-細胞凋亡分子(圖1)。不會令人驚訝地，細胞凋亡蛋白質(zhì)已經(jīng)成為開發(fā)防止細胞損失疾病中突然的細胞死亡并且活化惡性腫瘤中細胞死亡通路的治療劑的關(guān)鍵靶物。

bcl-2家族被定義為存在多達四個命名為bh1、bh2、bh3、和bh4的保守的“bcl-2同源”(bh)結(jié)構(gòu)域，其都包括α-螺旋節(jié)段(chittendenetal.1995embo14:5589；wangetal.1996genesdev.10:2859)。抗-細胞凋亡蛋白質(zhì)，例如bcl-2和bcl-xl，在所有的bh結(jié)構(gòu)域顯示序列保守性。促-細胞凋亡蛋白質(zhì)被分為在bh1、bh2和bh3結(jié)構(gòu)域中具有同源性的“多結(jié)構(gòu)域”成員(例如bak、bax)，和包含專門在bh3兩親性的α-螺旋節(jié)段中的序列同源性的“只有bh3-結(jié)構(gòu)域”成員(例如bid、bad、bim、bik、noxa、puma)。bcl-2家族成員具有形成同型和雜二聚物的能力，表明在促-和抗-細胞凋亡蛋白水平之間的競爭性結(jié)合和比例支配了對死亡刺激的敏感性?？?細胞凋亡蛋白質(zhì)能夠保護細胞避免促-細胞凋亡過量，即過度的程序性細胞死亡。附加的“安全”測量包括調(diào)節(jié)促-細胞凋亡蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄并保持他們?yōu)榉腔罨臉?gòu)象體，其需要蛋白水解的活化、去磷酸化、或配體-誘導(dǎo)的構(gòu)象變化來活化促-死亡功能。在某些細胞類型中，在質(zhì)膜收到的死亡信號通過線粒體途徑觸發(fā)細胞凋亡(圖2)。線粒體可通過隔離細胞色素c，這一活化胱冬蛋白酶9而導(dǎo)致致命的下游蛋白水解事件的細胞溶質(zhì)復(fù)合物的關(guān)鍵成分來作為細胞死亡的看門者發(fā)揮作用。多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)，例如bcl-2/bcl-xl和bak/bax在線粒體膜發(fā)揮保護者和執(zhí)行者的作用，其活性進一步受到上游bh3-bcl-2家族的唯一成員的調(diào)節(jié)。例如，bid是促-細胞凋亡蛋白質(zhì)的“只有bh3-結(jié)構(gòu)域”子集中的成員，并且傳輸在質(zhì)膜收到的死亡信號至在線粒體膜的效應(yīng)物促-細胞凋亡蛋白質(zhì)。bid具有與促-和抗-細胞凋亡蛋白質(zhì)相互作用的獨特能力，并且當受到胱冬蛋白酶8的活化時，觸發(fā)細胞色素c釋放和線粒體的細胞凋亡。缺失和誘變研究確定促細胞凋亡家族成員的兩親性α-螺旋bh3節(jié)段起死亡結(jié)構(gòu)域的作用，并且因此表現(xiàn)出與多結(jié)構(gòu)域細胞凋亡蛋白質(zhì)相互作用的決定性結(jié)構(gòu)基序。結(jié)構(gòu)研究已經(jīng)證明bh3螺旋通過插入由bh1、2和3結(jié)構(gòu)域的接觸面形成的疏水性溝槽而與抗-細胞凋亡蛋白質(zhì)相互作用。活化的bid可被抗-細胞凋亡蛋白質(zhì)結(jié)合和隔離(例如,bcl-2和bcl-xl)并且可觸發(fā)促-細胞凋亡蛋白質(zhì)bax和bak的活化，導(dǎo)致細胞色素c釋放和線粒體的細胞凋亡程序。

bad也是“只有bh3-結(jié)構(gòu)域”(bh3-domainonly)的促-細胞凋亡家族成員，其表達同樣觸發(fā)bax/bak的活化。然而與bid相反，bad顯示優(yōu)先結(jié)合抗-細胞凋亡成員，bcl-2和bcl-xl。盡管badbh3結(jié)構(gòu)域顯示高親合力結(jié)合bcl-2，badbh3肽不能體外活化細胞色素c從線粒體釋放，表明bad不是bax/bak的直接活化劑。過表達bcl-2的線粒體抗bid-誘導(dǎo)細胞色素c釋放，但與bad的共同治療可恢復(fù)bid靈敏性。由bad誘導(dǎo)的線粒體的細胞凋亡看來似乎是由于∶(1)bax/bak活化劑，例如bid和bid-樣的蛋白質(zhì)從bcl-2/bcl-xl結(jié)合袋的置換(displacement)，或(2)bcl-2/bcl-xl結(jié)合袋被bad選擇性占據(jù)而阻止bid-樣蛋白質(zhì)被抗-細胞凋亡蛋白質(zhì)螯合分離。因此，已經(jīng)出現(xiàn)兩種類型的“只有bh3-結(jié)構(gòu)域”的蛋白質(zhì)，bid-樣蛋白質(zhì)直接活化線粒體的細胞凋亡，而bad-樣蛋白質(zhì)具有敏化線粒體為被多結(jié)構(gòu)域抗-細胞凋亡蛋白質(zhì)的結(jié)合袋占據(jù)的bid-樣促-細胞凋亡的能力。

已經(jīng)對鑒定或產(chǎn)生小分子以體外探測細胞凋亡蛋白質(zhì)功能并且在體內(nèi)特異控制細胞凋亡途徑的目的提出挑戰(zhàn)。高流通量篩選已經(jīng)鑒定了抑制bakbh3結(jié)構(gòu)域與bcl-xl微摩爾親合力的相互作用的若干分子。除鑒定低親合力化合物的潛在缺陷之外，該技術(shù)在產(chǎn)生適合蛋白質(zhì)家族個別成員的精細結(jié)合特異性的化合物控制板的其能力方面受到限制。控制細胞凋亡途徑的備選途徑來源于肽工程化，該技術(shù)使用非特異的肽序列來產(chǎn)生具有所需要三維結(jié)構(gòu)的化合物。這種技術(shù)的一個應(yīng)用涉及產(chǎn)生由用于通過破裂線粒體膜來誘導(dǎo)細胞死亡的非特異性肽序列組成的“促-細胞凋亡”α-螺旋。

α-螺旋是蛋白質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)成份之一并且經(jīng)常在蛋白質(zhì)接觸界面被發(fā)現(xiàn)，其參與多種分子間的生物學識別事件。理論上，螺旋肽，例如bh3螺旋，可用于有選擇地干擾或穩(wěn)定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，由此控制生理學過程。然而，當從全長蛋白質(zhì)的范圍內(nèi)取出并被放入溶液中時，蛋白質(zhì)內(nèi)的生物學活化的螺旋基序一般具有很少的結(jié)構(gòu)。因此，蛋白質(zhì)肽片段已經(jīng)由于二級結(jié)構(gòu)螺旋的損失損害了其作為體內(nèi)反應(yīng)物的效力，其對蛋白水解的敏感性退化，并且不能透入完整細胞。盡管已經(jīng)報道了共價螺旋穩(wěn)定化的若干方法，大多數(shù)方法論涉及極化和/或不穩(wěn)定的交聯(lián)(phelanetal.1997j.am.chem.soc.119:455；leucetal.2003proc.nat’l.acad.sci.usa100:11273；brackenetal.,1994j.am.chem.soc.116:6432；yanetal.2004bioorg.med.chem.14:1403)。隨后，verdine及其同事開發(fā)了備選的基于置換的方法，其使用包含烷基栓鏈(tethers)的α,α-二取代的非天然氨基酸(schafmeisteretal.,2000j.am.chem.soc.122:5891；blackwelletal.1994angewchem.int.ed.37:3281)。

概述

本發(fā)明部分地基于具有至少兩個改變氨基酸(定義為“烴環(huán)鉤”(hydrocarbonstapling)方法)的穩(wěn)定交聯(lián)的多肽可幫助構(gòu)象地賦予該多肽天然二級結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)。例如，使傾向于具有α-螺旋二級結(jié)構(gòu)的多肽交聯(lián)可約束該多肽至其天然的α-螺旋構(gòu)象。被約束的二級結(jié)構(gòu)可增加該多肽對蛋白水解切割的耐受性并且也增加疏水性。令人驚訝地，在有些情況下，該多肽可透過細胞膜(例如，通過能量-依賴的轉(zhuǎn)運機制，例如胞飲作用)。因此，在此描述的交聯(lián)多肽可相對于相應(yīng)的未交聯(lián)多肽具有改善的生物活性。例如該交聯(lián)的多肽可包括bcl-2家族成員多肽的α-螺旋結(jié)構(gòu)域(例如,bid-bh3結(jié)構(gòu)域)，其可結(jié)合bak/bax和/或bcl-2/bcl-xl以在受試體中促進細胞凋亡。在有些情況下，該交聯(lián)的多肽可用于抑制細胞凋亡?？芍委熜缘厥褂迷撛诖怂枋龅慕宦?lián)多肽，例如,在受試體中用于治療癌癥。

在一個方面，本發(fā)明描述了通式(i)的多肽，

其中；

每個r1和r2獨立地是h、或c1至c10烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜芳基烷基、或雜環(huán)基烷基；

r3是烷基、烯基、炔基；[r4-k-r4]n；其每個用0-6個r5取代；

r4是烷基、烯基、或炔基；

r5是鹵素、烷基、or6、n(r6)2、sr6、sor6、so2r6、co2r6、r6、熒光部分、或放射性同位素；

k是o、s、so、so2、co、co2、conr6、或

r6是h、烷基、或治療劑；

n是1-4的整數(shù)；

x是2-10的整數(shù)；

每個y獨立地是0-100的整數(shù)；

z是1-10的整數(shù)(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)；以及

每個xaa獨立地是氨基酸。

在一些實例中，該多肽結(jié)合bcl-2家族蛋白質(zhì)。該多肽可結(jié)合抗-細胞凋亡蛋白質(zhì)。該多肽可結(jié)合原-細胞凋亡蛋白質(zhì)。該多肽可結(jié)合和活化bax或bak。在一些實例中，該多肽結(jié)合bh1、bh2和/或bh3結(jié)構(gòu)域。

在一些實例中，該多肽活化細胞死亡，例如該多肽可觸發(fā)細胞色素c釋放并活化線粒體的細胞死亡。

在另外的實例中，該多肽可抑制細胞死亡。

在一些實例中，該多肽包括bh3結(jié)構(gòu)域。

在一些實例中，x是2、3、或6。

在一些實例中，每個y獨立地是3和15之間的整數(shù)。

在一些實例中，r1和r2各自獨立地是h或c1-c6烷基。

在一些實例中，r1和r2各自獨立地是c1-c3烷基。

在一些實例中，r1和r2中的至少一個是甲基。例如r1和r2都是甲基。

在一些實例中，r3是烷基(例如，c8烷基)并且x是3。

在一些實例中，r3是c11烷基并且x是6。

在一些實例中，r3是烯基(例如，c8烯基)并且x是3。

在一些實例中，x是6并且r3是c11烯基。

在一些實例中，r3是直鏈烷基、烯基、或炔基。

在一些實例中，r3是–ch2–ch2-ch2-ch＝ch-ch2-ch2-ch2-。

在某些實施方案中，兩個α，α二取代的立構(gòu)中心都是r構(gòu)型或s構(gòu)型(例如,i,i+4交聯(lián)),或一個立構(gòu)中心是r而另一個是s(例如,i,i+7交聯(lián))。因此，其中通式i描述為

c’和c”二取代的立構(gòu)中心可以都是r構(gòu)型或它們可以都是s構(gòu)型，例如當x是3。當x是6時,c’二取代的立構(gòu)中心可以是r構(gòu)型而c”二取代的立構(gòu)中心可以是s構(gòu)型。

r3雙鍵可以是e或z立體化學構(gòu)型(configuration)。

在一些實例中，r3是[r4-k-r4]n；而r4是直鏈烷基、烯基、或炔基。

在一些實例中，該多肽包括與ediirni*rhl*qvgdsnldrsiw(seqidno:112)的氨基酸序列至少大約60％(70％、80％、85％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列,其中*是栓鏈氨基酸。例如，可存在1、2、3、4、5個以上的氨基酸替換，例如保守替換。

該栓鏈(tether)可包括烷基、烯基、或炔基部分(例如,c5、c8或c11烷基或c5、c8或c11烯基,或c5、c8或c11炔基)。該栓鏈氨基酸可以是α二取代的(例如,c1-c3或甲基)。在一些實例中，該多肽可包括與ediirniarhla*vgd*nldrsiw(seqidno:110)的氨基酸序列至少大約60％(70％、80％、85％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列,其中*是栓鏈氨基酸。例如，可存在1、2、3、4、5個以上的氨基酸替換，例如保守替換。在一些實例中，多肽轉(zhuǎn)運通過細胞膜(例如，通過主動轉(zhuǎn)運或胞吞機制或通過被動轉(zhuǎn)運)。在某些實施方案中該多肽不包括cys或met。

在一些實施方案中，該多肽包括bcl-2或bcl-2樣結(jié)構(gòu)域的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、或更多個連續(xù)氨基酸,例如bh3結(jié)構(gòu)域或bh3-樣結(jié)構(gòu)域,例如，圖5a、5b和28a-28h中任何所描繪的多肽。每個[xaa]y是可獨立地包括bcl-2或bcl-2樣結(jié)構(gòu)域的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或更多個連續(xù)氨基酸,例如bh3結(jié)構(gòu)域或bh3-樣結(jié)構(gòu)域，例如圖5a、5b和28a-28h中任何所描繪的多肽的肽。[xaa]x是可包括bcl-2或bcl-2樣結(jié)構(gòu)域的3或6個連續(xù)氨基酸，例如bh3結(jié)構(gòu)域或bh3-樣結(jié)構(gòu)域,例如圖5a、5b和28a-28h中任何所描繪的多肽的肽。

該多肽可包括bcl-2或bcl-2樣結(jié)構(gòu)域的8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50個連續(xù)氨基酸，例如bh3結(jié)構(gòu)域或bh3-樣結(jié)構(gòu)域,例如圖5a、5b和28a-28h中任何所描繪的多肽(seqidnos:)，其中被三個氨基酸(或六個氨基酸)分隔開的兩個氨基酸由通過r3連接的氨基酸取代物替代。因此，至少兩個氨基酸可被栓鏈氨基酸或栓鏈氨基酸取代物替代。因此，其中通式i描述為

[xaa]y’和[xaa]y”可各自包括來自相同或不同bcl-2或bcl-2樣結(jié)構(gòu)域的連續(xù)多肽序列。

本發(fā)明描繪了包括bcl-2或bcl-2樣結(jié)構(gòu)域的10(11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50或更多個)連續(xù)氨基酸，例如bh3結(jié)構(gòu)域或bh3-樣結(jié)構(gòu)域,例如圖5a、5b(seqidnos:84-114)和28a-28h(seqidnos:1-83)中任何所描繪的多肽的交聯(lián)多肽，其中被三個氨基酸(或六個氨基酸)分隔開的兩個氨基酸的α碳通過r3連接，兩個α碳中的一個被r1取代而另一個被r2取代，并且每個通過肽鍵連接至附加的氨基酸。

在一些實施方案中，該多肽具有細胞凋亡活性。

在一些實例中,該多肽也包括熒光部分或放射性同位素。

在一些實例中,該多肽包括23個氨基酸；r1和r2是甲基；r3是c8烷基,c11烷基,c8烯基,c11烯基，c8炔基,或c11炔基；以及x是2、3或6。

在一些實例中,該多肽包括親合標記、靶向部分、和/或生物素部分。

在一些實例中,該多肽是選自圖28a-h(seqidnos:1-83)和5a-b(seqidnos:84-114)中所描繪多肽的多肽。在另外的方面，本發(fā)明描繪了制備通式(iii)的多肽的方法，包括

提供通式(ii)的多肽；以及

用催化劑處理通式(ii)的化合物以促進環(huán)閉合置換作用(methathesis),由此提供通式(iii)的化合物

其中

每個r1和r2獨立地是h,烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基；雜芳基烷基；或雜環(huán)基烷基；

每個n獨立地是1-15的整數(shù)；

x是2、3或6

每個y獨立地是0-100的整數(shù)；

z是1-10的整數(shù)(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)；以及

每個xaa獨立地是氨基酸。

在一些實例中,該多肽結(jié)合bcl-2家族成員蛋白質(zhì)。

在一些實例中,該催化劑是釕催化劑。

在一些實例中,該方法也包括在環(huán)閉合置換作用之后提供還原劑或氧化劑。

在一些實例中,該還原劑是h2或氧化劑是四氧化鋨(osmiumtetroxide)。

在一些實例中,本發(fā)明描述了治療受試體的方法，包括將在此描述的任何化合物施用于該受試體。在一些實例中,該方法也包括施用附加的治療劑。

在一些實例中,本發(fā)明描述了在受試體中治療癌癥的方法，包括將在此描述的任何化合物施用于該受試體。在一些實例中,該方法也包括施用附加的治療劑。

在一些實例中,本發(fā)明描述了在此所描述的化合物的文庫。

在一些實例中,本發(fā)明描述了鑒定用于促進細胞凋亡的候選化合物的方法，包括；

提供線粒體；

使該線粒體與在此所描述的化合物接觸；

測量細胞色素c釋放；以及

與缺少該化合物時的細胞色素c釋放比較在存在該化合物時的細胞色素c釋放，其中在存在通式1的化合物時細胞色素c釋放增加則鑒定該化合物為用于促進細胞凋亡的候選化合物。

在一些實例中,本發(fā)明描述了通式(iv)的多肽，

其中；

每個r1和r2獨立地是h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基，雜芳基烷基，或雜環(huán)基烷基；

r3是烷基、烯基、炔基；[r4-k-r4]n或天然存在的氨基酸側(cè)鏈；其中每個用0-6個r5取代；

r4是烷基、烯基或炔基；；

r5是鹵素、烷基、or6、n(r6)2、sr6、sor6、so2r6、co2r6、r6、熒光部分或放射性同位素；

k是o、s、so、so2、co、co2、conr6、或

r6是h、烷基、或治療劑；

r7是烷基、烯基、炔基；[r4-k-r4]n或天然存在的氨基酸側(cè)鏈；其中每個用0-6個r5取代；

n是1-4的整數(shù)；

x是2-10的整數(shù)；

每個y獨立地是0-100的整數(shù)；

z是1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)的整數(shù)；以及

每個xaa獨立地是氨基酸。

在一些實例中,本發(fā)明描述了通式(i)的多肽，

其中；

每個r1和r2獨立地是h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基，雜芳基烷基，或雜環(huán)基烷基；

r3是烷基、烯基、炔基；[r4-k-r4]n；其中每個用0-6個r5取代；

r4是烷基、炔基(烯基)或炔基；；

r5是鹵素、烷基、or6、n(r6)2、sr6、sor6、so2r6、co2r6、r6、熒光部分或放射性同位素；

k是o、s、so、so2、co、co2、conr6、或

r6是h、烷基、或治療劑；

n是1-4的整數(shù)；

x是2-10的整數(shù)；

每個y獨立地是0-100的整數(shù)；

z是1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)的整數(shù)；以及

每個xaa獨立地是氨基酸；

其中，通過圓二色光譜測定該多肽在含水溶液中具有至少5％的α螺旋度。

在一些實例中,通過圓二色光譜測定該多肽具有至少15％、至少35％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％的α螺旋度。

在一些實例中,本發(fā)明描述了通式(i)的多肽，

其中；

每個r1和r2獨立地是h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基，雜芳基烷基，或雜環(huán)基烷基；

r3是烷基、烯基、炔基；[r4-k-r4]n；其中每個用0-6個r5取代；

r4是烷基、炔基(烯基)或炔基；

r5是鹵素、烷基、or6、n(r6)2、sr6、sor6、so2r6、co2r6、r6、熒光部分或放射性同位素；

k是o、s、so、so2、co、co2、conr6、或

r6是h、烷基、或治療劑；

n是1-4的整數(shù)；

x是2-10的整數(shù)；

每個y獨立地是0-100的整數(shù)；

z是1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)的整數(shù)；以及

每個xaa獨立地是氨基酸；

其中通過圓二色光譜測定該多肽與通式(iv)的多肽相比具有至少1.25-倍的α螺旋增加

其中r1、r2、xaa、x、y、和z都如對于上述通式(i)所定義的。

在一些實例中,通過圓二色光譜測定該多肽與通式(iv)的多肽相比具有至少1.5-倍、至少1.75-倍、至少2.0-倍、至少2.5-倍、至少3-倍、至少4-倍的α螺旋度增加。

在一些實例中,本發(fā)明描述了鑒定用于抑制細胞凋亡的候選化合物的方法，包括；

提供線粒體；

使該線粒體與在此所描述的化合物接觸；

測量細胞色素c釋放；以及

與缺少在此所描述的化合物時的細胞色素c釋放比較在存在在此所描述的化合物時的細胞色素c釋放，其中在存在在此所描述的化合物時細胞色素c釋放降低則鑒定在此所描述的該化合物為用于抑制細胞凋亡的候選化合物。

取代基的組合和本發(fā)明可預(yù)見的變化只是導(dǎo)致形成穩(wěn)定化合物的那些。術(shù)語“穩(wěn)定的”，如在此所使用的，是指具有足夠容許制造的穩(wěn)定性和維持該化合物足夠時段的完整性以用于在此詳細描述的目的(例如,治療性施用于受試體或生成反應(yīng)物以研究或發(fā)現(xiàn)體外或體內(nèi)的生物學途徑)的化合物。

本發(fā)明的化合物可包含一個或多個不對稱中心，因此以消旋體和外消旋混合物、單對映異構(gòu)體、單獨的非對映異構(gòu)體和非對映體混合物的形式存在。這些化合物的所有這些同分異構(gòu)形式明確地包括在本發(fā)明之內(nèi)。本發(fā)明的化合物也可以多重互變異構(gòu)形式出現(xiàn)，在這種情況下，本發(fā)明明確地包括在此描述的化合物的全部互變異構(gòu)形式(例如,環(huán)狀系統(tǒng)的烷基化可導(dǎo)致在多重位點的烷基化，本發(fā)明明確地包括所有這些反應(yīng)產(chǎn)物)。這些化合物的所有這些同分異構(gòu)形式明確地包括在本發(fā)明之內(nèi)。在此描述的化合物的所有晶體形式明確地包括在本發(fā)明之內(nèi)。

術(shù)語“氨基酸”是指含有氨基和羧基的分子。適當?shù)陌被岵患酉拗频匕?，在肽中發(fā)現(xiàn)的20個普遍天然存在的d-和l-異構(gòu)體(例如,a，r、n、c、d、q、e、g、h、i、l、k、m、f、p、s、t、w、y、v(如由一個字母縮寫所表示的))以及通過有機合成或其他代謝途徑制備的天然存在和非天然存在的氨基酸。

"非必需的"氨基酸殘基是可從多肽的野生型序列(例如,bh3結(jié)構(gòu)域)被改變而不消除或基本上不改變其活性的殘基。"必需的"氨基酸殘基是可當從多肽的野生型序列被改變時，導(dǎo)致消除或基本上消除該多肽活性的殘基。

"保守氨基酸取代"是其中該氨基酸殘基被替換為具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的取代。本領(lǐng)域中已經(jīng)定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如,賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如,天冬氨酸、谷氨酸)、非電荷極化側(cè)鏈(例如,甘氨酸、天門冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如,丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支側(cè)鏈(例如,蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈(例如,酪氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。因此，在bh3多肽中預(yù)測的非必需氨基酸殘基例如優(yōu)選被替換為來自相同側(cè)鏈家族的另一個氨基酸殘基。

符號當用作分子結(jié)構(gòu)的一部分時，是指單鍵或反式或順式雙鍵。

術(shù)語“氨基酸側(cè)鏈”是指附著于氨基酸中α-碳的部分。例如，丙氨酸的氨基酸側(cè)鏈是甲基，苯丙氨酸的氨基酸側(cè)鏈是苯基甲基，半胱氨酸的氨基酸側(cè)鏈是硫甲基，天冬氨酸的氨基酸側(cè)鏈是羧甲基，酪氨酸的氨基酸側(cè)鏈是4-羥苯甲基等。其他非天然存在的氨基酸側(cè)鏈也包括例如天然存在的氨基酸側(cè)鏈(例如，氨基酸代謝產(chǎn)物)或合成制備的氨基酸側(cè)鏈(例如，α二-取代氨基酸)。

術(shù)語多肽包括通過共價鍵(例如酰胺鍵)連接的兩個或多個天然存在或合成的氨基酸。如在此描述的多肽包括全長蛋白質(zhì)(例如，充分加工的蛋白質(zhì))以及更短的氨基酸序列(例如，天然存在的蛋白質(zhì)的片段或合成的多肽片段)。

術(shù)語“鹵素”是指氟、氯、溴或碘的任何基團。術(shù)語“烷基”是指可能是直鏈或支鏈，包含指定數(shù)目的碳原子的碳氫鏈。例如，c1-c10表明該基團中可具有1至10個(包括在內(nèi)的)碳原子。當缺少任何數(shù)值標識時，“烷基”是其中具有1至20個(包括在內(nèi)的)碳原子的鏈(直的或分支的)。術(shù)語“亞烷基”是指二價的烷基(即,-r-)。

術(shù)語“烯基”是指可能是直鏈或支鏈，具有一個或多個碳-碳雙鍵的碳氫鏈。烯基部分包含指定數(shù)目的碳原子。例如，c2-c10表明該基團中可具有2至20個(包括在內(nèi)的)碳原子。術(shù)語“更低烯基”是指c2-c8烯基鏈。當缺少任何數(shù)值標識時，“烯基”是其中具有2至20個(包括在內(nèi)的)碳原子的鏈(直的或分支的)。

術(shù)語“炔基”是指可能是直鏈或支鏈，具有一個或多個碳-碳三鍵的碳氫鏈。炔基部分包含指定數(shù)目的碳原子。例如，c2-c10表明該基團中可具有2至20個(包括在內(nèi)的)碳原子。術(shù)語“更低炔基”是指c2-c8炔基鏈。當缺少任何數(shù)值標識時，“炔基”是其中具有2至20個(包括在內(nèi)的)碳原子的鏈(直的或分支的)。

術(shù)語“芳基”是指6-碳單環(huán)的或10-碳二環(huán)的芳香環(huán)系統(tǒng)，其中每個環(huán)的0、1、2、3、或4個原子可被取代基取代。芳基基團的實例包括苯基、萘基等。術(shù)語“芳基烷基”或術(shù)語“芳烷基”是指用芳基取代的烷基。術(shù)語“芳烷氧基”是指用芳基取代的烷氧基。

術(shù)語“環(huán)烷基”如在此所使用的，包括飽和和部分不飽和的環(huán)烴基團，其具有3至12個碳，優(yōu)選3至8個碳，更優(yōu)選3至6個碳，其中附加地環(huán)烷基基團可任選地被取代。優(yōu)選的環(huán)烷基基團不加限制地包括，環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊烯基、環(huán)己基、環(huán)己烯基、環(huán)庚基和環(huán)辛基。

術(shù)語“雜芳基”是指芳香的5-8元單環(huán)的、8-12元二環(huán)的、或11-14元三環(huán)核系統(tǒng)(memberedtricyclicringsystem)，其如果是單環(huán)的具有1-3個雜原子，如果是二環(huán)的具有1-6個雜原子，或如果是三環(huán)的具有1-9個雜原子，所述的雜原子選自o、n、或s(例如,碳原子和如果是單環(huán)的、二環(huán)的、或三環(huán)的分別為1-3、1-6、或1-9個雜原子的n、o、或s),其中每個環(huán)的0、1、2、3或4個原子可由取代基取代。雜芳基基團的實例包括吡啶基、呋喃基或furanyl、咪唑基、苯并咪唑基、嘧啶基、苯硫基或噻吩基、喹啉基、吲哚基、噻唑基等。術(shù)語“雜芳基烷基”或術(shù)語“雜芳烷基”是指用雜芳基取代的烷基。術(shù)語“雜芳基烷氧基”是指用雜芳基取代的烷氧基。

術(shù)語“雜環(huán)基”是指非芳香性的5-8元單環(huán)的、8-12元二環(huán)的、或11-14元三環(huán)核系統(tǒng)，其如果是單環(huán)的具有1-3個雜原子，如果是二環(huán)的具有1-6個雜原子，或如果是三環(huán)的具有1-9個雜原子，所述的雜原子選自o、n、或s(例如,碳原子和如果是單環(huán)的、二環(huán)的、或三環(huán)的分別為1-3、1-6、或1-9個雜原子的n、o、或s),其中每個環(huán)的0、1、2或3個原子可被取代基取代。雜環(huán)基團的實例包括哌嗪基、吡咯烷基、二噁烷基、嗎啉基、四氫呋喃基等。

術(shù)語“取代基”是指在烷基、環(huán)烷基、芳基、雜環(huán)、或雜芳基基團上的該基團的任何原子進行“取代”的基團。合適的取代基沒有限制地包括鹵素、羥基、巰基、氧代、硝基、鹵烷基、烷基、烷芳基、芳基、芳代脂烷基、烷氧基、硫烷氧基、芳氧基、氨基、烷氧羰基、酰胺基、羧基、鏈烷磺?；⑼榛驶颓杌鶊F。

特別地，本發(fā)明涉及以下各項：

1.通式(i)的多肽，

其中；

每個r1和r2獨立地是h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜芳基烷基、或雜環(huán)基烷基；

r3是烷基、烯基、炔基；[r4-k-r4]n；其每個用0-6個r5取代；

r4是烷基、烯基、或炔基；

r5是鹵素、烷基、or6、n(r6)2、sr6、sor6、so2r6、co2r6、r6、熒光部分、或放射性同位素；

k是o、s、so、so2、co、co2、conr6、或

r6是h、烷基、或治療劑；

n是1-4的整數(shù)；

x是2-10的整數(shù)；

每個y獨立地是0-100的整數(shù)；

z是1-10的整數(shù)；以及

每個xaa獨立地是氨基酸；

其中該多肽在含水溶液中具有基本的α螺旋二級結(jié)構(gòu)。

2.第1項的多肽，其中該多肽結(jié)合bcl-2家族多肽。

3.第1項的多肽，其中該多肽結(jié)合抗-細胞凋亡多肽。

4.第1項的多肽，其中該多肽結(jié)合bh1、bh2或bh3結(jié)構(gòu)域。

5.第1項的多肽，其中該多肽活化線粒體的細胞死亡。

6.第1項的多肽，其中該多肽活化細胞死亡。

7.第1項的多肽，其中該多肽抑制細胞死亡。

8.第1項的多肽，其中該多肽包括bh3結(jié)構(gòu)域。

9.第1項的多肽，其中x是2、3、或6。

10.第1項的多肽，其中每個y獨立地是3和15之間的整數(shù)。

11.第1項的多肽，其中r1和r2各自獨立地是h或c1-c6烷基。

12.第1項的多肽，其中r1和r2各自獨立地是c1-c3烷基。

13.第11項的多肽，其中r1和r2中的至少一個是甲基。

14.第12項的多肽，其中r1和r2是甲基。

15.第1項的多肽，其中r3是烷基。

16.第14項的多肽，其中x是3。

17.第15項的多肽，其中r3是c8烷基。

18.第14項的多肽，其中x是6。

19.第17項的多肽，其中r3是c11烷基。

20.第1項的多肽，其中r3是烯基。

21.第18項的多肽，其中x是3。

22.第20項的多肽，其中r3是c8烯基。

23.第19項的多肽，其中x是6。

24.第19項的多肽，其中r3是c11烯基。

25.第1項的多肽，其中r3是直鏈烷基、烯基、或炔基。

26.第1項的多肽，其中r3是[r4-k-r4]；以及r4是直鏈烷基、烯基、或炔基。

27.第1項的多肽，該多肽包括與seqidno:1的氨基酸序列至少大約60％同一性的氨基酸序列。

28.第15項的多肽，其中r3是烷基或烯基。

29.第15項的多肽，其中r1或r2中的至少一個是烷基。

30.第11項的多肽，其中每個r1和r2獨立地是h或c1-c3烷基。

31.第1項的多肽，其中r1和r2是甲基。

32.第1項的多肽，其中x是3或7以及z是0。

33.第1項的多肽，其中r3是c8或c11烷基或烯基。

34.第1項的多肽，該多肽包括與seqidno:2的氨基酸序列至少大約80％同一性的氨基酸序列。

35.第1項的多肽，其中該多肽轉(zhuǎn)運通過細胞膜。

36.第1項的多肽，其中該多肽主動轉(zhuǎn)運通過細胞膜。

37.第1項的多肽，進一步包括熒光部分或放射性同位素。

38.第1項的多肽，其中該多肽包括23個氨基酸；

r1和r2是甲基；

r3是c8烷基、c11烷基、c8烯基或c11烯基；以及

x是2、3或6。

39.第1項的多肽，進一步包括親和標記。

40.第1項的多肽，進一步包括靶部分。

41.第1項的多肽，進一步包括生物素部分。

42.第1項的多肽，其中該多肽是選自圖5所示多肽的多肽。

43.制備通式(iii)的多肽的方法，包括

提供通式(ii)的多肽；以及

用催化劑處理通式(ii)的化合物以促進環(huán)閉合置換作用，由此提供通式(iii)的化合物

其中

每個r1和r2獨立地是h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基；雜芳基烷基；或雜環(huán)基烷基；

每個n獨立地是1-15的整數(shù)；

x是2、3或6

每個y獨立地是0-100的整數(shù)；

z是1-3的整數(shù)；以及

每個xaa獨立地是氨基酸；以及

其中該多肽在含水溶液中包括α螺旋結(jié)構(gòu)。

44.第43項的方法，其中該多肽結(jié)合bcl-2家族成員多肽。

45.第43項的方法，其中該催化劑是釕催化劑。

46.第43項的方法，進一步包括在環(huán)閉合置換作用之后提供還原劑或氧化劑。

47.第46項的方法，其中該還原劑是h2或氧化劑是四氧化鋨

48.治療受試體的方法，包括將第1項的化合物施用于該受試體。

49.第48項的方法，進一步包括施用附加的治療劑。

50.在受試體中治療癌癥的方法，包括將第1項的化合物施用于該受試體。

51.第45項的方法，進一步包括施用附加的治療劑。

52.第1項，通式(i)的化合物的文庫。

53.鑒定用于促進細胞凋亡的候選化合物的方法，包括；

提供線粒體；

使該線粒體與第1項的化合物接觸；

測量細胞色素c釋放；以及

與缺少第1項的化合物時的細胞色素c釋放比較在存在第1項的化合物時的細胞色素c釋放，其中在存在第1項的化合物時細胞色素c釋放增加則鑒定該第1項的化合物為用于促進細胞凋亡的候選化合物。

54.通式(iv)的多肽，

其中；

每個r1和r2獨立地是h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基，雜芳基烷基，或雜環(huán)基烷基；

r3是烷基、烯基、炔基；[r4-k-r4]n或天然存在的氨基酸側(cè)鏈；其中每個用0-6個r5取代；

r4是烷基、炔基或炔基；；

r5是鹵素、烷基、or6、n(r6)2、sr6、sor6、so2r6、co2r6、r6、熒光部分或放射性同位素；

k是o、s、so、so2、co、co2、conr6、或

r6是h、烷基、或治療劑；

r7是烷基、烯基、炔基；[r4-k-r4]n或天然存在的氨基酸側(cè)鏈；其中每個用0-6個r5取代；

n是1-4的整數(shù)；

x是2-10的整數(shù)；

每個y獨立地是0-100的整數(shù)；

z是1-3的整數(shù)；以及

每個xaa獨立地是氨基酸；以及

其中該多肽在含水溶液中具有基本的α螺旋二級結(jié)構(gòu)。

55.通式(i)的多肽，

其中；

每個r1和r2獨立地是h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基，雜芳基烷基，或雜環(huán)基烷基；

r3是烷基、烯基、炔基；[r4-k-r4]n；其中每個用0-6個r5取代；

r4是烷基、炔基或炔基；；

r5是鹵素、烷基、or6、n(r6)2、sr6、sor6、so2r6、co2r6、r6、熒光部分或放射性同位素；

k是o、s、so、so2、co、co2、conr6、或

r6是h、烷基、或治療劑；

n是1-4的整數(shù)；

x是2-10的整數(shù)；

每個y獨立地是0-100的整數(shù)；

z是1-3的整數(shù)；以及

每個xaa獨立地是氨基酸；

其中通過圓二色光譜測定該多肽在含水溶液中具有至少5％的α螺旋。

56.第5項的多肽，其中通過圓二色光譜測定該多肽具有至少35％的α螺旋度。

57.第5項的多肽，其中通過圓二色光譜測定該多肽具有至少50％的α螺旋度。

58.第5項的多肽，其中通過圓二色光譜測定該多肽具有至少60％的α螺旋度。

59.第5項的多肽，其中通過圓二色光譜測定該多肽具有至少70％的α螺旋度。

60.第5項的多肽，其中通過圓二色光譜測定該多肽具有至少80％的α螺旋度。

61.第5項的多肽，其中通過圓二色光譜測定該多肽具有至少90％的α螺旋度。

62.通式(i)的多肽,

其中；

每個r1和r2獨立地是h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基，雜芳基烷基，或雜環(huán)基烷基；

r3是烷基、烯基、炔基；[r4-k-r4]n；其中每個用0-6個r5取代；

r4是烷基、炔基或炔基；；

r5是鹵素、烷基、or6、n(r6)2、sr6、sor6、so2r6、co2r6、r6、熒光部分或放射性同位素；

k是o、s、so、so2、co、co2、conr6、或

r6是h、烷基、或治療劑；

n是1-4的整數(shù)；

x是2-10的整數(shù)；

每個y獨立地是0-100的整數(shù)；

z是1-3的整數(shù)；以及

每個xaa獨立地是氨基酸；

其中通過圓二色光譜測定該多肽與通式(iv)的多肽相比具有至少1.25倍的α螺旋度增加

其中r1、r2、xaa、x、y、和z都如對于上述通式(i)所定義的。

63.第62項,通式(i)的多肽，其中通過圓二色光譜測定該多肽與通式(iv)的多肽相比具有至少1.5倍的α螺旋度增加。

64.第62項,通式(i)的多肽，其中通過圓二色光譜測定該多肽與通式(iv)的多肽相比具有至少1.75倍的α螺旋度增加。

65.第62項,通式(i)的多肽，其中通過圓二色光譜測定該多肽與通式(iv)的多肽相比具有至少2.0倍的α螺旋度增加。

66.第62項,通式(i)的多肽，其中通過圓二色光譜測定該多肽與通式(iv)的多肽相比具有至少2.5倍的α螺旋度增加。

67.第62項,通式(i)的多肽，其中通過圓二色光譜測定該多肽與通式(iv)的多肽相比具有至少3倍的α螺旋度增加。

68.第62項,通式(i)的多肽，其中通過圓二色光譜測定該多肽與通式(iv)的多肽相比具有至少4倍的α螺旋度增加。

69.鑒定用于抑制細胞凋亡的候選化合物的方法，包括；

提供線粒體；

使該線粒體與第1項的化合物接觸；

測量細胞色素c釋放；以及

與缺少第1項的化合物時的細胞色素c釋放比較在存在第1項的化合物時的細胞色素c釋放，其中在存在第1項的化合物時細胞色素c釋放降低則鑒定該第1項的化合物為用于抑制細胞凋亡的候選化合物。

本發(fā)明的一個或多個實施方案的詳述在下文的附圖和說明中闡述。本發(fā)明的其他特征、目的和優(yōu)點將由說明書和附圖以及權(quán)利要求所表現(xiàn)。

附圖簡述

圖1描繪了具有一個或多個保守的bcl-2同源(bh)結(jié)構(gòu)域的bcl-2家族成員。

圖2描繪了bid-介導(dǎo)的線粒體細胞凋亡的模型。tnf-ri/fas誘導(dǎo)移位至線粒體并觸發(fā)細胞凋亡的bid切割。

圖3描繪了用于生成包含烯鍵側(cè)鏈的手性α,α-二取代的非天然氨基酸的合成策略。

圖4a描繪了某些非天然氨基酸的化學結(jié)構(gòu)。

圖4b描繪了通過鏈烯置換合成氨基酸在i和i+4以及i+7位的交聯(lián)。

圖5a描繪了通過非天然氨基酸的取代和鏈烯置換產(chǎn)生的sahb3化合物(分別為seqidnos84-108)。

圖5b描繪了用于在此所描述的研究的某些交聯(lián)的肽(分別為seqidnos109-114)。

圖6描繪的研究結(jié)果顯示所選擇的bcl-2家族成員的bh3結(jié)構(gòu)域α-螺旋的程度。

圖7描繪的研究結(jié)果顯示與未改變的bidbh3肽相比，化學交聯(lián)增強sahb3bid化合物的α螺旋。

圖8描繪的研究結(jié)果顯示sahb3bida多肽的gly→glu突變體與包含相應(yīng)gly的多肽顯示相似的螺旋接觸。

圖9描繪的研究結(jié)果顯示23-mersabh3bidb(“sahb3b”)至16-mer的截短導(dǎo)致α-螺旋的損失。

圖10a描繪的研究結(jié)果顯示體外胰蛋白酶蛋白水解的動力學被sabh3bida交聯(lián)延遲3.5-倍。

圖10b描繪了肽的自體內(nèi)(exvivo)血清穩(wěn)定性研究的結(jié)果，證明與未改變的肽相比交聯(lián)肽的半衰期增加10倍。

圖10c描繪的體內(nèi)試驗結(jié)果顯示與bidbh3肽相比sahb3bida隨時間維持更高的血清濃度。

圖11a描繪的研究結(jié)果顯示sahb3bid肽在熒光偏振競爭結(jié)合分析中顯示以高親合力結(jié)合gst-bcl2。

圖11b描繪的研究結(jié)果顯示sahb3bida和b的陰性對照gly至glu的點突變是相對弱的結(jié)合物。

圖11c描繪的研究結(jié)果顯示sahb3bidb從23-mer至16-mer的截短導(dǎo)致ki降低大于6倍，與截短化合物的螺旋百分比顯著降低相一致。

圖11d描繪了bcl-2熒光偏振直接結(jié)合分析的結(jié)果，證明sahb3bida與未改變的bidbh3相比結(jié)合親和力增強大于6倍。

圖11e描繪了bax熒光偏振直接結(jié)合分析的結(jié)果證明交聯(lián)的摻入導(dǎo)致sahb3bida和sahb3bid(g→e)a與多結(jié)構(gòu)域促-細胞凋亡bcl-2家族成員的可測量結(jié)合。未改變的bidbh3肽顯示沒有結(jié)合。

圖11f描繪了證明sahb3bida結(jié)合時¹⁵n-標記的bcl-xl中構(gòu)象變化的hsqc光譜,這與bidbh3結(jié)合時所觀察到的相似，證實sahb3bida結(jié)合bcl-xl的限定的疏水袋。

圖12a和12b描繪的研究結(jié)果顯示了從純化的小鼠肝線粒體通過sahb3bid化合物釋放細胞色素c的百分比。

圖13a和13b描繪的研究結(jié)果顯示sahb3bida-和sahb3bidb-誘導(dǎo)的細胞色素釋放比未改變的肽更快和更有效。

圖14描繪的研究結(jié)果顯示sahb3bida的gly至glu突變體有選擇地消除bak-依賴的細胞色素釋放，強調(diào)了圖13中所示的sahb3bida-誘導(dǎo)細胞色素c釋放作用的特異性。

圖15描繪的研究結(jié)果顯示jurkatt-細胞白血病細胞在暴露于fitc-bidbh3和fitc-bid螺旋6時，缺乏熒光標記，而jurkatt-細胞白血病細胞在暴露于fitc-sahb3bid時指示陽性fitc信號，并且這些結(jié)果不受到細胞胰蛋白酶處理的顯著改變。

圖16a描繪的研究結(jié)果顯示暴露于交聯(lián)肽fitc-sahb3bida和sahb3bid(g→e)a的jurkatt-細胞指示熒光標記，而暴露于未改變的bh3肽fitc-bid和fitc-bid(g→s)的jurkatt-細胞沒有指示。

圖16b描繪的研究結(jié)果顯示如facs分析所評估的，fitc-sahb3bida的細胞輸入在37℃是時間依賴的。

圖17a和17b描繪了顯示用fitc肽在4℃和37℃處理的jurkatt-細胞的研究結(jié)果。圖17a顯示fitc-bidbh3不在任何溫度標記細胞，而fitc-sahb3bida在37℃而非4℃標記細胞。圖17b顯示fitc-bid螺旋6以不依賴溫度的方式標記并且也透化細胞。然而相比之下，fitc-sahb3bida只在37℃標記細胞并且沒有細胞透化，這與通過胞吞途徑的sahb3bida的主動轉(zhuǎn)運相一致。

圖17c描繪的研究結(jié)果顯示當用fitc-肽處理后，在有或沒有疊氮化鈉和2-脫氧葡萄糖預(yù)培養(yǎng)時，jurkatt-細胞顯示在fitc-bidbh3多肽的任何狀況下沒有標記。在疊氮化鈉和2-脫氧葡萄糖條件下該細胞對于fitc-sahb3bida顯示標記減少,并且在兩個條件下使用fitc-bid螺旋6都顯示有標記。這些結(jié)果與對sahb3bid轉(zhuǎn)運的atp-依賴的細胞攝取相一致(例如，胞吞途徑)。

圖18描繪的研究結(jié)果顯示fitc-sahb3bida攝取不受到氨基多糖肝素細胞處理的抑制，表明了fitc-sahb3bida與其他的細胞穿透肽(cpps)，例如hivtat和antennapedia(控制觸角基因)肽相比其結(jié)合和攝取機制之間的區(qū)別。

圖19描繪的研究結(jié)果顯示fitc-sahb3bida化合物顯示了jurkatt-細胞中囊泡狀分布的細胞質(zhì)標記，而質(zhì)膜熒光不明顯。另一方面，fitc-bidbh3顯示沒有細胞的細胞標記并且fitc-bid螺旋6廣泛地標記細胞并導(dǎo)致顯著的結(jié)構(gòu)破壞。

圖20描繪了顯示jurkatt-細胞中fitc-sahb3bida與線粒體膜標記的共標記的研究結(jié)果。

圖21a和圖21b描繪的研究結(jié)果顯示fitc-sahb3bida在具有葡聚糖標記的內(nèi)涵體而不是轉(zhuǎn)移標記的內(nèi)涵體的bcl-2過表達的活的jurkatt-細胞中共標記，表明fitc-sahb3bida通過液相胞飲作用被運入細胞。

圖21c描繪的研究結(jié)果顯示處理后24小時，fitc-sahb3bida在具有由mitotracker標記的線粒體的活細胞中共標記。

圖22a、22b和22c描繪的研究結(jié)果顯示sahb3bida在測試的白血病細胞系中以劑量應(yīng)答的方式觸發(fā)代謝停滯，而bidbh3和sahb3bid(g→e)a在這個劑量范圍中基本上無效。

圖23描繪的研究結(jié)果顯示sahb3bida和sahb3bidb在10μm誘導(dǎo)達到50％的完整jurkat-細胞的細胞凋亡，該效應(yīng)受到bcl-2過表達的特異抑制(黑條)。根據(jù)與非處理對照的比較，未改變的bidbh3肽和gly至glu的突變體沒有影響。

圖24描繪了顯示用sahb3bida、sahb3bid(g→e)和sahb3bid(g→s)a處理的jurkatbcl-2過表達細胞的劑量應(yīng)答的研究結(jié)果。盡管sahb3bida和sahb3bid(g→s)a可在這個劑量范圍內(nèi)克服細胞凋亡的bcl-2抑制，但gly至glu的點突變沒有影響。

圖25描繪的研究結(jié)果顯示sahb3bida處理的白血病細胞系reh、mv4；11和semk2經(jīng)歷特異的細胞凋亡誘導(dǎo)，而gly至glu的點突變sahb3bid(g→e)a對細胞沒有影響。

圖26a和26b描繪的研究結(jié)果顯示sahb3bida和sahb3bid(g→s)a抑制nod-scid小鼠中semk2白血病的生長，證明sahb3bid(g→s)a比sahb3bida更為有效。

圖27a和fig.27b描繪的研究結(jié)果顯示sahb3bida相對于載體鈍化了nod-scid小鼠中semk2白血病的進展。圖27a中注明了劑量反應(yīng)效果。

圖27c、27d、27e描繪的研究結(jié)果顯示sahb3bida相對于載體抑制scidbeige小鼠中rs4；11白血病的生長，與載體對照象比在sahb3bida-處理的小鼠中，具有統(tǒng)計上顯著的存活延長。

圖27f描繪的動物研究結(jié)果再次顯示與被證明白血病有進展的sahb3bid(g→e)a-和載體-處理的小鼠相比，sahb3bida導(dǎo)致scidbeige小鼠中rs4；11白血病的退化。

圖28a-28h描繪了受交聯(lián)作用的bcl-2家族成員蛋白質(zhì)的多種α螺旋結(jié)構(gòu)域(分別為seqidnos1-83)的實施例。

發(fā)明詳述

本發(fā)明部分基于bcl-2家族蛋白質(zhì)的交聯(lián)α螺旋結(jié)構(gòu)域多肽相對于他們的未交聯(lián)配對物(例如,增加的疏水性、對蛋白水解切割的耐受性、結(jié)合親合力、體外和體內(nèi)生物活性)具有改善的藥理學性質(zhì)的發(fā)現(xiàn)。此外，已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)交聯(lián)的多肽可通過溫度-和能量-依賴的運輸機制(例如,胞吞作用、特異的液相胞飲作用)穿透細胞膜。該多肽包括兩個非天然氨基酸之間的栓鏈，其中該栓鏈顯著增強該多肽的α螺旋二級結(jié)構(gòu)。一般地，該栓鏈延伸跨越一個或兩個螺旋回轉(zhuǎn)(turn)的長度(即,大約3.4或大約7個氨基酸)。因此，位于i和i+3；i和i+4；或i和i+7的氨基酸是用于化學修飾和交聯(lián)的理想候選物。因此，例如，當肽具有序列…xaa1,xaa2,xaa3,xaa4,xaa5,xaa6,xaa7,xaa8,xaa9…，在xaa1和xaa4之間，或xaa1和xaa5之間，或xaa1和xaa8之間的交聯(lián)與xaa2和xaa5之間，或xaa2和xaa6之間，或xaa2和xaa9之間等的交聯(lián)一樣有用。此外，通過整合兩組交聯(lián)，一組位于xaa1和xaa5之間而另一組位于xaa9和xaa13之間來制備模型多肽。通過雙鍵置換反應(yīng)的精細立體化學控制獲得雙交聯(lián)。因此，本發(fā)明包括在多肽序列內(nèi)整合一個以上交聯(lián)以進一步穩(wěn)定該序列或促進較長多肽伸展的穩(wěn)定化。如果該多肽太長而不能容易地合而為一(inonepart)，可通過稱為天然化學綁扎的技術(shù)使獨立合成的交聯(lián)肽連接在一起。(bang,etal.,j.am.chemsoc.126:1377).

該新的交聯(lián)多肽可用于例如模擬或研究具有一個或多個α-螺旋結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)或多肽。其中家族成員具有至少一個α螺旋結(jié)構(gòu)域的一個家族蛋白質(zhì)是bcl-2家族的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)涉及細胞凋亡途徑。一些bcl-2家族成員具有促-細胞凋亡功能，其它的具有抗-細胞凋亡功能，另外一些隨細胞狀況變化而變化功能。因此，需要制備模擬bcl-2家族成員的一個或多個基序的穩(wěn)定多肽來調(diào)節(jié)各種bcl-2相關(guān)活性。

sahb3bid化合物系列的化學合成

根據(jù)圖3中的圖解合成包含不同長度烯族側(cè)鏈的α,α-二取代的非天然氨基酸(williamsetal.，1991j.am.chem.soc.113:9276；schafmeisteretal.，2000j.am.chemsoc.122:5891)。通過用相應(yīng)合成的氨基酸替換兩個或四個天然存在的氨基酸設(shè)計化學交聯(lián)的bidbh3肽(圖4a)。在離散的位置，即“i，和i+4位”或“i，和i+7位”進行取代作用，其通過將活性殘基置于α-螺旋的相同平面上來促進交聯(lián)化學(圖4b)。細胞凋亡蛋白質(zhì)中高度保守的氨基酸，除根據(jù)x-射線結(jié)晶學和nmr研究發(fā)現(xiàn)在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中重要的那些序列外，(muchmoreetal.，1996nature381:335；sattleretal.，1997science275:983),在某些環(huán)境中沒有被特異替換，保守的氨基酸可被其他氨基酸(例如,合成的非天然存在的氨基酸)替代以增強活性(這個效應(yīng)可在在此所描述的sahb3bid突變體中觀察到)。通過固相肽合成，然后是合成氨基酸通過其含有鏈烯的側(cè)鏈的基于鏈烯置換的交聯(lián)來產(chǎn)生sahb3bid化合物。圖5a中說明了產(chǎn)生的sahb3bid化合物的變化。也構(gòu)建整合入已知改變bid功能的特異突變(wangetal.1996genesdev.10:2859)的sahb3bid(sahba)變體以用作生物學實驗中的陰性對照(圖5a)。進一步用異硫氰酸熒光素(fitc)或生物素共軛的-賴氨酸衍生化所選擇化合物的氨基末端以產(chǎn)生標記的sahb3bid化合物分別用于細胞透性研究和生化分析(圖5a)。在幾個合成中，將c-末端色氨酸加入序列用作純化和濃度測定目的的uv標記；幾個肽中的n-末端谷氨酸被消除以增加該化合物可能促進細胞穿透的總pi(參見下文)。容易地將該置換方法應(yīng)用于產(chǎn)生備選的sahb3s，包括sahb3bad和sahb3bim(圖5a)。

非天然氨基酸(5-碳烯族氨基酸的r和s對映異構(gòu)體和8-碳烯族氨基酸的s對映異構(gòu)體)通過核磁共振(nmr)光譜學(varianmercury400)和質(zhì)譜分析法(micromasslct)表征。人工地或在自動肽合成儀上(appliedbiosystems,模型433a)，利用固相條件，rink酰胺am樹脂(novabiochem)，和fmoc主鏈保護基團化學進行肽合成。對于天然fmoc-保護的氨基酸(novabiochem)的偶聯(lián)，使用10等量的氨基酸和1:1:2摩爾比的偶聯(lián)反應(yīng)物hbtu/hobt(novabiochem)/diea。非天然的氨基酸(4當量)與1:1:2摩爾比的hatu(appliedbiosystems)/hobt/diea偶聯(lián)。在固相中利用溶于脫氣二氯甲烷的10mmgrubbs催化劑(blackewelletal.1994上文)(stremchemicals)并在室溫下反應(yīng)2小時來進行鏈烯置換。進一步用b-丙氨酸和異硫氰酸熒光素(fitc[sigma]/dmf/diea)衍生化所選擇化合物的氨基末端以產(chǎn)生熒光標記化合物。摻入c-末端色氨酸作為用于純化和濃度測定目的的uv標簽；也合成沒有c-末端色氨酸和n-末端谷氨酸的sahba化合物，進行后者的修飾以增加該分子的總pi。通過三氟乙酸-介導(dǎo)的去保護和切割、乙醚沉淀產(chǎn)生粗制品，以及反相c18柱(varian)上的高效液相色譜法(hplc)(varianprostar)以產(chǎn)生純化合物來獲得置換化合物的分離。通過lc/ms質(zhì)譜分析法(與agilent1100hplc系統(tǒng)對接的micromasslct)和氨基酸分析(appliedbiosystems,模型420a)確認純產(chǎn)品的化學組成。

圖5b大略地描繪了圖5a中的肽的子集，包括烯族氨基酸的立體化學(5-碳烯族氨基酸的r和s對映異構(gòu)體和8-碳烯族氨基酸的s對映異構(gòu)體)。

sahb3bid化合物顯示增強的α-螺旋

我們研究了促-細胞凋亡bh3結(jié)構(gòu)域的螺旋百分比，并且發(fā)現(xiàn)這些未改變的肽在溶液中顯著地是隨機盤繞的，其α-螺旋含量全部在25％下(圖6)。簡要地，化合物溶于含水的50mm磷酸鉀溶液ph7至濃度為25-50mm。在jascoj-710分光偏振儀上于20℃，利用下列標準測量參數(shù)獲得圓二色性譜∶波長,190-260nm；分級分辨率,0.5nm；速度,20nm/sec；累加,10；反應(yīng),1秒；帶寬,1nm；徑長,0.1cm。通過將模型螺旋十肽的平均剩余橢圓率222obs除以所報道的計算每個肽的α-螺旋含量(yangetal.1986methodsenzymol.130:208))。

在所有情況下，化學交聯(lián)增加了bid’sbh3結(jié)構(gòu)域的α-螺旋百分比，其中sahb3bida和b獲得大于5-倍的增強(圖7)。sahb3bid(g→e)a,sahb3bida的陰性對照gly至glu點突變體，顯示與sahb3bida相似的螺旋含量(圖8)。因此，全部的-烴交聯(lián)可將在含水溶液中基本上隨機卷曲的細胞凋亡肽轉(zhuǎn)換成結(jié)構(gòu)為顯著α-螺旋的肽。令人感興趣的是，通過當sahb3bidb23-mer被截短為16-mer，sahb3bid(tr)b時觀察到的螺旋減少強調(diào)了第四個螺旋回轉(zhuǎn)在穩(wěn)定bidbh3肽中的重要性(圖9)。

全部的-烴交聯(lián)增加sahb3bid化合物的蛋白酶耐受性

肽骨架的酰胺鍵對蛋白酶水解敏感，由此使得肽化合物易受體內(nèi)快速降解損傷。然而肽螺旋形成隱藏酰胺骨架并因此保護其免于蛋白水解切割。sahb3bida經(jīng)受體外胰蛋白酶蛋白水解以評估與未改變的bidbh3肽相比任何降解速率的變化。用胰蛋白酶瓊脂糖孵育sahb3bida和未改變的肽，通過離心作用在不同時間點猝滅反應(yīng)，隨后進行hplc注射通過在280nm處的紫外線吸收測定剩余的底物。簡要地，用胰蛋白酶瓊脂糖(pierce)(s/e～125)孵育bidbh3和sahb3bida化合物(5mcg)0、10、20、90和180分鐘。通過以高速桌面離心作用猝滅反應(yīng)；通過基于hplc的220nm處峰值檢測定量分離上清液中的剩余底物。蛋白水解反應(yīng)顯示了根據(jù)ln[s]對時間作圖(k＝-1×斜率)測定的一級動力學和速率常量,k(圖10a)。該實驗一式三份地進行，證明與未改變的肽相比sahb3bida的胰蛋白酶耐受性增強3.5-倍。因此，通過將其隱藏在α-螺旋的核心胰蛋白酶-敏感的酰胺鍵的增強保護提供了更穩(wěn)定的肽化合物，并且因此可使得這種化合物在血清中特別穩(wěn)定。

對于自體內(nèi)血清穩(wěn)定性研究，用新鮮的小鼠血清(20ml)在37℃孵育fitc-共軛的肽bidbh3和sahb3bida(2.5mcg)0、1、2、4、8和24小時。通過在液氮中快速冷凍血清樣品、凍干、在含有0.1％三氟乙酸的50:50乙腈/水中萃取，然后是利用設(shè)置在495/530nm處的激發(fā)/發(fā)射熒光檢測的基于hplc的定量來確定完整fitc-化合物的水平。這個分析的結(jié)果顯示在圖10b中。

為了研究sahb3bida的體內(nèi)穩(wěn)定性，將10mg/kgfitc-共軛的bidbh3肽和sahb3bida注射到nod-scid小鼠中，并且在注射后0、1、4和22小時采取血液樣本。然后測量25μl新鮮血清中完整fitc-化合物的水平。這個分析的結(jié)果描繪在圖10c中，顯示經(jīng)過22小時時段sahb3bida可容易地被檢測出來，其在22小時仍具有13％的可測量度。相比之下，注射后一個小時只可檢測出12％的bidbh3。

sahb3bid化合物保持高親合力的抗-細胞凋亡結(jié)合

全部的烴交聯(lián)被有選擇地置于bidbh3兩親螺旋的電荷平面以免干擾多結(jié)構(gòu)域細胞凋亡蛋白質(zhì)的結(jié)合袋和bidbh3螺旋疏水殘基之間的決定性的相互作用。進行熒光偏振競爭結(jié)合實驗以評估sahb3bid化合物在與fitc-標記的未改變bidbh3肽競爭結(jié)合gst-bcl-2中的效力。全部的sahb3bid化合物證明高親合力結(jié)合gst-bcl2，sahb3bida和b兩個化合物具有最大的螺旋百分比，同樣顯示最高的親合力結(jié)合(圖11a)。值得注意的，sahb3bida和b的gly至glu突變體正如同從上述研究所預(yù)測的消除了高親合力結(jié)合(圖11b)。我們另外測定sahb3bida的gly至ser突變體在這個分析中消除了bcl-2結(jié)合(資料未顯示)。23-mersahb3bidb至16-mer的截短導(dǎo)致bcl-2結(jié)合親合力的損失，這與如上所述α-螺旋的減少相符合(圖11c)。

fitc-標記的bidbh3肽以220nm的kd結(jié)合bcl-2，并且一旦結(jié)合，以838nm的ic50發(fā)生經(jīng)未標記bidbh3的這種相互作用的易位。這支持了其中bh3結(jié)合bcl-2觸發(fā)總的構(gòu)象變化促成相互作用，導(dǎo)致需要過量的未標記肽來置換預(yù)結(jié)合的fitc-標記的bidbh3的模型。我們已經(jīng)進一步表明badbh3結(jié)構(gòu)域?qū)cl-2結(jié)合具有41nm的增強kd，而且它可以173nm的ic50置換預(yù)結(jié)合的fitc-bidbh3。在類似的實驗中，發(fā)現(xiàn)sahb3bida以62nm的ic50從bcl-2置換fitc-bidbh3，與未改變的bidbh3肽相比反映出易位效力有大于13-倍的增加。這些數(shù)據(jù)證實sahb3bida與未改變的bh3肽相比以增強的親合力結(jié)合bcl-2，并且表明通過化學交聯(lián)預(yù)組成的α-螺旋結(jié)構(gòu)為靶結(jié)合提供動力學益處。

通過熒光偏振的直接結(jié)合分析證明將交聯(lián)摻入bidbh3肽導(dǎo)致sahb3bida與未改變的bidbh3肽相比對bcl-2，抗-細胞凋亡多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)和bax，促-細胞凋亡多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的結(jié)合親合力都增強(圖11d和11e)。直接的bcl-2熒光偏振結(jié)合分析證明sahb3bida的bcl-2結(jié)合親合力(kd,38.8nm)與未改變的bidbh3肽(kd,269nm)相比增強6倍(圖11d)。gly至glu的突變體，sahba(g→e)(kd,483nm)消除了高親合力結(jié)合并且用作有用的對照(圖11d)。簡要地，使包含編碼c-末端缺失的gst-bcl-2的質(zhì)粒的大腸桿菌bl21(de3)培養(yǎng)在包含氨芐青霉素的luriabroth中并且用0.1mmiptg誘導(dǎo)。將細菌顆粒重懸浮在裂解緩沖液中(在pbs中的1mg/ml溶菌酶，1％tritonx-100,0.1mg/mlpmsf，2μg/ml抑蛋白酶肽(aprotinin)，2μg/ml抑蛋白酶醛肽(leupeptine)，1μg/ml抑胃肽(pepstatin)a)并且超聲處理。在20,000×g離心20min后，將上清液施加到谷胱甘肽-瓊脂糖珠的柱子上(sigma)。用pbs洗滌珠子并且用50mm谷胱甘肽，50mmtris-hcl(ph8.0)處理以洗提蛋白質(zhì)，然后對結(jié)合分析緩沖液(140mmnacl，50mmtris-hcl[ph7.4])透析。在結(jié)合緩沖液中在室溫下氟化熒光素的化合物(25nm)與gst-bcl2(25nm-1000nm)孵育。通過perkin-elmerls50b發(fā)光分光光度計上的熒光偏振測量結(jié)合活性。利用prism軟件(graphpad)通過非線性回歸分析確定kd值。如先前描述(suzukietal,cell,103:645)制備全長的bax蛋白質(zhì)并如上所述進行熒光偏振分析。

sahb3bida結(jié)合bcl-xl

為了確定sahb3bida是否特異地與抗細胞凋亡多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的限定結(jié)合溝槽相互作用，記錄sahb3bida加入前后¹⁵n-標記的bcl-xl的二維¹⁵n/¹h雜環(huán)單量子相關(guān)(hsqc)光譜并且與相應(yīng)的bidbh3/¹⁵n-bcl-xl光譜相比較。簡要地，使包含編碼c-末端缺失的bcl-xl的質(zhì)粒的大腸桿菌bl21(de3)培養(yǎng)在包含¹⁵nh4cl(cambridgeisotopelaboratories)m9-基本培養(yǎng)基中以相同地產(chǎn)生¹⁵n-標記的蛋白質(zhì)。從細菌分離重組蛋白質(zhì)。產(chǎn)生未標記的sahb3bida和bidbh3肽并且如上所述進行純化。在50mm磷酸鉀(ph7),50mm氯化鈉中制備0.1mm的下列1:1復(fù)合物，在d2o或h2o/d2o中的5％dmso(95:5):¹⁵n-bcl-xl/未標記的bidbh3,¹⁵n--xl/未標記的sahb3bida。對于兩個復(fù)合物記錄二維¹⁵n/¹h雜環(huán)單量子光譜并且分析配體結(jié)合共振中的變化。

hsqc光譜的總體相似度表明加入sahb3bida后bcl-xl中存在的結(jié)構(gòu)變化幾乎與bidbh3肽中所觀察到的相同(圖11f)。

sahb3bid化合物觸發(fā)快速和特異的線粒體細胞色素c釋放

為了評估sahb3bid化合物的體外生物活性，利用純化的小鼠肝線粒體進行細胞色素c釋放分析。使線粒體(0.5mg/ml)與1μm和100nm的sahb3bid化合物孵育40分鐘，然后分離上清液和線粒體部分并經(jīng)受細胞色素celisa分析。對于每個樣品從總釋放量減去背景的細胞色素c釋放(10-15％)，測定實際的細胞色素c釋放百分比(圖12)。對從bak-/-小鼠分離的小鼠肝線粒體同時進行相同的實驗，其應(yīng)答bid-bh3活化而不釋放線粒體細胞色素c；因此將來自bak-/-線粒體的數(shù)據(jù)用作應(yīng)答sahb3bid處理的bak-介導(dǎo)的細胞色素c釋放的陰性對照。在各個情況下，除雙交聯(lián)的sahb3bide(其可以缺乏對生物活性決定性的氨基酸或，在這種情況下，被二交聯(lián)過度束縛)外，與未改變的肽相比存在應(yīng)答1μmsahb3bid化合物的大約兩倍的細胞色素c釋放(圖12a)。在使用sahb3bida、b以及特別是d的這個劑量觀察到bak-非依賴的細胞色素c釋放。盡管這種細胞色素c釋放可表現(xiàn)為α-螺旋非特異性的膜擾動作用，sahb3bid-誘導(dǎo)的、細胞色素c釋放的bak-非依賴成分的作用值得進一步研究。有趣地，誘導(dǎo)最顯著水平的bak-非依賴的細胞色素c釋放的sahb3bid化合物，sahb3bidd，也是最疏水性的sahb3bid化合物；與以50-75％乙腈洗提的另外的sahb3bid化合物相比，從反相c18柱以95％/5％水洗提sahb3bidd。具有缺陷的bh3結(jié)構(gòu)域的bid突變體可促進bak-非依賴的細胞色素c轉(zhuǎn)移(scorranoetal,devcell,2:55)，并且高度疏水性的bid螺旋6已經(jīng)與這種活性相關(guān)(l.scorrano,s.j.korsmeyer,結(jié)果未公開)。似乎合理的是sahb3bidd顯示通過模擬bid螺旋3和6特征的bak依賴的和非依賴的細胞色素c釋放。低十倍劑量的sahb3bida和b保持選擇性的bak-依賴的細胞色素c釋放活性(圖12b)。sahb3bidb的效力，與最大限度活化的肉豆蔻?；腷id蛋白質(zhì)比較特別有利，后者在30nm的劑量在這些條件下釋放大約65％的細胞色素c。

大多數(shù)活化的sahb3bid化合物，a和b進一步受到動力學研究以確定螺旋預(yù)組成與未改變的肽相比可觸發(fā)更快速的細胞色素c釋放。類似于上述的實驗，使來自野生型和bak-/-小鼠的小鼠肝線粒體暴露于不同濃度的化合物并且在10和40分鐘間隔分析細胞色素c釋放。盡管在10分鐘未改變的肽在測試的最高劑量(1μm)導(dǎo)致小于10％的釋放，在這個時間點的僅僅400nm以下具有的ec50釋放為幾乎最大的1μm細胞色素釋放(圖13a)。同樣地，sahb3bida在10分鐘時間間隔觸發(fā)顯著的細胞色素c釋放。對于未改變的肽在40分鐘的細胞色素c釋放ec50是2.9μm，而對于sahb3bida和b分別是310和110nm(圖13b)。因此，sahb3bida和b在40分鐘時間點顯示10-25倍增強的細胞色素c釋放活性。盡管bak-依賴的細胞色素c釋放隨時間增加，bak-非依賴的釋放在10和40分鐘時間點之間不變化，表明這個明顯的釋放發(fā)生很早并且在10分鐘內(nèi)最大限度地獲得這個釋放。值得注意的，sahb3bida的陰性對照gly至glu點突變體，sahb3bid(g→e)a，只產(chǎn)生bak-非依賴的細胞色素c釋放，證實通過bak-依賴的線粒體細胞凋亡途徑的sahb3bida功能(圖14)?？傊?，這些細胞色素c釋放數(shù)據(jù)表明sahb3bida和b能夠特異地誘導(dǎo)bak-依賴的細胞色素c釋放，其與未改變的肽相比具有顯著增強的效力和動力學。

sahb3bid化合物穿透完整細胞

使熒光素-衍生化的sahb3bid化合物、bidbh3肽和bid螺旋6肽與培養(yǎng)4-24小時的jurkatt-細胞白血病細胞一起培養(yǎng)，并且隨后進行facs分揀來確定白血病細胞的標記百分比。為了避免由細胞-表面結(jié)合化合物引起的混淆，徹底洗滌jurkat-細胞并且根據(jù)最近的報道經(jīng)受胰蛋白酶過消化。對于測試的每個化合物，胰蛋白酶消化后在fitc信號圖譜中沒有顯著的變化，表明就這些肽來說，很少至沒有fitc-標記的化合物是表面結(jié)合的(圖15)。盡管bidbh3-處理的細胞是fitc-陰性的，如通過fitc信號的右傾(rightward)轉(zhuǎn)移所表明的，fitc-sahb3bida-和fitc-sahb3bid(g→e)a-處理的細胞是fitc-陽性的(圖16a)。這些細胞透性研究中fitc-sahb3bida和fitc-sahb3bid(g→e)a的相似圖譜是特別重要的，給出了點突變體化合物作為生物學實驗中陰性對照的用途。使用bid螺旋6，細胞可滲透和膜擾亂的肽在這些實驗中作為fitc-標記的陽性對照。

令人驚訝地，發(fā)現(xiàn)fitc-sahb3bida看來似乎通過胞吞作用，溫度-和能量-依賴的運輸途徑進入細胞。fitc-sahb3bida的細胞輸入以時間依賴的方式發(fā)生(圖16b)。當通過在4℃(圖17a，17b)或通過用能量毒物疊氮化鈉和2-脫氧葡萄糖(圖17c)處理進行實驗抑制細胞胞吞作用時，分別抑制細胞標記或顯著減弱細胞標記。值得注意的，通過fitc-sahb3bida在37℃標記的jurkat-細胞是碘化丙啶(pi)陰性的，證實交聯(lián)的肽不僅僅起透化試劑的作用(圖17b)；相比之下，fitc-bid螺旋6如pi陽性的程度所證明的在兩個溫度都容易有效地穿透透化細胞(圖17b)。這些數(shù)據(jù)支持sahb3bid化合物進入的內(nèi)吞機制，這與引證細胞表面粘附然后是胞吞作用來作為其他穿透細胞的肽(cpps)，例如hiv轉(zhuǎn)錄反式作用子(tat)機制的最近報道相符。盡管強堿性的cpps，例如tat和antennapedia，被認為通過粘附至帶負電荷的氨基多糖而集結(jié)在細胞表面，sahb3bida輸入沒有受到肝素的劑量-應(yīng)答方式的抑制(圖18)。sahb3bid兩親的α-螺旋的生物物理學性質(zhì)可通過靜電和/或類脂膜相互作用促進不同的細胞接觸。

為了確定sahb3bida的胞內(nèi)定位，使用共聚焦顯微術(shù)實驗。如上所述與fitc-標記的化合物一起培養(yǎng)jurkatt-細胞白血病細胞，或在4小時用血清替換，然后在37℃另外培養(yǎng)16小時，用pbs洗滌兩次后在超冷凍(superfrostplus)的正載玻片(fisher)上，以600rpm細胞旋轉(zhuǎn)5分鐘。然后將細胞固定在4％多聚甲醛中，用pbs洗滌，與to-pro-3碘化物(100nm)(molecularprobes)一起培養(yǎng)至復(fù)染核，用vectashield固定介質(zhì)(vector)處理，然后通過共聚焦顯微術(shù)成像(biorad1024)。對于雙標記實驗，與tom20的第一抗體一起另外培養(yǎng)固定細胞，并在topro-3復(fù)染前與若丹明-共軛的第二抗體培養(yǎng)。對于有生命的共聚焦顯微術(shù)，用fitc-sahba(10μm)和mitotracker(100nm，molecularprobes)，四甲基若丹明異硫氰酸鹽(tritc)-葡聚糖4.4kd或70kd(25mcg/ml，molecularprobes)，或alexafluor594-轉(zhuǎn)鐵蛋白(25mcg/ml，molecularprobes)進行jurkat-細胞的雙標記4小時(葡聚糖和轉(zhuǎn)鐵蛋白)或24小時(mitotracker)。由于光漂白的限制，使用過表達bcl-2的jurka細胞用于有生命的(live)共聚焦顯微術(shù)以使fitc成像最優(yōu)化。線粒體的fitc-sahba標記在bcl-2過表達的jurkats(符合sahb活性的機制)中是更明亮的，因此利用這些細胞捕獲圖像更為便利。洗滌處理的jurkats兩次，然后重懸在pbs中并且用biorad1024(bethisrael/deaconesscenterforadvancedmicroscopy)或zeisslsm510激光掃描共聚焦顯微鏡(children’shospitalbostonimagingcore)分析濕潤的固定制品。

在固定切片中，sahb3bida化合物定位于白血病細胞的細胞質(zhì)邊緣，沒有質(zhì)膜或表面熒光昭顯；熒光的囊泡狀圖案表明細胞器特異的定位(圖19a和19b)。與facs數(shù)據(jù)一致，用fitc-bidbh3處理的jurkat-細胞顯示沒有熒光標記(圖19c)。盡管fitc-sahb3bida-處理的細胞顯示選擇性的胞內(nèi)熒光并且維持它們的細胞結(jié)構(gòu)(圖19a)，fitc-bid螺旋6-處理的細胞被廣泛標記并且證明具有破裂的細胞形態(tài)(圖19d)。利用fitc-sahb3bida和線粒體膜蛋白質(zhì)tom20的抗體的共區(qū)域化研究證明sahb3bida熒光與線粒體，sahb3bid的分子靶物的預(yù)期位點廣泛重疊(圖20)。

sahb處理后4hr進行活細胞成像證明fitc-sahba與葡聚糖(4.4kd或70kd)-標記吞飲泡(圖21a)，而不是轉(zhuǎn)鐵蛋白-標記的吞飲泡(圖21b)的最初共區(qū)域化，這與通過液相胞飲作用(手稿參考27)的細胞攝取，對tat和antp肽(手稿參考28)所確定的內(nèi)吞途徑一致。在24hr時間點，胞內(nèi)的fitc-sahba顯示在活細胞中與mitotracker-標記的線粒體共區(qū)域化增加(圖21c)，這與在固定細胞中利用tom20抗體，線粒體外膜蛋白質(zhì)所觀察到的線粒體共區(qū)域化一致(圖20)?？傊?，facs數(shù)據(jù)和共聚焦成像證明全部的烴交聯(lián)使得sahb3bida化合物能夠通過完整細胞被輸入(例如，通過胞吞機制)。

sahb3bid化合物觸發(fā)b-、t-、和混合譜系白血病(mll)細胞的細胞凋亡

為了評估sahb3bid化合物是否可阻止培養(yǎng)中增殖的白血病細胞的生長，對培養(yǎng)中的t-細胞(jurkat)、b-細胞(reh)、和混合譜系白血病(mll)-細胞mv4；11、semk2、rs4；11)利用連續(xù)稀釋的sahb3bida進行3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)2,5-聯(lián)苯四唑溴化物,mtt分析。sahb3bida以2.2(jurkat)、10.2(reh)、4.7(mv4；11)、1.6(semk2)和2.7(rs4；11)μm的ic50s抑制白血病細胞(圖22a)。bidbh3肽和sahba(g→e)點突變體在這個劑量范圍中都不具有作用(圖22b,22c)。

為了評估這個代謝是否停滯表現(xiàn)細胞凋亡誘導(dǎo)，用10μmsahb3bida和b、sahb3bid(g→e)a和b以及未改變的bidbh3肽在無血清的培養(yǎng)基中處理jurkat白血病細胞4小時，然后在包含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時(即，最終的肽濃度為5μm),然后通過膜聯(lián)蛋白v-處理細胞的流式細胞計數(shù)檢測分析細胞凋亡。處理后20小時sahb3bida和b證明40-60％之間的膜聯(lián)蛋白v陽性，而未改變的肽和sahb3bid點突變體沒有影響(圖23a和23b)。使用具有載體反應(yīng)劑的未改變的bh3肽或具有非特異性線粒體擾動作用的工程化螺旋的比較研究需要200-300μm的劑量來活化細胞凋亡。隨后利用工程化的過表達bcl-2的jurkat-細胞的附加對照實驗來評估是否可通過過量的bcl-2減少sahb3bid-誘導(dǎo)的細胞凋亡，其表明該化合物在細胞內(nèi)通過線粒體細胞凋亡途徑特異地發(fā)揮作用。實際上，在bcl-2過表達細胞中消除了10μmsahb3bida和b對“野生型"jurkats的促細胞凋亡作用。然而這個保護作用可通過sahb3bida而不是sahb3bid(g→e)a的劑量提高而克服；此外，不顯示bcl-2結(jié)合親和力(參見上面)的sahb3bida的gly至ser點突變體(sahb3bid(g→s)a)，與“野生型”和bcl-2jurkat細胞中的促細胞凋亡是同樣有效的(圖24)。在具有相似結(jié)果的reh、mv4；11和semk2細胞系中另外進行利用sahb3bida和sahb3bid(g→e)a的細胞凋亡誘導(dǎo)分析(圖25)?？傊@些數(shù)據(jù)表明sahb3bid化合物可穿透和殺死增殖的白血病細胞?？赏ㄟ^sahb3bida的gly至glu突變體和過表達bcl-2的細胞有選擇地消除所觀察到的促細胞凋亡作用，該發(fā)現(xiàn)強調(diào)了sahb3bid化合物通過限定的線粒體細胞凋亡途徑起作用。

sahb3bida和sahb3bidg-->sa證明體內(nèi)的白血病抑制

使nod-scid小鼠經(jīng)受300cgy全身照射，然后是顯示穩(wěn)定熒光素酶表達的4×10⁶個semk2-m1白血病細胞的靜脈注射。利用腹腔內(nèi)注射d-熒光素后測定全身熒光的體內(nèi)成像系統(tǒng)(ivis,xenogen)每周監(jiān)測小鼠的白血病移植物移入。在第0天，對白血病的小鼠成像，然后在第1、2、3、5、6天用10mg/kg的sahb3bida、sahb3bidg-->sa靜脈內(nèi)處理或沒有注射。在第4和7天測量全身熒光。關(guān)于圖26a，與未處理的對照小鼠相比該小組中腫瘤負重的分析證明了經(jīng)sahb3bida和sahb3bid(g-->s)a的白血病抑制。關(guān)于圖26b，全身熒光成像與證明低水平和更局部化疾病的sahb3bida-處理的小鼠相比，證明了第7天未處理組中進一步發(fā)展的白血病(可在遍及骨骼系統(tǒng)中觀察到表現(xiàn)高水平白血病的紅色致密度)。有趣地，不能被bcl-2螯合的g-->s突變體似乎比母體化合物sahb3bida在抑制白血病生長中是更有效的。

在進一步的動物試驗中，在第0天對白血病的小鼠(如上產(chǎn)生)成像，然后在第1、2、3、6和7天用10mg/kgsahb3bida、5mg/kgsahb3bida或載體對照(在d5w中的5％dmso)靜脈內(nèi)處理。在第4和8天測量全身熒光。關(guān)于圖27a，與未處理的對照小鼠相比該小組中腫瘤負重的分析證明了經(jīng)sahb3bida的劑量依賴方式的白血病抑制。關(guān)于圖27b，全身熒光成像與其白血病進展明顯減弱的sahb3bida-處理的小鼠相比，證明了第8天未處理組中進一步發(fā)展的白血病(表現(xiàn)高水平白血病的紅色致密度)。

在代替使用scidbeige小鼠和rs4；11白血病細胞的附加動物試驗中，sahb3bida處理不斷地體內(nèi)抑制白血病生長。對于體內(nèi)白血病成像，用吸入異氟烷(abbottlaboratories)麻醉小鼠，伴隨地用腹腔內(nèi)注射d-熒光素(60mg/kg)(promega)進行治療。利用體內(nèi)成像系統(tǒng)(xenogen)成像光電子發(fā)射并通過光電子流的整合定量全身生物發(fā)光(光子/sec)(livingimagesoftware,xenogen)。在實驗的第1天開始，小鼠接受每日的尾部靜脈注射sahb3bida(10mg/kg)或載體(在d5w中的5％dmso)七天。在第1、3和5天對小鼠成像并且在實驗的整個時段內(nèi)每日監(jiān)視存活率。利用kaplan-meier方法測定sahb3bida和載體處理小鼠的存活率分布并利用log-rank檢驗比較。使用fisher’sexact檢驗比較在第3和5天之間處理失敗的小鼠的比例，其中處理失敗被定義為發(fā)展或死亡，而處理成功被定義為疾病穩(wěn)定或退化。期滿的小鼠經(jīng)受尸體解剖(rodenthistopathologycore,df/hcc)。

對照小鼠如通過從第1-5天的生物發(fā)光流增加所測定的證明了白血病生長的累進加速(圖27c)。3天后sahb3bida處理抑制白血病擴展，第5天觀察到腫瘤退化。代表性的小鼠圖像證明了小鼠中脾和肝中累進的白血病浸潤，但在sahba-處理的小鼠中處理第5天在這些解剖位點證明了疾病退化(圖27d)。在這個群組中死亡的中值時間對于對照動物是5天，而在七天處理時期內(nèi)sahba-處理的動物中沒有一個死去，并且代之以幸存時間為11天的中值(fig27e)。sahba-處理小鼠的組織學檢查顯示該化合物對正常的組織沒有明顯的毒性。在比較sahb3bida-和sahb3bid(g→e)a處理小鼠的附加研究中，接受點突變體sahb的動物沒有顯示腫瘤退化(圖27f)，突出了sahb3bida的抗白血病活性的體內(nèi)特異性。

多肽

在一些實例中，可進一步控制在此所描述的烴栓鏈(即,交聯(lián))。在一個情況中，烴烯基栓鏈的雙鍵，(例如，如利用釕-催化的環(huán)閉合置換(rcm)合成的)可以被氧化(例如，通過環(huán)氧化作用或二羥基化)以提供下列化合物中的一個。

該環(huán)氧化物部分或游離羥基部分中的一個可進一步被功能化。例如，可用提供可用于例如，附加標記(例如，放射性同位素或熒光標記)的附加功能的親核試劑處理該環(huán)氧化物。該標記可用于幫助指導(dǎo)該化合物至機體內(nèi)的所需要的位置(例如，當使用碘標記時，指導(dǎo)該化合物至甲狀腺)或追蹤該化合物在機體內(nèi)的位置。備選地，附加治療劑可化學地附著于功能化的栓鏈(例如，抗癌癥試劑，例如雷帕霉素(rapamycin)、長春花堿(vinblastine)、紅豆杉醇(taxol)等)。這種衍生物可備選地通過合成操作多肽的氨基或羧基末端或通過氨基酸側(cè)鏈而獲得。

雖然已經(jīng)描述了烴類栓鏈，其他的栓鏈也是可預(yù)見的。例如，該栓鏈可包括一個或多個乙醚、硫醚、酯、胺或酰胺部分。有時，可將天然存在的氨基酸側(cè)鏈整合入該栓鏈。例如，栓鏈可與官能團偶聯(lián)，例如絲氨酸中的羥基，半胱氨酸中的硫醇，賴氨酸中的伯胺，天冬氨酸或谷氨酸中的酸，或天門冬酰胺或谷氨酰胺中的酰胺。因此，有可能利用天然存在的氨基酸而不是利用通過兩個非天然存在的氨基酸偶聯(lián)制備的栓鏈來產(chǎn)生栓鏈。也可能使用與天然存在的氨基酸一起的單個非天然存在的氨基酸。

進一步預(yù)見栓鏈的長度可以是不同的。例如，當需要對仲α-螺旋結(jié)構(gòu)提供相對高程度的約束時，可使用較短長度的栓鏈，而在有些情況下，需要對仲α-螺旋結(jié)構(gòu)提供較少的約束，因此可能需要較長的栓鏈。

另外，雖然已經(jīng)描述了跨度為從氨基酸i至i+3，i至i+4；和i至i+7的栓鏈實例，以提供主要在α螺旋的單平面上的栓鏈，可合成該栓鏈以跨越任何數(shù)目組合的氨基酸。

在有些情況下，在多肽中使用α二取代的氨基酸以提高α螺旋二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。然而，不需要α二取代的氨基酸，并且也預(yù)見利用單-α取代基(例如,在栓鏈的氨基酸中)的情況。

如熟練的技術(shù)人員可認識到的，在此描述的合成化合物的方法對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是明顯的。另外，可以備選的順序或次序進行不同的合成步驟以產(chǎn)生所需要的化合物?？捎糜诤铣稍诖怂枋龅幕衔锏暮铣苫瘜W轉(zhuǎn)化和保護基方法論(保護和去保護)是本領(lǐng)域已知的，并且包括例如，在r.larock,comprehensiveorganictransformations,vchpublishers(1989)；t.w.greeneandp.g.m.wuts,protectivegroupsinorganicsynthesis,2d.ed.,johnwileyandsons(1991)；l.fieserandm.fieser,fieserandfieser'sreagentsfororganicsynthesis,johnwileyandsons(1994)；andl.paquette,ed.,encyclopediaofreagentsfororganicsynthesis,johnwileyandsons(1995),及其隨后的版本中所描述的方法。

本發(fā)明的肽可通過普通技術(shù)人員已知的化學合成方法制備。參見例如，fieldsetal.,chapter3insyntheticpeptides:auser'sguide,ed.grant,w.h.freeman&co.,newyork,n.y.,1992,p.77.hence,可利用在例如appliedbiosystems肽合成儀模型430a或431上通過利用側(cè)鏈保護氨基酸的t-boc或f-moc化學保護的α-nh2的固相合成的自動merrifield技術(shù)合成肽。

制備在此描述的肽的一個方式是利用固相肽合成(spps)。該c-末端氨基酸通過具有接頭分子的酸不穩(wěn)定鍵附著于交聯(lián)聚苯乙烯樹脂。這種樹脂在用于合成的溶劑中是不溶的，這使得它相對簡單和快速以洗去過量的反應(yīng)物和副產(chǎn)品。用在酸中穩(wěn)定，但可通過堿除去的fmoc基團保護n-末端。用堿穩(wěn)定的、酸不穩(wěn)定的基團保護任何側(cè)鏈官能團。

可通過利用天然的化學連接結(jié)合單獨的合成肽制備較長的肽。備選地，可通過已知的重組dna技術(shù)合成更長的合成肽。在已知的標準手冊中提供了這種技術(shù)的詳細方案。為了構(gòu)建編碼本發(fā)明肽的基因，逆翻譯氨基酸序列以獲得編碼該氨基酸序列的核酸序列，優(yōu)選使用對其中將表達該基因的生物體最優(yōu)化的密碼子。其次，一般通過合成編碼肽以及如有必要編碼任何調(diào)節(jié)元件的寡核苷酸來制備合成基因。將合成基因插入合適的克隆載體并轉(zhuǎn)染進入宿主細胞。然后在適于所選擇表達系統(tǒng)和宿主的適宜條件下表達該肽。純化該肽并通過標準方法表征。

利用從advancedchemtech可獲得的高通量多通道的組合合成儀，以高通量、組合的方式來制備該肽。

圖28a-28f描繪了包括可用于產(chǎn)生交聯(lián)肽的結(jié)構(gòu)域的各種肽。

治療方法

本發(fā)明提供治療處于(或容易受到)病癥危險之中或具有與異常的(例如,不足或過度的)bcl-2家族成員表達或活性(例如,外在的或固有的細胞凋亡途徑異常)相關(guān)病癥的受試者的預(yù)防和治療方法。如在此使用的，術(shù)語“治療”定義為將治療劑應(yīng)用或施用于患者，或?qū)⒅委焺?yīng)用或施用于來自患者的分離組織或細胞系，其中該患者患有疾病、具有疾病癥狀或患有疾病的傾向，其目的是為了治愈、恢復(fù)、緩和、減輕、改變、補救、改進、改善或影響該疾病、病癥或?qū)膊〉膬A向。治療劑包括但不限于小分子、肽、抗體、核糖酶和反義寡核苷酸。

有可能通過一個或多個bcl-2家族成員的異常水平(例如,過或低表達)，或通過一個或多個顯示異?；钚缘腷cl-2家族成員的存在至少部分地導(dǎo)致一些bcl-2類型病癥。因而，bcl-2家族成員水平和/或活性的降低或bcl-2家族成員水平和/或活性的增強將導(dǎo)致病癥癥狀的改善。

本發(fā)明的多肽可用于治療、預(yù)防、和/或診斷癌癥和腫瘤狀況。如在此使用的，術(shù)語“癌癥”、"高增殖"和"腫瘤"是指具有自發(fā)生長能力的細胞，即以快速增殖的細胞生長為特征的異常狀態(tài)或狀況。高增殖和腫瘤疾病狀態(tài)可被分類為病理的，即表征或組成疾病狀態(tài)，或可被分類為非病理的，即與正常的不符合然而并非與疾病狀態(tài)相關(guān)。該術(shù)語是指包括所有類型的癌性生長或致癌過程，轉(zhuǎn)移性的組織或惡性轉(zhuǎn)化的細胞、組織或器官，而與組織病理學類型或侵入的階段無關(guān)。"病理性的高增殖"細胞發(fā)生在以惡性腫瘤生長為特征的疾病狀態(tài)。非病理性的高增殖細胞的實例包括與創(chuàng)傷修復(fù)相關(guān)的細胞的增殖。

細胞增殖和/或分化病癥的實例包括癌癥，例如癌瘤、肉瘤或轉(zhuǎn)移性的病癥。該化合物(即，多肽)可起用于控制乳腺癌(breastcancer)、卵巢癌、結(jié)腸癌、肺癌、這種癌癥的轉(zhuǎn)移等的新治療劑的作用。轉(zhuǎn)移性腫瘤可能起因于大量的原發(fā)腫瘤類型，包括但不限于乳腺、肺、肝、結(jié)腸和卵巢起源的腫瘤。

癌癥或腫瘤狀況的實例包括但不限于，纖維肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮細胞瘤(mesothelioma)、ewing’s腫瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、胃癌、食道癌、直腸癌、胰腺癌(pancreaticcancer)、卵巢癌、前列腺癌、子宮癌、頭頸部癌、皮膚癌、腦瘤(braincancer)、鱗狀細胞癌、皮脂腺癌瘤(sebaceousglandcarcinoma)、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌瘤、肝癌、膽管癌瘤(bileductcarcinoma)、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、wilm’s腫瘤、子宮頸癌、睪丸癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤、成神經(jīng)管細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤、腦膜瘤、黑素瘤、成神經(jīng)細胞瘤、成視網(wǎng)膜細胞瘤、白血病、淋巴瘤或kaposi肉瘤。

增殖病癥的實例包括造血腫瘤病癥。如在此使用的，術(shù)語“造血腫瘤病癥”包括涉及造血起源，例如產(chǎn)生自脊髓、淋巴或紅細胞系統(tǒng)、或其前身細胞的增生性/贅生性細胞的疾病。優(yōu)選的，該疾病起因于分化不良的急性白血病，例如成紅血球細胞的白血病和髓母細胞性白血病。另外的例證性的脊髓病癥包括但不限于，急性前髓細胞性白血病(apml)、急性髓細胞性白血病(aml)和慢性髓細胞性白血病(cml)(參見vaickus,l.(1991)critrev.inoncol./hemotol.11:267-97)；淋巴惡性腫瘤包括但不限于，急性成淋巴細胞性白血病(all)，其包括b-譜系all和t-譜系all、慢性淋巴細胞性白血病(cll)、前淋巴細胞白血病(pll)、毛細胞白血病(hll)和waldenstrom's巨球蛋白血癥(wm)。惡性淋巴瘤的另外形式包括但不限于非-hodgkin淋巴瘤及其變體、外周的t-細胞淋巴瘤、成人t-細胞白血病/淋巴瘤(atl)、皮膚的t-細胞淋巴瘤(ctcl)、大的粒狀淋巴細胞白血癥(lgf)、hodgkin's疾病和reed-sternberg疾病。

乳腺(breast)的細胞增殖和/或分化病癥的實例包括但不限于,增生性的乳腺疾病包括，例如上皮細胞增生、硬化的腺病和小管乳頭狀瘤；腫瘤,例如，基質(zhì)腫瘤，例如纖維性瘤、葉狀腫瘤，和肉瘤，以及上皮腫瘤，例如大管乳頭狀瘤；乳腺的癌瘤包括原位(非擴散的)癌瘤，其包括導(dǎo)管原位癌(包括paget’s疾病)和小葉原位癌，以及侵入性的(浸潤)癌瘤包括但不限于，侵入性的導(dǎo)管癌瘤、侵入性的小葉癌瘤、髓樣癌、膠質(zhì)(粘質(zhì))癌瘤、管狀癌瘤、和侵入性的乳頭狀癌、以及混雜的(miscellaneous)惡性腫瘤。男性乳腺中的病癥包括但不限于男子女性型乳房癥和癌瘤。

肺的細胞增生性和/或分化病癥的實例包括但不限于，支氣管癌，包括瘤外伴隨綜合癥、細支氣管肺泡癌瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，例如支氣管的良性腫瘤、混雜的腫瘤、和轉(zhuǎn)移性腫瘤；胸膜的病變，包括炎性胸膜積液、非炎性的胸膜積液、氣胸和胸膜腫瘤，包括單發(fā)性纖維腫瘤(胸膜纖維瘤)和惡性間皮瘤。

結(jié)腸的細胞增生性和/或分化病癥的實例包括但不限于，非腫瘤息肉、腺瘤、家族綜合癥、結(jié)腸直腸癌的發(fā)生、結(jié)腸直腸的癌瘤和良性腫瘤。

肝的細胞增生性和/或分化病癥的實例包括但不限于，結(jié)節(jié)性增生、腺瘤和惡性腫瘤，包括肝的原發(fā)癌和轉(zhuǎn)移性腫瘤。

卵巢的細胞增生性和/或分化病癥的實例包括但不限于，卵巢腫瘤，例如體腔上皮的腫瘤、血漿(serous)腫瘤、粘質(zhì)腫瘤、子宮內(nèi)膜(endometeriod)腫瘤、透明細胞腺癌(clearcelladenocarcinoma)、囊腺纖維瘤、卵巢纖維上皮(brenner)瘤、表面上皮細胞瘤；生殖細胞腫瘤，例如成熟(良性)的畸胎瘤、單層畸胎瘤(teratomas)、未成熟的惡性畸胎瘤、無性細胞瘤、內(nèi)胚竇(sinus)瘤、絨毛膜瘤；生殖索-孔腫瘤(sexcord-stomaltumors)，例如，粒層泡膜(granulosa-theca)細胞瘤、泡膜細胞瘤(thecoma)-纖維瘤、睪丸足細胞瘤(androblastomas)、丘細胞(hillcell)腫瘤和性腺胚細胞瘤(gonadoblastoma)；和轉(zhuǎn)移性(metastatic)腫瘤，例如krukenberg腫瘤。

在此描述的多肽也可用于治療、預(yù)防或診斷其特征在于過度活化的細胞死亡或由于生理損傷造成細胞死亡的狀況。以早熟或不必要細胞的死亡為特征的狀況的一些實例是備選不需要的或過度的細胞增殖，包括但不限于細胞過少/發(fā)育不全、非細胞/再生障礙、或細胞過多/增生性的狀況。一些實例包括血液學病癥，包括但不限于fanconi貧血癥、再生障礙性貧血、地中海貧血(thalaessemia)、先天性中性粒細胞減少、脊髓發(fā)育不良。

本發(fā)明的起減少細胞凋亡作用的多肽可用于治療與不合需要的細胞死亡水平相關(guān)的病癥。因此，本發(fā)明的抗細胞凋亡肽可用于治療例如導(dǎo)致與病毒感染有關(guān)的細胞死亡的病癥，例如與用艾滋病毒(hiv)感染有關(guān)的侵染。多種神經(jīng)學疾病的特點在于特定組神經(jīng)元的逐步損失，并且抗細胞凋亡肽的感染可用于治療這些病癥。這種病癥包括阿爾茨海默氏?。慌两鹕习Y、肌萎縮性側(cè)索硬化(als)視網(wǎng)膜色素變性(amyotrophiclateralsclerosisretinitispigmentosa)、脊髓性肌萎縮和各種形式的小腦(cerebellar)變性。這些疾病中的細胞損失不誘導(dǎo)炎性反應(yīng)，并且細胞凋亡似乎是細胞死亡的機制。此外，許多血液學疾病與血細胞的產(chǎn)生減少有關(guān)。這些病癥包括與慢性疾病有關(guān)的貧血癥、再生障礙性貧血、慢性中性粒細胞減少和脊髓發(fā)育不良綜合癥。血細胞產(chǎn)生的病癥，例如脊髓發(fā)育不良綜合癥和一些形式的再生障礙性貧血與骨髓內(nèi)細胞凋亡的細胞死亡增加有關(guān)。這些病癥可以由促進細胞凋亡的基因的活化、基質(zhì)細胞或造血存活因子的獲得性缺陷、或毒素的直接作用和免疫應(yīng)答的媒介引起。與細胞死亡有關(guān)的兩種常見病癥是心肌梗塞和中風。在兩種病癥中，在血流急劇損失的事件中產(chǎn)生的缺血中心區(qū)內(nèi)的細胞看來似乎由于壞死的快速死亡。然而，中心缺血區(qū)域外的細胞經(jīng)過更延長的時間段死亡并且在形態(tài)學上看來似乎死于細胞凋亡。本發(fā)明的抗細胞凋亡肽可用于治療所有這類與不合需要的細胞死亡有關(guān)的病癥。

可用在此描述的多肽治療的免疫學病癥的一些實例包括但不限于器官移植排異、關(guān)節(jié)炎、狼瘡、ibd、crone’s疾病、哮喘、多發(fā)性硬化、糖尿病等。

可用在此描述的多肽治療的神經(jīng)病學病癥的一些實例包括但不限于，alzheimer’s疾病、down’s綜合癥、dutch型遺傳的腦出血淀粉樣變性、活性的淀粉樣變性、伴隨蕁麻疹和耳聾(urticariaanddeafness)的家族性淀粉狀蛋白腎病、muckle-wells綜合癥、自發(fā)的骨髓瘤；巨球蛋白血癥-相關(guān)的骨髓瘤、家族性淀粉狀蛋白多發(fā)性神經(jīng)病、家族性淀粉狀蛋白心肌炎、分離的心臟淀粉狀蛋白、全身性老年淀粉樣變性、成人發(fā)病的糖尿病、胰島瘤、分離的前房淀粉狀蛋白、甲狀腺髓樣癌、家族性淀粉樣變性、伴隨淀粉樣變性的遺傳性腦出血、家族性淀粉樣變性多發(fā)性神經(jīng)病、瘋羊病、creutzfeldt-jacob疾病、gerstmannstraussler-scheinker綜合癥、牛海綿狀腦炎、朊病毒介導(dǎo)的疾病、和huntington’s疾病。

可用在此描述的多肽治療的內(nèi)分泌學病癥的一些實例包括但不限于糖尿病、甲狀腺功能減退(hypthyroidism)、hyopituitarism、甲狀旁腺機能減退、性腺機能減退(hypogonadism)等。

可用本發(fā)明的化合物和方法治療或預(yù)防的心血管病癥(例如炎性病癥)的實例包括但不限于，動脈粥樣硬化、心肌梗塞、中風、血栓形成、動脈瘤、心力衰竭、缺血性心臟病、心絞痛、心源性猝死、高血壓性心臟病；非冠狀血管疾病，例如小動脈硬化、小脈管疾病、腎病、高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥、高脂血癥、黃瘤病、哮喘、高血壓、肺氣腫和慢性肺病；或與介入方法("程序性的血管創(chuàng)傷")，例如血管成形術(shù)、放置旁路(placementofashunt)、擴張、合成或天然的切除移植物、留置導(dǎo)管、活瓣(valve)或其他可植入裝置后的再狹窄有關(guān)的心血管狀況。優(yōu)選的心血管病癥包括動脈粥樣硬化、心肌梗塞、動脈瘤和中風。

藥物組合物和給藥途徑

如在此使用的，本發(fā)明的化合物，包括在此描述的通式的化合物，被定義為包括其藥物學上可接受的衍生物或前體藥物?！八幬飳W上可接受的衍生物或前體藥物”是指當施用于受體時能夠(直接或間接地)提供本發(fā)明化合物的任何藥物學上可接受的本發(fā)明化合物的鹽、酯、酯的鹽、或其他衍生物。特別有利的衍生物和前體藥物是當這種化合物被施用于哺乳動物(例如,通過容許口服化合物以更容易地被吸收到血液中)時，增加本發(fā)明化合物的生物利用率，或相對于親本種增加母體化合物遞送至生物間隔(例如,腦或淋巴系統(tǒng))的衍生物和前體藥物。優(yōu)選的前體藥物包括的衍生物中增加通過腸管膜的水溶性或主動運輸?shù)幕鶊F結(jié)合于在此所描述的通式的結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明的化合物可通過添加適當?shù)墓δ芤栽黾铀x擇的生物特性而被改變。這種改變是本領(lǐng)域已知的，并且包括增加生物穿透進入給定生物間隔(例如,血液、淋巴系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng))、增加口服可利用性、增加可溶性以容許通過注射給藥、改變新陳代謝和改變排泄速率的修飾。

本發(fā)明化合物的藥物學上可接受的鹽包括來源于藥物學上可接受的無機和有機酸和堿的鹽。合適的酸性鹽的實例包括醋酸鹽、己二酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、二葡糖酸鹽(digluconate)、十二烷基硫酸鹽、甲酸鹽、富馬酸鹽(fumarate)、羥乙酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘化物、乳酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、硝酸鹽、palmoate、磷酸鹽、苦味酸鹽(picrate)、特戊酸鹽(pivalate)、丙酸鹽、水楊酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽(tartrate)、甲苯磺酸鹽(tosylate)和十一酸鹽。來源于適當?shù)膲A的鹽包括，堿金屬(例如鈉)、堿土金屬(例如,鎂)、銨和n-(烷基)4⁺鹽。本發(fā)明也預(yù)見在此所公開的化合物的包含任何堿性氮基團的季銨化作用?？赏ㄟ^這種季銨化作用獲得水或可溶于油的或可分散的產(chǎn)品。

在此描述的通式的化合物可例如通過注射、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)注射或皮下地；或口服、頰部(buccally)、鼻部、轉(zhuǎn)化粘液質(zhì)、局部地在眼制劑中、或通過吸入給藥，其劑量范圍為大約0.001至大約100mg/kg的體重，或根據(jù)特定藥物的需要量。在此該方法試圖施用有效量的化合物或化合物組合物以獲得所需要的或確定的效果。一般地，本發(fā)明的藥物組合物以每日大約1至大約6次或備選地作為連續(xù)的輸液進行給藥。這種給藥可用作慢性的或急性的治療?？膳c載體材料組合以產(chǎn)生單一劑型地活性成分的數(shù)量將依賴于待治療的宿主和給藥的特定方式而不同。典型的制劑將包含大約5％至大約95％的活性化合物(w/w)。備選地，這種制劑包含大約20％至大約80％的活性化合物。

可能需要比上述的劑量更低或更高的劑量。用于任何特定患者的指定劑量和治療方式將依賴于多種因素，包括所使用的指定化合物的活性、年齡、體重、全身健康狀態(tài)、性別、飲食、給藥時間、排泄速率、藥物組合、疾病的嚴重度和病程、狀況或癥狀、患者對疾病、狀況或癥狀的處置、以及治療醫(yī)師的判斷。

當改善患者狀況時，如有必要可施用維持劑量的化合物、組合物或本發(fā)明的組合。隨后，當對癥狀起作用時，可減少給藥的劑量或頻率，或兩者都減少至保持改善的狀況的水平。然而當有任何病征再發(fā)生時患者可能需要長期方式的間歇療法。

本發(fā)明的藥物組合物包括在此描述的通式的化合物或其藥物學上可接受的鹽；附加試劑包括例如，嗎啡或甲基嗎啡；以及任何藥物學上可接受的載體、佐劑或賦形劑。本發(fā)明的備選組合物包括在此描述的通式的化合物或其藥物學上可接受的鹽；以及藥物學上可接受的載體、佐劑或賦形劑。在此描繪的組合物包括在此描繪的通式的化合物，以及如果呈遞，包括用于獲得調(diào)節(jié)疾病或病征，包括bcl-2家族成員介導(dǎo)的病癥或其癥狀的有效量的附加治療劑。

術(shù)語“藥物學上可接受的載體或佐劑”是指可與本發(fā)明的化合物一起施用于患者，并且不破壞其藥理學活性，以及當以足夠遞送治療數(shù)量的該化合物的劑量給藥時是無毒的載體或佐劑。

可用于本發(fā)明的藥物組合物的藥物學上可接受的載體、佐劑和賦形劑包括但不限于，離子交換劑、鋁礬土、硬脂酸鋁、卵磷脂、自乳化藥物遞送系統(tǒng)(sedds)，例如d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸鹽、用于藥物劑型地表面活性劑，例如tweens或其他相似的聚合遞送基質(zhì)，血清蛋白，例如人血清白蛋白，緩沖物質(zhì)，例如磷酸鹽、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的偏甘油酯(partialglyceride)混合物、水、鹽或電解質(zhì)，例如硫酸魚精蛋白，磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠態(tài)氧化硅、三硅酸鎂、聚乙烯基吡咯烷酮、基于纖維素的物質(zhì)、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯，蠟、聚乙烯-聚氧化丙烯-塊段(block)聚合體、聚乙二醇和羊毛脂。環(huán)糊精，例如α-、β-和γ-環(huán)糊精也可有利地用于增加遞送在此描述的通式的化合物。

本發(fā)明的藥物組合物可口服、腸胃外地、通過吸入噴霧、局部地、直腸、鼻部、頰部、陰道地或通過植入容器進行給藥，優(yōu)選通過口服或通過注射給藥。本發(fā)明的藥物組合物可包含任何常規(guī)無毒的藥物學上-可接受的載體、佐劑或賦形劑。有時，可用藥物學上可接受的酸、堿或緩沖液調(diào)節(jié)該制劑的ph以增加所配制化合物或其遞送形式的穩(wěn)定性。如在此使用的術(shù)語腸胃外的，包括皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、動脈內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、損害內(nèi)(intralesional)和顱內(nèi)(intracranial)的注射或輸液技術(shù)。

該藥物組合物可以是無菌可注射制劑的形式，例如無菌的可注射的含水或含油的懸浮液。這種懸浮液可利用合適的分散劑或濕潤劑(例如，tween80)和懸浮劑根據(jù)本領(lǐng)域已知的技術(shù)配制。該無菌的可注射制劑也可以是在無毒的腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌的可注射溶液或懸浮液，例如作為在1,3-丁二醇中的溶液?？墒褂玫目山邮艿馁x形劑和溶劑是甘露醇、水、ringer’s溶液和等滲氯化鈉溶液。此外，通常使用無菌的固定油類作為溶劑或懸浮介質(zhì)。為了這個目的，可使用任何溫和的固定油，包括合成的單-或二脂酰甘油脂。脂肪酸，例如油酸及其甘油酯衍生物可用于可注射的制劑，如天然的藥物學上可接受的油劑，例如橄欖油或蓖麻油，特別是其聚氧乙烯化的形式。這些油劑或懸浮液也可包含長鏈乙醇稀釋劑或分散劑，或羧甲基纖維素或相似的分散劑，其通常被用于藥物學上可接受劑型，例如乳劑和或懸浮液的配制。其他通常使用的表面活性劑，例如tweens或spans和/或其他相似的乳化劑或通常被用于制造藥物學上可接受的固體、液體或其他劑型的生物利用率增強劑也可用于該配制的目的。

本發(fā)明的藥物組合物可以任何口服可接受的劑型口服給藥，包括但不限于膠囊劑、片劑、乳劑和水懸劑、分散劑和液劑。就用于口服使用的片劑來說，通常使用的載體包括乳糖和玉米淀粉。一般也附加潤滑劑，例如硬脂酸鎂。對于膠囊劑形式的口服給藥，有用的稀釋劑包括乳糖和干的玉米淀粉。當口服給藥水懸劑和/或乳劑時，活性成分可以懸浮或溶于油相而與乳化劑和/或懸浮劑化合。如果需要，可添加某些加甜味料和/或調(diào)味劑和/或著色劑。

本發(fā)明的藥物組合物也可以用于直腸給藥的栓劑形式給藥?？赏ㄟ^將本發(fā)明的化合物與在室溫下為固體但在直腸溫度下為液體并因此在直腸中溶化以釋放該活性成分的合適的無刺激性賦形劑混合來制備這些組合物。這種材料包括但不限于可可脂、蜂蠟和聚乙二醇。

本發(fā)明的藥物組合物可通過鼻的氣溶膠或吸入劑給藥。根據(jù)藥物配制領(lǐng)域已知的技術(shù)制備這種組合物，并且可制備為在鹽水中的溶液，其中使用苯甲醇或其他合適的防腐劑、吸收促進劑以增加生物利用率、氟碳化合物、和/或其他本領(lǐng)域已知的增溶劑或分散劑。

當本發(fā)明的組合物包括在此描述的通式的化合物的組合物和一種或多種附加治療劑或預(yù)防劑時，該化合物和附加試劑都應(yīng)以大約1至100％之間的劑量水平存在，并且更優(yōu)選通常在單治療方式中給藥的大約5至95％之間的劑量。該附加試劑可單獨給藥，作為來自本發(fā)明化合物的多劑量方式的一部分。備選地，那些試劑可以是在單組合物中與本發(fā)明化合物混合在一起的單劑型的一部分。

篩選分析

本發(fā)明提供用于識別調(diào)節(jié)一個或多個bcl-2家族蛋白質(zhì)或結(jié)合一個或多個bcl-2家族蛋白質(zhì)(例如,具有至少一個bh同源性結(jié)構(gòu)域的多肽)的多肽的方法(在此也相當于"篩選分析")。

在此描述的多肽的結(jié)合親合力可利用例如滴定結(jié)合分析進行測定。bcl-2家族多肽或包括bh結(jié)構(gòu)域(例如,bid、bak、bax等)的多肽可在存在例如包含多肽或其片段(例如bid、bad、bak、bax等)的熒光標記的bh3的底物時，暴露于不同濃度的候選化合物(即，多肽)(例如,1nm,10nm,100nm,1μm,10μm,100μm,1mm和10mm)。然后分析候選化合物的各個濃度的作用以確定該候選化合物對不同濃度的bcl-2家族結(jié)合活性的作用，其可用于計算該候選化合物的ki。該候選化合物可調(diào)節(jié)競爭或非競爭性方式的bcl-2類型活性。也可在bcl-2家族蛋白質(zhì)和熒光標記的候選化合物之間進行直接的結(jié)合分析以確定結(jié)合相互作用的kd。還可例如通過測量其在觸發(fā)來自純化線粒體的細胞色素c中的劑量-反應(yīng)的效力來篩選候選化合物的體外生物活性。也預(yù)見細胞透性篩選分析，其中將熒光標記的候選化合物施用于完整細胞，然后通過顯微術(shù)或高通量的細胞熒光檢測來分析細胞熒光。

用單獨的候選化合物進行在此描述的分析或可用多元候選化合物進行這種分析。當用多元候選化合物進行該分析時，可利用候選化合物的混合物進行該分析或可以具有單候選化合物的各個反應(yīng)進行平行反應(yīng)?？衫帽绢I(lǐng)域已知的組合文庫方法中的任何多種方法來獲得測試化合物或試劑。

在一個實施方案中，分析是基于細胞的分析，其中將表達bcl-2家族蛋白質(zhì)或其生物活性部分的細胞與候選多肽接觸，并且測定該測試化合物調(diào)節(jié)bcl-2類型活性的能力(例如,在一些實例中通過固有的或外在的細胞死亡途徑，細胞凋亡增加，而在其他情況中，細胞凋亡減少)。測試化合物在細胞內(nèi)調(diào)節(jié)bcl-2類型活性能力的測定可伴隨有監(jiān)測例如，從線粒體釋放的細胞色素c或其他相關(guān)的生理讀數(shù)(例如,膜聯(lián)蛋白v染色、mtt分析、胱冬蛋白酶活性分析、tunel分析)。

在一個實施方案中，分析是生化分析，由此可將交聯(lián)的多肽與親合樹脂連接以純化或識別細胞凋亡途徑中新的或已知的相互作用伴侶。

在此引用的所有參考文獻，無論已出版的、電子的、電腦可讀存儲介質(zhì)的或其他的形成，是全部明確地引入作為參考，包括但不限于摘要、論文、期刊、出版刊物、教科書、條約、國際互連網(wǎng)網(wǎng)點、數(shù)據(jù)庫、專利和專利公開物。

其他應(yīng)用

在此描述的肽的生物學上相關(guān)的應(yīng)用如通過下列基于細胞隔室所表明的是數(shù)目眾多且容易表現(xiàn)的∶

(1)細胞表面-表現(xiàn)hiv-1蛋白質(zhì)gp41(例如，c-肽、t-20肽)的關(guān)鍵螺旋區(qū)的天然肽已經(jīng)顯示防止病毒融合而因此防止hiv感染。參與融合機制的螺旋肽對許多病毒-宿主細胞感染范例是很重要的(例如，dengue,hepatitisc,influenza),因此，這些決定性的螺旋區(qū)域的烴類-鉤環(huán)類似物可通過抑制病毒的融合而起有效抗生素的作用。通常，利用螺旋接觸面以活化或抑制信號途徑的與細胞表面受體相互作用的配體表現(xiàn)了在此描述的多肽的附加應(yīng)用。

(2)膜內(nèi)-受體二聚作用和寡聚化是配體誘導(dǎo)的受體活化和信號傳遞的主要特征。橫跨膜的螺旋結(jié)構(gòu)域廣泛參與這種必要的寡聚化反應(yīng)(例如，表皮生長因子受體[egfr]家族)，并且特異的肽序列已經(jīng)被定義為促進這些致密的膜內(nèi)螺旋締合的序列。這種受體通過寡聚化的異常活化涉及疾病致病原因(例如，erbb和腫癌癥)。因此，在適當?shù)沫h(huán)境中，橫跨膜的內(nèi)螺旋相互作用的活化或抑制將具有治療學益處。

(3)細胞溶質(zhì)的-細胞溶質(zhì)的靶包括可溶蛋白質(zhì)靶和與特異的內(nèi)細胞溶質(zhì)的細胞器有關(guān)的靶，包括線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、golgi網(wǎng)絡(luò)、溶酶體和過氧物酶體。在細胞凋亡的領(lǐng)域內(nèi)，存在針對烴類-鉤環(huán)bcl-2家族結(jié)構(gòu)域的多種細胞溶質(zhì)和線粒體細胞凋亡蛋白質(zhì)靶。在促細胞凋亡蛋白質(zhì)的只有bh3-亞組內(nèi)，已經(jīng)鑒定了bh3結(jié)構(gòu)域的兩個主要子集∶(1)bid-樣bh3s(例如,bim)，其是細胞凋亡“激活子，在線粒體誘導(dǎo)bak寡聚化和細胞色素c釋放以及(2)bad-樣bh3s，其是細胞凋亡“敏感子”，有選擇地靶向抗細胞凋亡多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)，啟動活化結(jié)構(gòu)域的閾下水平至最大限度的有效性。除只有bh3的蛋白質(zhì)對促對比抗細胞凋亡多結(jié)構(gòu)域家族成員的不同結(jié)合外，bh3結(jié)構(gòu)域在抗細胞凋亡蛋白質(zhì)當中顯示有差別的結(jié)合。例如，已經(jīng)證明bad優(yōu)選地結(jié)合抗細胞凋亡bcl-2，而bim靶向抗細胞凋亡mcl-1。鑒定和研究這些選擇性的相互作用是極其重要的，因為不同的bcl-2家族成員涉及不同類型的腫瘤。例如，bcl-2過表達一般引起濾泡性淋巴瘤和化療耐受性(resistance)的發(fā)展，而mcl-1被認為在多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病機理中扮演重要角色。使許多bh3結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)化為結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的能力和細胞可滲透反應(yīng)劑將為研究和區(qū)別調(diào)控癌細胞中的細胞凋亡途徑提供重要的時機。進一步靶向胞液中或在細胞溶質(zhì)的細胞器中的螺旋依賴的相互作用或是可預(yù)見的。

(4)核-核轉(zhuǎn)錄因子及其調(diào)節(jié)蛋白驅(qū)動大量生理過程以與核蛋白和核酸相互作用的肽螺旋為基礎(chǔ)。最近我們已經(jīng)通過合成一系列與mdm2以皮摩爾親合力相互作用的烴類-鉤環(huán)(stapled)p53肽證明了產(chǎn)生烴類-鉤環(huán)肽以參加核相互作用的可能性。除調(diào)節(jié)核內(nèi)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用外，蛋白質(zhì)-核酸的相互作用也是顯而易見的目標。多重轉(zhuǎn)錄因子家族，例如同源結(jié)構(gòu)域、基本的螺旋-環(huán)-螺旋、核受體和包含鋅指的蛋白質(zhì)，通過其肽螺旋直接與dna相互作用來活化或抑制基因轉(zhuǎn)錄。舉例來說，同源結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)是調(diào)節(jié)極度的多細胞機體中的生長和分化遺傳程序的必要轉(zhuǎn)錄因子家族。這些蛋白質(zhì)共享包含60個氨基酸長的肽，形成三個α-螺旋，稱為同源結(jié)構(gòu)域的保守的dna結(jié)合基序，其中第三個α螺旋與dna的寬(major)溝直接接觸。類似于細胞凋亡蛋白質(zhì)的bh3結(jié)構(gòu)域，同源結(jié)構(gòu)域是在同系物當中具有足夠變化的決定性的效應(yīng)物基序，其促進有差異的結(jié)合特異性和生理活性。蛋白質(zhì)-dna相互作用可以是復(fù)雜的和廣泛的，由此為了研究和有選擇地調(diào)節(jié)翻譯事件的目的而提供對小分子開發(fā)的挑戰(zhàn)。在高等生物體中，同源結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)在發(fā)育、確定機體計劃和支配組織分化期間高度表達。特異的同源異型蛋白(例如，cdx4)的過表達可活化導(dǎo)致例如來自小鼠胚胎干細胞的血液形成的組織-特異分化程序。同源異型基因表達的異常調(diào)節(jié)，例如一般在未分化細胞中表達的同源結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的異常上調(diào)或通常在分化細胞中表達的這種蛋白質(zhì)的不適當下調(diào)可促進腫瘤的發(fā)展和維持。例如，在小兒的腺泡狀橫紋肌肉瘤(pediatricalveolarrhabdomyosarcoma)中，pax3或pax7dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域與forkhead的轉(zhuǎn)活化結(jié)構(gòu)域的融合已經(jīng)涉及細胞轉(zhuǎn)化；涉及幾個hox基因的dna-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的易位已經(jīng)涉及白血病的發(fā)病機理。因此，化學穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄因子螺旋，例如同源結(jié)構(gòu)域肽用于細胞遞送的能力對產(chǎn)生用于研究和調(diào)節(jié)各種對健康和疾病中大量的生物過程負責的轉(zhuǎn)錄程序的化學工具盒具有潛能。

已經(jīng)描述了本發(fā)明的許多實施方案。然而，可以理解可制備各種改變而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，其他的實施方案在下列權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。

序列表

<110>達納-法伯癌癥研究所股份有限公司

<120>穩(wěn)定的α螺旋肽及其用途

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<211>7

<212>prt

<213>小家鼠(musmusculus)

<400>34

leugluvalleuglyargglu

15

<210>35

<211>7

<212>prt

<213>人(homosapiens)

<400>35

leulysalaleuglyaspglu

15

<210>36

<211>7

<212>prt

<213>人(homosapiens)

<400>36

leualaglnvalglyaspser

15

<210>37

<211>7

<212>prt

<213>人(homosapiens)

<400>37

leulysargileglyaspglu

15

<210>38

<211>7

<212>prt

<213>人(homosapiens)

<400>38

leuargargileglyaspglu

15

<210>39

<211>7

<212>prt

<213>人(homosapiens)

<400>39

leualaglnileglyaspglu

15

<210>40

<211>213

<212>prt

<213>褐家鼠(rattusnorvegicus)

<400>40

metgluvalleuargargserservalphealaalagluilemetasp

151015

alapheaspargserprothrasplysgluleuvalalaglnalalys

202530

alaleuglyargglutyrvalhisalaargleuleuargalaglyleu

354045

sertrpseralaprogluargalaserproalaproglyglyargleu

505560

alagluvalcysthrvalleuleuargleuglyaspgluleuglugln

65707580

ileargproservaltyrargasnvalalaargglnleuhisilepro

859095

leuglnsergluprovalvalthraspalapheleualavalalagly

100105110

hisilepheseralaglyilethrtrpglylysvalvalserleutyr

115120125

servalalaalaglyleualavalaspcysvalargglnalaglnpro

130135140

alametvalhisalaleuvalaspcysleuglygluphevalarglys

145150155160

thrleualathrtrpleuargargargglyglytrpthraspvalleu

165170175

lyscysvalvalserthraspproglypheargserhistrpleuval

180185190

alathrleucysserpheglyargpheleulysalaalaphepheleu

195200205

leuleuprogluarg

210

<210>41

<211>211

<212>prt

<213>人(homosapiens)

<400>41

metalaserglyglnglyproglyproproargglnglucysglyglu

151015

proalaleuproseralaserglugluglnvalalaglnaspthrglu

202530

gluvalpheargsertyrvalphetyrarghisglnglngluglnglu

354045

alagluglyvalalaalaproalaaspproglumetvalthrleupro

505560

leuglnproserserthrmetglyglnvalglyargglnleualaile

65707580

ileglyaspaspileasnargargtyraspserglupheglnthrmet

859095

leuglnhisleuglnprothralagluasnalatyrglutyrphethr

100105110

lysilealathrserleuphegluserglyileasntrpglyargval

115120125

valalaleuleuglypheglytyrargleualaleuhisvaltyrgln

130135140

hisglyleuthrglypheleuglyglnvalthrargphevalvalasp

145150155160

phemetleuhishiscysilealaargtrpilealaglnargglygly

165170175

trpvalalaalaleuasnleuglyasnglyproileleuasnvalleu

180185190

valvalleuglyvalvalleuleuglyglnphevalvalargargphe

195200205

phelysser

210

<210>42

<211>192

<212>prt

<213>黃牛(bostaurus)

<400>42

metaspglyserglygluglnproargglyglyglyprothrserser

151015

gluglnilemetlysthrglyalaleuleuleuglnglypheilegln

202530

aspargalaglyargmetglyglyglualaprogluleualaleuasp

354045

provalproglnaspalaserthrlyslysleuserglucysleulys

505560

argileglyaspgluleuaspserasnmetgluleuglnargmetile

65707580

alaalavalaspthraspserproarggluvalphepheargvalala

859095

alaaspmetpheseraspglyasnpheasntrpglyargvalvalala

100105110

leuphetyrphealaserlysleuvalleulysalaleucysthrlys

115120125

valprogluleuileargthrilemetglytrpthrleuasppheleu

130135140

arggluargleuleuglytrpileglnaspglnglyglytrpaspgly

145150155160

leuleusertyrpheglythrprothrtrpglnthrvalthrilephe

165170175

valalaglyvalleuthralaserleuthriletrplyslysmetgly

180185190

<210>43

<211>192

<212>prt

<213>褐家鼠(rattusnorvegicus)

<400>43

metalathrproalaseralaproaspthrargalaleuvalalaaspphe

151015

valglytyrlysleuargglnlysglytyrvalcysglyalaglypro

202530

glygluglyproalaalaaspproleuhisglnalametargalaala

354045

glyaspgluphegluthrargpheargargthrpheseraspleuala

50556065

alaglnleuhisvalthrproglyseralaglnglnargphethrgln

707580

valseraspgluleupheglnglyglyproasntrpglyargleuval

859095

alaphephevalpheglyalaalaleucysalagluservalasnlys

100105110

glumetgluproleuvalglyglnvalglnglutrpmetvalalatyr

115120125

leugluthrargleualaasptrpilehisserserglyglytrpala

130135140145

gluphethralaleutyrglyaspglyalaleugluglualaargarg

150155160

leuarggluglyasntrpalaservalargthrvalleuthrglyala

165170175

valalaleuglyalaleuvalthrvalglyalaphephealaserlys

180185190

<210>44

<211>194

<212>prt

<213>人(homosapiens)

<400>44

metserglnserasnarggluleuvalvalasppheleusertyrlys

151015

leuserglnlysglytyrsertrpserglnpheseraspvalgluglu

202530

asnargthrglualaproarggluvalileprometalaalavallys

354045

glnalaleuargglualaglyaspgluphegluleuargtyrargarg

505560

alapheseraspleuthrserglnleuhisilethrproglythrala

65707580

tyrglnserphegluglnvalvalasngluleupheargaspglyval

859095

asntrpglyargilevalalaphepheserpheglyglyalaleucys

100105110

valgluservalasplysglumetglnvalleuvalserargileala

115120125

alatrpmetalathrtyrleuasnasphisleugluprotrpilegln

130135140

gluasnglyglytrpaspthrphevalgluleutyrglyasnasnala

145150155160

alaalagluserarglysglyglngluargpheasnargtrppheleu

165170175

thrglymetthrvalalaglyvalvalleuleuglyserleupheser

180185190

arglys

<210>45

<211>200

<212>prt

<213>人(homosapiens)

<400>45

metalahisalaglyargthrglytyraspasnarggluilevalmet

151015

lystyrilehistyrlysleuserglnargglytyrglutrpaspala

202530

glyaspvalglyalaalaproproglyalaalaproproalaleuser

354045

provalproprovalvalhisleualaleuargglnalaglyaspasp

505560

pheserargargtyrargglyaspphealaglumetserserglnleu

65707580

hisleuthrprophethralaargglyargphealathrvalvalglu

859095

gluleupheargaspglyvalasntrpglyargilevalalaphephe

100105110

glupheglyglyvalmetcysvalgluservalasnargglumetser

115120125

proleuvalaspasnilealaleutrpmetthrglutyrleuasnarg

130135140

hisleuhisthrtrpileglnaspasnglyglytrpaspalapheval

145150155160

gluleutyrglyprosermetargproleupheaspphesertrpleu

165170175

serleulysthrleuleuserleualaleuvalglyalacysilethr

180185190

leuglyalatyrleuserhislys

195200

<210>46

<211>231

<212>prt

<213>秀麗線蟲(caenorhabditiselegans)

<400>46

serproserargglnalaserthrargargmetserileglygluser

151015

ileaspglylysileasnasptrpglugluproargleuaspileglu

202530

glyphevalvalasptyrphethrhisargileargglnasnglymet

354045

glutrppheglyalaproglyleuprocysglyvalglnprogluhis

505560

glumetmetargvalmetglythrilepheglulyslyshisalaglu

65707580

asnphegluthrphecysgluglnleuleualavalproargileser

859095

pheserleutyrglnaspvalvalargthrvalglyasnalaglnthr

100105110

aspglncysprometsertyrglyargleuileglyleuileserphe

115120125

glyglyphevalalaalalysmetmetgluservalgluleuglngly

130135140

glnvalargasnleuphevaltyrthrserleupheilelysthrarg

145150155160

ileargasnasntrplysgluhisasnargsertrpaspaspphemet

165170175

thrleuglylysglnmetlysgluasptyrgluargalaglualaglu

180185190

lysvalglyargarglysglnasnargargtrpsermetileglyala

195200205

glyvalthralaglyalaileglyilevalglyvalvalvalcysgly

210215220

argmetmetpheserleulys

225230

<210>47

<211>270

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<221>mod_res

<222>(77)..(77)

<223>任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(114)..(114)

<223>任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(123)..(123)

<223>任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(168)..(168)

<223>任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(221)..(221)

<223>任何氨基酸

<400>47

metalaalaproglnaspvalasnvalargilecysasnglnglxile

151015

vallyspheaspleugluvallysalaleuileglnaspileargasp

202530

cysserglyproleuseralaleuthrgluleuasnthrlysvallys

354045

glulyspheglnglnleuarghisargileglnprovalleutyrgln

505560

argalathrileasnglxalaserthrilethrthrxaaleutyrtyr

65707580

gluleuthrasppheserserthrglnasnasppheasnserprothr

859095

tyrphevalthrpheseraspleuglxglnleualalysglxglnasp

100105110

lysxaaserglulysglnleuleuleuglnxaavalgluasnarglys

115120125

lysglnasnleulysasnglnalasertrparglysalaasnleuthr

130135140

cyslysleualaileaspasnilearglysalaasnleuleuglngln

145150155160

glnaspleuleualaglnargxaathrtyrlyslysserleualagln

165170175

tyrserserthrilethrlysserleuasnglyileserargglnlys

180185190

alaglnglnvalglnglnsergluglualaasnglnserleuvalthr

195200205

serserargthrileleuaspalalysglugluthrxaaserasnser

210215220

glnthrileglnleuglnarglysleuilethrlystyrmetargarg

225230235240

glxleuthrasplysleuleuilepheleualaleuargleuthrleu

245250255

alathrvalleutyrilevallyslysargleupheprophe

260265270

<210>48

<211>14

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>48

lysalagluleuleuglnglyglyasplyslysargglnarg

1510

<210>49

<211>14

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>49

alaleuargleualacysileglyaspglumetaspvalser

1510

<210>50

<211>14

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>50

alaleuargleualacysileglyaspglumetaspleucys

1510

<210>51

<211>14

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>51

alaarghisleualaglnvalglyaspsermetaspargser

1510

<210>52

<211>14

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>52

glyargglnleualaileileglyaspaspileasnargarg

1510

<210>53

<211>14

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>53

alaalaargleulysalaleuglyaspgluleuhisglnarg

1510

<210>54

<211>14

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>54

serglucysleuargargileglyaspgluleuaspserasn

1510

<210>55

<211>14

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>55

alaglngluleuargargileglyaspglupheasnalatyr

1510

<210>56

<211>14

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>56

cysthrvalleuleuargleuglyaspgluleugluglnile

1510

<210>57

<211>14

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>57

lysglnalaleuargglualaglyaspgluphegluleuarg

1510

<210>58

<211>14

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>58

hisleuthrleuargglnalaglyaspasppheserargarg

1510

<210>59

<211>14

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>59

leugluthrleuargargvalglyaspglyvalglnargasn

1510

<210>60

<211>184

<212>prt

<213>小家鼠(musmusculus)

<400>60

metgluproserglncysvalglugluleugluaspaspvalphegln

151015

progluaspglygluprovalthrglnproglyserleuleuserala

202530

aspleuphealaglnserleuleuaspcysproleuserargleugln

354045

leupheproleuthrhiscyscysglyproglyleuargprothrser

505560

glngluasplysalathrglnthrleuserproalaserproserpro

65707580

glyvalmetleuprocysglyvalthrglugluproglnargleuphe

859095

tyrglyasnalaglytyrargleuproleuproalaserpheproala

100105110

valleuproileglygluglnproprogluglyglntyrglnhisgln

115120125

alagluvalglnilealaarglysleuglncysilealaaspglnphe

130135140

hisargleuhisvalglnglnhisglnglnasnglnasnprovaltrp

145150155160

asnglnileleuleupheleuhisasnleualaleuasnglygluglu

165170175

asnproasnglyalaglyproarg

180

<210>61

<211>185

<212>prt

<213>人(homosapiens)

<400>61

metgluproproglncysvalglugluleugluaspaspvalphegln

151015

sergluaspglygluproglythrglnproglyglyleuleuserala

202530

aspleuphealaglnserglnleuaspcysproleuserargleugln

354045

leupheproleuthrhiscyscysglyproglyleuargproileser

505560

glngluasplysalathrglnthrleuserproalaserprosergln

65707580

glyvalmetleuprocysglyvalthrglugluproglnargleuphe

859095

tyrglyasnalaglytyrargleuproleuproalaserpheproala

100105110

glyserproleuglygluglnproprogluglyglnpheleuglnhis

115120125

argalagluvalglnilealaprolysleuglncysilealaaspgln

130135140

phehisargleuhisthrglnglnhisglnglnasnargaspargala

145150155160

trpasnglnvalpheleupheleuglnasnleualaleuasnarggln

165170175

gluasnprogluglyvalglyprotrp

180185

<210>62

<211>15

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>62

ilealaarglysleuglncysilealaaspglnphehisargleu

151015

<210>63

<211>14

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>63

ilealaglngluleuargargileglyasppheasnalatyr

1510

<210>64

<211>13

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>64

ileglyserlysleualaalacysasppheaspalagln

1510

<210>65

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>65

glyargglnleualaileileglyaspasnargarg

1510

<210>66

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>66

serglucysleulysargileglyaspaspserasn

1510

<210>67

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>67

alaleuleualacysileglyaspaspvalser

1510

<210>68

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>68

thralaalaleulysalaglyasphisglnarg

1510

<210>69

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>69

glyarggluleuargargseraspphevalaspser

1510

<210>70

<211>22

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>70

serseralaalaglugluleualaalaalaleuargargileglyasp

151015

gluleuaspargargtyr

20

<210>71

<211>22

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>71

gluglyproalaaspproleuhisglnalametargalaalaglyasp

151015

gluphegluthrargphe

20

<210>72

<211>24

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>72

leuglnproserserthrmetglyglnvalglyargglnleualaile

151015

ileglyaspaspileasnargarg

20

<210>73

<211>22

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>73

glnaspalaserthrlyslysleuserglucysleulysargilegly

151015

aspgluleuaspserasn

20

<210>74

<211>24

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>74

alaleuserproprovalvalhisleualaleualaleuargglnalaglyasp

151015

asppheserargargtyr

20

<210>75

<211>25

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>75

asnleutrpalaalaglnargtyrglyarggluleuargargmetser

151015

aspgluphevalaspserphelyslys

2025

<210>76

<211>22

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>76

gluaspileileargasnilealaarghisleualaglnvalglyasp

151015

sermetaspargserile

20

<210>77

<211>23

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>77

gluvalileprometalaalavallysglnalaleuargglualagly

151015

aspgluphegluleuargtyr

20

<210>78

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>78

metgluglyseraspalaleuargleualacysileglyaspglumet

151015

aspvalserleu

20

<210>79

<211>22

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>79

metargprogluiletrpilealaglngluleuargargileglyasp

151015

glupheasnalatyrtyr

20

<210>80

<211>22

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>80

serseralaalaglnleuthralaalaargleulysalaleuglyasp

151015

gluleuhisglnargthr

20

<210>81

<211>22

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>81

hisglnalagluvalglnilealaarglysleuglncysilealaasp

151015

glnphehisargleuhis

20

<210>82

<211>22

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>82

ilegluargarglysgluvalgluserileleulyslysasnserasp

151015

trpiletrpasptrpser

20

<210>83

<211>22

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>83

glyargleualagluvalcysalavalleuleuargleuglyaspglu

151015

leuglumetileargpro

20

<210>84

<211>19

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>84

leualagluvalcysthrvalleuleuargleuglyaspgluleuglu

151015

glnilearg

<210>85

<211>19

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>85

metthrvalglygluleuserargalaleuglyhisgluasnglyser

151015

leuasppro

<210>86

<211>23

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>86

alathrserarglysleugluthrleuargargvalglyaspglyval

151015

glnargasnhisgluthrala

20

<210>87

<211>22

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>87

serseralaalaglnleuthralaalaargleulysalaleuglyasp

151015

gluleuhisglnargthr

20

<210>88

<211>22

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>88

gluglntrpalaarggluileglyalaglnleuargargmetalaasp

151015

aspleuasnalaglntyr

20

<210>89

<211>22

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>89

alagluleuproprogluphealaalaglnleuarglysileglyasp

151015

lysvaltyrcysthrtrp

20

<210>90

<211>22

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>90

proalaaspleulysaspglucysalaglnleuargargileglyasp

151015

lysvalasnleuarggln

20

<210>91

<211>22

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400>91

valvalgluglyglulysgluvalglualaleulyslysseralaasp

151015

trpvalserasptrpser

20

<210>92

<211>23

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<220>

<221>mod_res

<222>(13)..(13)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至17位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(17)..(17)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至13位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(18)..(18)

<223>nle

<400>92

gluaspileileargasnilealaarghisleualaxaavalglyasp

151015

xaaxaaaspargseriletrp

20

<210>93

<211>21

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<220>

<221>mod_res

<222>(12)..(12)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至16位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(16)..(16)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至12位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(17)..(17)

<223>nle

<400>93

aspileileargasnilealaarghisleualaxaavalglyaspxaa

151015

xaaaspargserile

20

<210>94

<211>23

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<220>

<221>mod_res

<222>(13)..(13)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至17位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(17)..(17)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至13位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(18)..(18)

<223>nle

<400>94

gluaspileileargasnilealaarghisleualaxaavalgluasp

151015

xaaxaaaspargseriletrp

20

<210>95

<211>21

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<220>

<221>mod_res

<222>(12)..(12)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至16位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(16)..(16)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至12位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(17)..(17)

<223>nle

<400>95

aspileileargasnilealaarghisleualaxaavalgluaspxaa

151015

xaaaspargserile

20

<210>96

<211>22

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<220>

<221>mod_res

<222>(12)..(12)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至16位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(16)..(16)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至12位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(17)..(17)

<223>nle

<400>96

aspileileargasnilealaarghisleualaxaavalseraspxaa

151015

xaaaspargseriletrp

20

<210>97

<211>22

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<220>

<221>結(jié)合

<222>(1)..(1)

<223>具有n-末端標記，其為生物素附接于標記的殘基

<220>

<221>mod_res

<222>(12)..(12)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至16位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(16)..(16)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至12位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(17)..(17)

<223>nle

<400>97

aspileileargasnilealaarghisleualaxaavalglyaspxaa

151015

xaaaspargseriletrp

20

<210>98

<211>22

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<220>

<221>結(jié)合

<222>(1)..(1)

<223>具有n-末端標記，其為生物素附接于標記的殘基

<220>

<221>mod_res

<222>(12)..(12)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至16位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(16)..(16)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至12位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(17)..(17)

<223>nle

<400>98

aspileileargasnilealaarghisleualaxaavalgluaspxaa

151015

xaaaspargseriletrp

20

<210>99

<211>23

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<220>

<221>mod_res

<222>(8)..(8)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至12位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(12)..(12)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至8位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(18)..(18)

<223>nle

<400>99

gluaspileileargasnilexaaarghisleuxaaglnvalglyasp

151015

serxaaaspargseriletrp

20

<210>100

<211>21

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<220>

<221>mod_res

<222>(7)..(7)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至11位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至7位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(17)..(17)

<223>nle

<400>100

aspileileargasnilexaaarghisleuxaaglnvalglyaspser

151015

xaaaspargserile

20

<210>101

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<220>

<221>mod_res

<222>(4)..(4)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至8位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(8)..(8)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至4位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(14)..(14)

<223>nle

<400>101

argasnilexaaarghisleuxaaglnvalglyaspserxaaasparg

151015

trp

<210>102

<211>23

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<220>

<221>mod_res

<222>(8)..(8)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至12位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(12)..(12)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至8位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(18)..(18)

<223>nle

<400>102

gluaspileileargasnilexaaarghisleuxaaglnvalgluasp

151015

serxaaaspargseriletrp

20

<210>103

<211>22

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<220>

<221>結(jié)合

<222>(1)..(1)

<223>具有n-末端標記，其為生物素附接于標記的殘基

<220>

<221>mod_res

<222>(7)..(7)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至11位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至7位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(17)..(17)

<223>nle

<400>103

aspileileargasnilexaaarghisleuxaaglnvalglyaspser

151015

xaaaspargseriletrp

20

<210>104

<211>21

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<220>

<221>結(jié)合

<222>(1)..(1)

<223>具有n-末端標記，其為生物素附接于標記的殘基

<220>

<221>mod_res

<222>(7)..(7)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至11位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至7位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(17)..(17)

<223>nle

<400>104

aspileileargasnilexaaarghisleuxaaglnvalgluaspser

151015

xaaaspargserile

20

<210>105

<211>23

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<220>

<221>mod_res

<222>(9)..(9)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至13位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(13)..(13)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至9位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(18)..(18)

<223>nle

<400>105

gluaspileileargasnilealaxaahisleualaxaavalglyasp

151015

serxaaaspargseriletrp

20

<210>106

<211>23

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<220>

<221>mod_res

<222>(10)..(10)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至17位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(17)..(17)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至10位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(18)..(18)

<223>nle

<400>106

gluaspileileargasnilealaargxaaleualaglnvalglyasp

151015

xaaxaaaspargseriletrp

20

<210>107

<211>23

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<220>

<221>mod_res

<222>(5)..(5)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至9位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(9)..(9)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至5位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(13)..(13)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至17位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(17)..(17)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至13位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(18)..(18)

<223>nle

<400>107

gluaspileilexaaasnilealaxaahisleualaxaavalglyasp

151015

xaaxaaaspargseriletrp

20

<210>108

<211>25

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<220>

<221>mod_res

<222>(14)..(14)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至18位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(15)..(15)

<223>nle

<220>

<221>mod_res

<222>(18)..(18)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至14位修飾的氨基酸而被替換

<400>108

asnleutrpalaalaglnargtyrglyarggluleuargxaaxaaser

151015

aspxaaphevalaspserphelyslys

2025

<210>109

<211>21

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<220>

<221>mod_res

<222>(12)..(12)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至16位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(16)..(16)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至12位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(17)..(17)

<223>nle

<400>109

aspileileargasnilealaarghisalaalaxaavalglyalaxaa

151015

xaaaspargserile

20

<210>110

<211>21

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<220>

<221>mod_res

<222>(12)..(12)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至16位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(16)..(16)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至12位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(17)..(17)

<223>nle

<400>110

aspileileargasnilealaarghisalaalaxaavalglualaxaa

151015

xaaaspargserile

20

<210>111

<211>21

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<220>

<221>mod_res

<222>(9)..(9)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至13位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(13)..(13)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至9位修飾的氨基酸而被替換

<400>111

iletrpilealaglngluleuargxaaileglyaspxaapheasnala

151015

tyrtyralaargarg

20

<210>112

<211>23

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<220>

<221>mod_res

<222>(18)..(18)

<223>nle

<400>112

gluaspileileargasnilealaarghisleualaglnvalglyasp

151015

serxaaaspargseriletrp

20

<210>113

<211>23

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<220>

<221>mod_res

<222>(13)..(13)

<223>5-碳烯屬氨基酸的s對映異構(gòu)體

<220>

<221>mod_res

<222>(17)..(17)

<223>5-碳烯屬氨基酸的s對映異構(gòu)體

<220>

<221>mod_res

<222>(18)..(18)

<223>nle

<400>113

gluaspileileargasnilealaarghisleualaxaavalglyasp

151015

xaaxaaaspargseriletrp

20

<210>114

<211>23

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<220>

<221>mod_res

<222>(13)..(13)

<223>5-碳烯屬氨基酸的s對映異構(gòu)體

<220>

<221>mod_res

<222>(17)..(17)

<223>5-碳烯屬氨基酸的s對映異構(gòu)體

<220>

<221>mod_res

<222>(18)..(18)

<223>nle

<400>114

gluaspileileargasnilealaarghisleualaxaavalgluasp

151015

xaaxaaaspargseriletrp

20

<210>115

<211>23

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<220>

<221>mod_res

<222>(8)..(8)

<223>5-碳烯屬氨基酸的s對映異構(gòu)體

<220>

<221>mod_res

<222>(12)..(12)

<223>5-碳烯屬氨基酸的s對映異構(gòu)體

<220>

<221>mod_res

<222>(18)..(18)

<223>nle

<400>115

gluaspileileargasnilexaaarghisleuxaaglnvalglyasp

151015

serxaaaspargseriletrp

20

<210>116

<211>23

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<220>

<221>mod_res

<222>(9)..(9)

<223>5-碳烯屬氨基酸的s對映異構(gòu)體

<220>

<221>mod_res

<222>(13)..(13)

<223>5-碳烯屬氨基酸的s對映異構(gòu)體

<220>

<221>mod_res

<222>(18)..(18)

<223>nle

<400>116

gluaspileileargasnilealaxaahisleualaxaavalglyasp

151015

serxaaaspargseriletrp

20

<210>117

<211>23

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<220>

<221>mod_res

<222>(10)..(10)

<223>5-碳烯屬氨基酸的r對映異構(gòu)體

<220>

<221>mod_res

<222>(17)..(17)

<223>5-碳烯屬氨基酸的s對映異構(gòu)體

<220>

<221>mod_res

<222>(18)..(18)

<223>nle

<400>117

gluaspileileargasnilealaargxaaleualaglnvalglyasp

151015

xaaxaaaspargseriletrp

20

<210>118

<211>24

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<220>

<221>mod_res

<222>(1)..(1)

<223>beta-ala

<220>

<221>mod_res

<222>(14)..(14)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至18位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(18)..(18)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至14位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(19)..(19)

<223>nle

<400>118

xaagluaspileileargasnilealaarghisleualaxaavalglu

151015

aspxaaxaaaspargseriletrp

20

<210>119

<211>24

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<220>

<221>mod_res

<222>(1)..(1)

<223>beta-ala

<220>

<221>mod_res

<222>(14)..(14)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至18位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(18)..(18)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至14位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(19)..(19)

<223>nle

<400>119

xaagluaspileileargasnilealaarghisleualaxaavalglu

151015

aspxaaxaaaspargseriletrp

20

<210>120

<211>22

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<220>

<221>mod_res

<222>(1)..(1)

<223>beta-ala

<220>

<221>mod_res

<222>(13)..(13)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至17位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(17)..(17)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至13位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(18)..(18)

<223>nle

<400>120

xaaaspileileargasnilealaarghisleualaxaavalglyasp

151015

xaaxaaaspargserile

20

<210>121

<211>22

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<220>

<221>mod_res

<222>(1)..(1)

<223>beta-ala

<220>

<221>mod_res

<222>(13)..(13)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至17位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(17)..(17)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至13位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(18)..(18)

<223>nle

<400>121

xaaaspileileargasnilealaarghisleualaxaavalgluasp

151015

xaaxaaaspargserile

20

<210>122

<211>22

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<220>

<221>mod_res

<222>(1)..(1)

<223>beta-ala

<220>

<221>mod_res

<222>(10)..(10)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至14位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(14)..(14)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至10位修飾的氨基酸而被替換

<400>122

xaailetrpilealaglngluleuargxaaileglyaspxaapheasn

151015

alatyrtyralaargarg

20

<210>123

<211>26

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<220>

<221>mod_res

<222>(1)..(1)

<223>beta-ala

<220>

<221>mod_res

<222>(15)..(15)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至19位修飾的氨基酸而被替換

<220>

<221>mod_res

<222>(16)..(16)

<223>nle

<220>

<221>mod_res

<222>(19)..(19)

<223>修飾的氨基酸，其側(cè)鏈已通過交聯(lián)至15位修飾的氨基酸而被替換

<400>123

xaaasnleutrpalaalaglnargtyrglyarggluleuargxaaxaa

151015

seraspxaaphevalaspserphelyslys

2025

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