本發(fā)明涉及一種特異性結(jié)合上皮細(xì)胞黏附分子(epcam)的靶分子多肽及其制備方法。具體而言，本發(fā)明提供了具有較高的epcam的靶向結(jié)合的生物學(xué)活性的靶分子多肽。

背景技術(shù)：

巴雷特食管

胃食管反流(gastroesophagealrefluxdisease，gerd)所引發(fā)的食管黏膜伴有杯狀細(xì)胞的腸上皮化生，即barrett食管(barrett’sesophagus,be)，研究表明食管腺癌幾乎均來源于be，60％以上的胃食管結(jié)合部腺癌和賁門癌來源于be。be產(chǎn)生的主要原因是長期慢性的胃食管反流(gastroesophagealrefluxdisease，gerd)。食管上皮在膽汁酸的長期侵蝕下沿腸上皮化生(be)-低度異型增生(lowgradedysplasia,lgd)-高度異型增生(highgradedysplasia,hgd)-腺癌的趨勢發(fā)生惡變。目前，對于be患者推薦進(jìn)行定期內(nèi)窺鏡監(jiān)測，hgd與早期ea要求行手術(shù)切除。然而，hgd與早期ea結(jié)構(gòu)扁平，沒有明顯的結(jié)構(gòu)異常和結(jié)節(jié)，在內(nèi)窺鏡下很難辨別。通常采用的四象限隨機(jī)取樣活檢或是在可疑區(qū)域的定向活檢均容易漏診。因此，隨著對be分子生物學(xué)認(rèn)識的加深和傳統(tǒng)療法的缺陷，be的檢測和治療日趨向靶向化和個(gè)體化。

小分子多肽在靶向治療中的研究進(jìn)展

以小分子肽作為導(dǎo)向，構(gòu)建治療或診斷性的靶向藥物具有成本低，免疫原性小，組織滲透性好的優(yōu)點(diǎn)，而且很多小分子多肽與其配體的親合力很高，不亞于抗體與抗原的親和?？梢宰鳛閷?dǎo)向的小分子肽包括兩大類，一類是天然存在的，如生長激素釋放抑制因子(somatostatin)、血管活性腸肽(vasoactiveintestinalpeptide,vip)等，它們分別在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、消化道腫瘤等的特異性診斷和治療發(fā)揮了良好的導(dǎo)向性作用。另一類則是非天然存在的肽，與天然肽相比，該類肽的種類更多，鑒定更方便，而且有可能比天然肽與其相應(yīng)受體的親和力更高，故該類肽成為近年來人們關(guān)注的熱點(diǎn)。噬菌體隨機(jī)呈現(xiàn)肽庫篩選被認(rèn)為是用于該類肽篩選的快速而有效的方法。

小分子多肽在靶向治療中的應(yīng)用

靶向性的小分子多肽作為診斷試劑，可以偶聯(lián)放射性核素，同位素，熒光素等結(jié)合pet，ect或熒光內(nèi)窺鏡進(jìn)行疾病診斷。作為治療用，它們可以偶聯(lián)化療藥物，基因工程蛋白藥物，基因治療藥物構(gòu)建腫瘤靶向性新藥，增加抗腫瘤藥物在腫瘤局部的藥物濃度，提高抗腫瘤效果，降低系統(tǒng)毒性。靶向腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面整合素分子的rgd-阿霉素在達(dá)到相同治療效果的同時(shí)，用量僅是單純阿霉素組的1/40；靶向腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面cd13分子的ngr-人腫瘤壞死因子聯(lián)合順鉑治療難治性實(shí)體瘤具有系統(tǒng)毒性低，患者順應(yīng)性好的特點(diǎn)；ngr-阿霉素比普通阿霉素抑制腫瘤生長多40％；靶向人臍靜脈細(xì)胞的sigyplp-腺病毒的基因轉(zhuǎn)染效率是單純腺病毒載體的15.5倍；rgd-腫瘤壞死因子能提高腫瘤局部藥物濃度，增加腫瘤壞死因子的治療指數(shù)。大量的基礎(chǔ)和臨床實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí)了小分子多肽導(dǎo)向在腫瘤靶向治療方面的潛能。

食管腺癌特異性結(jié)合作用的小分子多肽的靶分子的研究前景

目前的研究資料顯示be發(fā)展為ea過程中，很多分子的表達(dá)發(fā)生改變。例如：鱗狀上皮轉(zhuǎn)錄因子p63，sox2，pax9在hgd組織中表達(dá)下調(diào)；腸道上皮轉(zhuǎn)錄因子cdx2在經(jīng)膽汁酸處理的鱗狀上皮細(xì)胞表達(dá)上調(diào)；骨形成蛋白bmp4在gerd患者的食管上皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)；bmp4的上游信號分子shh在ea組織表達(dá)上調(diào)；一種新發(fā)現(xiàn)的膽汁酸受體tgr5在ea組織表達(dá)上調(diào)等。此外，c-erbb2，egfr，src，k-ras，cyclind1，p16，p27，apc，p53等多種表皮因子受體、蛋白激酶、原癌基因被發(fā)現(xiàn)與be惡變相關(guān)。研究成果盡管眾多，可是ea至今沒有明確的特異性腫瘤標(biāo)志物，為腫瘤靶向治療和多肽導(dǎo)向抗腫瘤藥物研究帶來困難。食管腺癌特異性結(jié)合作用的小分子多肽的靶分子很有可能就是食管腺癌的特異性腫瘤標(biāo)志物，對于腫瘤靶向治療意義重大，也為食管腺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制積累線索。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種特異性結(jié)合上皮細(xì)胞黏附分子(簡寫為epcam)的靶分子多肽，所述靶分子多肽包含氨基酸序列snfymplgggsk，或者所述靶分子多肽包含氨基酸序列snfymplgggsk中取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的氨基酸序列且具有特異性結(jié)合上皮細(xì)胞黏附分子活性的多肽。

優(yōu)選地，所述靶分子多肽的氨基酸序列為snfymplgggsk。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述靶分子多肽的制備方法，所述方法包括以fmoc-固相多肽合成法合成粗品多肽。

優(yōu)選地，所述方法還包括使用c18或c8柱對所述粗品多肽進(jìn)行分離純化。

優(yōu)選地，在所述fmoc-固相多肽合成法中，以三苯氯甲基樹脂、4-甲基-三苯氯甲基樹脂、4-甲氧基-三苯氯甲基樹脂、2-氯-三苯氯甲基樹脂或王樹脂中的任何一種為固相載體。

優(yōu)選地，本發(fā)明的目的在于，通過以n,n-二異丙基碳化二亞胺/1-羥基-苯并-三氮唑(dic/hobt)、n,n-二異丙基碳化二亞胺/n-羥基-7-偶氮苯并三氮唑(dic/hoat)、7-氮雜苯并唑-1-基-氧-(三-(二甲胺基)膦)六氟磷酸鹽/1-羥基-苯并-三氮唑(bop/hobt)、7-氮雜苯并唑-1-基-氧-(三-(二甲胺基)膦)六氟磷酸鹽/1-羥基-苯并-三氮唑/n-羥基-7-偶氮苯并三氮唑(bop/hoat)、苯并三氮唑-n,n,n’,n’-四甲基脲六氟磷酸酯/1-羥基-苯并-三氮唑(hbtu/hobt)、苯并三氮唑-n,n,n’,n’-四甲基脲六氟磷酸酯/n-羥基-7-偶氮苯并三氮唑(hbtu/hoat)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n’,n’-四甲基脲六氟磷酸酯/1-羥基-苯并-三氮唑(hatu/hobt)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n’,n’-四甲基脲六氟磷酸酯/n-羥基-7-偶氮苯并三氮唑(hatu/hoat)或6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯/1-羥基-苯并-三氮唑(hctu/hobt)中的一種為縮合劑進(jìn)行接肽反應(yīng)中的一種為縮合劑進(jìn)行接肽反應(yīng)，獲得保護(hù)的snfymplgggsk十二肽樹脂。

優(yōu)選地，在得到保護(hù)的靶分子多肽樹脂后，同步進(jìn)行脫側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)及切肽，獲得靶分子多肽粗品。再經(jīng)c18(或c8)柱分離純化，冷凍干燥后，制得得純度達(dá)98％以上的一種特異性結(jié)合上皮細(xì)胞黏附分子的靶分子多肽(以下簡寫為十二肽或snf十二肽)。

優(yōu)選地，其中粗品經(jīng)c18或c8色譜柱分離純化的步驟為：

將靶分子多肽粗品溶于水溶液中，過濾，濾液經(jīng)c18或c8色譜柱純化，流動相有兩種：a：0.1％三氟乙酸加99.9％水；b：0.1％三氟乙酸加99.9％乙腈；梯度洗脫；流速為1-150ml/min；檢測波長為：215～285nm；用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液，凍干，獲得成品。

所獲得的食管腺癌特異性結(jié)合多肽具有生物學(xué)活性，具有與epcam較高的靶向結(jié)合能力。通過rna干涉實(shí)驗(yàn)，熒光偏振實(shí)驗(yàn)，免疫熒光實(shí)驗(yàn)，測定該蛋白質(zhì)活性和靶向結(jié)合能力，結(jié)果表明，食管腺癌特異性結(jié)合多肽snfympl具有較高的epcam的靶向結(jié)合能力。且該方法僅使用一個(gè)層析柱就完成了目的蛋白的分離純化，步驟簡單、快速、成本低，為食管腺癌的診斷和治療以及上皮細(xì)胞黏附分子在腫瘤診斷治療中的作用奠定了進(jìn)一步研究和廣泛應(yīng)用的基礎(chǔ)。

另外，為了進(jìn)行食管腺癌特異性結(jié)合十二肽snf與上皮細(xì)胞黏附分子epcam的靶向性驗(yàn)證，利用轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證靶分子在食管腺癌細(xì)胞中的表達(dá)，利用熒光偏振，rna干涉和免疫熒光測定十二肽與靶分子的親和力，鑒定十二肽的靶分子。

此外，本發(fā)明提供的化學(xué)合成法獨(dú)具優(yōu)勢。其有益效果是：本發(fā)明snf十二肽固相合成制備方法具有以下特點(diǎn)：原輔材料來源方便，工藝穩(wěn)定，收率高，質(zhì)量可控，產(chǎn)品純度高，生產(chǎn)周期短，成本低，可規(guī)模化生產(chǎn)。采用本發(fā)明方法制備的snf十二肽極具市場競爭力，其生產(chǎn)規(guī)模完全能夠滿足snf十二肽的應(yīng)用需求，其質(zhì)量完全能夠達(dá)到snf十二肽的應(yīng)用要求。

另外，在本發(fā)明的工藝中，采用溫和的fmoc路線，每步脫fmoc僅用20％的pip，每步縮合反應(yīng)時(shí)間短，大大縮短了生產(chǎn)周期；采用合理封閉技術(shù)，提高粗肽產(chǎn)品的純度；切割采用tfa，避免了常用的氟化氫，減少了生產(chǎn)中產(chǎn)生的三廢，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說明

圖1熒光偏振結(jié)果

圖2rna干涉后食管腺癌細(xì)胞中epcam在mrna水平的表達(dá)

圖3rna干涉后食管腺癌細(xì)胞中epcam在蛋白水平的表達(dá)

圖4rna干涉后食管腺癌細(xì)胞的免疫熒光結(jié)果

具體實(shí)施方式

以下通過實(shí)施例更為詳細(xì)地說明本發(fā)明，但這并不意味著本發(fā)明的保護(hù)范圍受這些實(shí)施例限制。

按照本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：通過以三苯氯甲基樹脂、4-甲基-三苯氯甲基樹脂、4-甲氧基-三苯氯甲基樹脂、2-氯-三苯氯甲基樹脂或王樹脂中的任何一種為起始原料，用dic/hobt或dic/hoat或bop/hobt或bop/hoat或hbtu/hobt或hbtu/hoat或hatu/hobt或hatu/hoat或hctu/hobt中的一種為縮合劑進(jìn)行接肽反應(yīng)，獲得保護(hù)snfymplgggsk十二肽樹脂，其后，同步進(jìn)行脫側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)及切肽，獲得snfymplgggsk粗品，再經(jīng)c18(或c8)柱分離純化，冷凍干燥后，制得得純度達(dá)98％以上的snf十二肽。所獲得的食管腺癌特異性結(jié)合多肽具有生物學(xué)活性，具有與epcam較高的靶向結(jié)合能力。通過rna干涉實(shí)驗(yàn)，熒光偏振實(shí)驗(yàn)，免疫熒光實(shí)驗(yàn)，測定該蛋白質(zhì)活性和靶向結(jié)合能力，結(jié)果表明，食管腺癌特異性結(jié)合多肽snfymplgggsk具有較高的epcam的靶向結(jié)合能力。且該方法僅使用一個(gè)層析柱就完成了目的蛋白的分離純化，步驟簡單、快速、成本低，為食管腺癌的診斷和治療以及上皮細(xì)胞黏附分子在腫瘤診斷治療中的作用奠定了進(jìn)一步研究和廣泛應(yīng)用的基礎(chǔ)。

實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)方案，總體方案按照以下步驟進(jìn)行：

1)多肽合成。

(1)制備fmoc-lys(boc)-樹脂：

以三苯氯甲基樹脂、4-甲基-三苯氯甲基樹脂、4-甲氧基-三苯氯甲基樹脂、2-氯-三苯氯甲基樹脂或王氏樹脂其中的一種作樹脂，用n,n-二甲基甲酰胺或二氯甲烷浸泡10～60分鐘，混合物中，樹脂的重量體積濃度為5-20ml/g；

然后在上述的樹脂中，加入n,n'-二異丙基乙胺(diea)、n,n-二異丙基碳化二亞胺(dic)或4-二甲氨基吡啶(dmap)、fmoc-val-oh，10～50℃反應(yīng)0.5～5小時(shí)，再加入封閉試劑甲醇、苯甲酰氯或吡啶10～50℃反應(yīng)0.2-3小時(shí)，樹脂用異丙醇、n,n-二甲基甲酰胺洗滌，獲得fmoc-lys(boc)-樹脂；

diea或dmap的摩爾數(shù)為樹脂的2～20倍；

fmoc-lys(boc)-oh的摩爾數(shù)為樹脂的1～10倍：

反應(yīng)溶液中，樹脂的濃度為0.5～5ml/g；

(2)制備fmoc-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂：

在步驟(1)的fmoc-lys(boc)-樹脂中，加入脫帽試劑10～50℃反應(yīng)5～30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10～50℃反應(yīng)10～60分鐘，抽干，用異丙醇、dmf、重蒸過的dmf洗滌，加入用dmf溶解的fmoc-ser(tbu)-oh、diea和tbtu/hobt、hbtu/hobt或bop/hobt中的至少一種混合物，10～50℃反應(yīng)10～60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇、dmf、重蒸過的dmf洗滌，抽干，獲得fmoc-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂；

所說的脫帽試劑的組分和體積比為：pip：dmf＝1：2-5；

fmoc-ser(tbu)-oh的摩爾數(shù)為樹脂的1-5倍；

fmoc-lys(boc)-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5～20ml/g；

tbtu/hbtu/bop的摩爾數(shù)為樹脂的2-5倍；

hobt/hoat摩爾數(shù)為樹脂的2-5倍；

(3)制備fmoc-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂：

在步驟(2)的fmoc-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂中，加入脫帽試劑10～50℃反應(yīng)5～30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10～50℃反應(yīng)10～60分鐘，抽干，用異丙醇、dmf、重蒸過的dmf洗滌，加入用dmf溶解的fmoc-ser(tbu)-oh、diea和tbtu/hobt、hbtu/hobt或bop/hobt中的至少一種混合物，10～50℃反應(yīng)10～60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇、dmf、重蒸過的dmf洗滌，抽干，獲得fmoc-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂；

所說的脫帽試劑的組分和體積比為：pip：dmf＝1：2-5；

fmoc-gly-oh摩爾數(shù)為樹脂的2～5倍；

fmoc-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5～20ml/g；

tbtu/hbtu/bop的摩爾數(shù)為樹脂的2-5倍；

hobt/hoat摩爾數(shù)為樹脂的2-5倍；

(4)制備fmoc-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂：

在步驟(3)的fmoc-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂中，加入脫帽試劑10～50℃反應(yīng)5～30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10～50℃反應(yīng)10～60分鐘，抽干，用異丙醇、dmf、重蒸過的dmf洗滌，加入用dmf溶解的fmoc-ser(tbu)-oh、diea和tbtu/hobt、hbtu/hobt或bop/hobt中的至少一種混合物，10～50℃反應(yīng)10～60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇、dmf、重蒸過的dmf洗滌，抽干，獲得fmoc-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂；

所說的脫帽試劑的組分和體積比為：pip：dmf＝1：2-5；

fmoc-gly-oh摩爾數(shù)為樹脂的2～5倍；

fmoc-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5～20ml/g；

tbtu/hbtu/bop的摩爾數(shù)為樹脂的2-5倍；

hobt/hoat摩爾數(shù)為樹脂的2-5倍；

(5)制備fmoc-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂：

在步驟(4)的fmoc-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂中，加入脫帽試劑10～50℃反應(yīng)5～30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10～50℃反應(yīng)10～60分鐘，抽干，用異丙醇、dmf、重蒸過的dmf洗滌，加入用dmf溶解的fmoc-ser(tbu)-oh、diea和tbtu/hobt、hbtu/hobt或bop/hobt中的至少一種混合物，10～50℃反應(yīng)10～60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇、dmf、重蒸過的dmf洗滌，抽干，獲得fmoc-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂；

所說的脫帽試劑的組分和體積比為：pip：dmf＝1：2-5；

fmoc-gly-oh摩爾數(shù)為樹脂的2～5倍；

fmoc-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5～20ml/g；

tbtu/hbtu/bop的摩爾數(shù)為樹脂的2-5倍；

hobt/hoat摩爾數(shù)為樹脂的2-5倍；

(6)制備fmoc-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂：

在步驟(5)的fmoc-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂中，加入脫帽試劑10～50℃反應(yīng)5～30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10～50℃反應(yīng)10～60分鐘，抽干，用異丙醇、dmf、重蒸過的dmf洗滌，加入用dmf溶解的fmoc-ser(tbu)-oh、diea和tbtu/hobt、hbtu/hobt或bop/hobt中的至少一種混合物，10～50℃反應(yīng)10～60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇、dmf、重蒸過的dmf洗滌，抽干，獲得fmoc-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂；

所說的脫帽試劑的組分和體積比為：pip：dmf＝1：2-5；

fmoc-leu-oh摩爾數(shù)為樹脂的2～5倍：

fmoc-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5～20ml/g；

tbtu/hbtu/bop的摩爾數(shù)為樹脂的2-5倍；

hobt/hoat摩爾數(shù)為樹脂的2-5倍；

(7)制備fmoc-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂：

在步驟(6)的fmoc-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂中，加入脫帽試劑10～50℃反應(yīng)5～30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10～50℃反應(yīng)10～60分鐘，抽干，用異丙醇、dmf、重蒸過的dmf洗滌，加入用dmf溶解的fmoc-ser(tbu)-oh、diea和tbtu/hobt、hbtu/hobt或bop/hobt中的至少一種混合物，10～50℃反應(yīng)10～60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇、dmf、重蒸過的dmf洗滌，抽干，獲得fmoc-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂；

所說的脫帽試劑的組分和體積比為：pip：dmf＝1：2-5；

fmoc-pro-oh摩爾數(shù)為樹脂的2～5倍：

fmoc-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5～20ml/g；

tbtu/hbtu/bop的摩爾數(shù)為樹脂的2-5倍；

hobt/hoat摩爾數(shù)為樹脂的2-5倍；

(8)制備fmoc-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂：

在步驟(7)的fmoc-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂中，加入脫帽試劑10～50℃反應(yīng)5～30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10～50℃反應(yīng)10～60分鐘，抽干，用異丙醇、dmf、重蒸過的dmf洗滌，加入用dmf溶解的fmoc-ser(tbu)-oh、diea和tbtu/hobt、hbtu/hobt或bop/hobt中的至少一種混合物，10～50℃反應(yīng)10～60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇、dmf、重蒸過的dmf洗滌，抽干，獲得fmoc-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂；

所說的脫帽試劑的組分和體積比為：pip：dmf＝1：2-5；

fmoc-met-oh摩爾數(shù)為樹脂的2～5倍：

fmoc-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5～20ml/g；

tbtu/hbtu/bop的摩爾數(shù)為樹脂的2-5倍；

hobt/hoat摩爾數(shù)為樹脂的2-5倍；

(9)制備fmoc-tyr(tbu)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂：

在步驟(8)的fmoc-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂中，加入脫帽試劑10～50℃反應(yīng)5～30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10～50℃反應(yīng)10～60分鐘，抽干，用異丙醇、dmf、重蒸過的dmf洗滌，加入用dmf溶解的fmoc-ser(tbu)-oh、diea和tbtu/hobt、hbtu/hobt或bop/hobt中的至少一種混合物，10～50℃反應(yīng)10～60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇、dmf、重蒸過的dmf洗滌，抽干，獲得fmoc-tyr(tbu)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂；

所說的脫帽試劑的組分和體積比為：pip：dmf＝1：2-5；

fmoc-tyr(tbu)-oh摩爾數(shù)為樹脂的2～5倍：

fmoc-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5～20ml/g；

tbtu/hbtu/bop的摩爾數(shù)為樹脂的2-5倍；

hobt/hoat摩爾數(shù)為樹脂的2-5倍；

(10)制備

fmoc-phe-tyr(tbu)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂：

在步驟(9)的

fmoc-tyr(tbu)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂中，加入脫帽試劑10～50℃反應(yīng)5～30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10～50℃反應(yīng)10～60分鐘，抽干，用異丙醇、dmf、重蒸過的dmf洗滌，加入用dmf溶解的fmoc-ser(tbu)-oh、diea和tbtu/hobt、hbtu/hobt或bop/hobt中的至少一種混合物，10～50℃反應(yīng)10～60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇、dmf、重蒸過的dmf洗滌，抽干，獲得fmoc-phe-tyr(tbu)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂樹脂；

所說的脫帽試劑的組分和體積比為：pip：dmf＝1：2-5；

fmoc-phe-oh摩爾數(shù)為樹脂的2～5倍：

fmoc-tyr(tbu)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5～20ml/g；

tbtu/hbtu/bop的摩爾數(shù)為樹脂的2-5倍；

hobt/hoat摩爾數(shù)為樹脂的2-5倍；

(11)制備

fmoc-asn(trt)-phe-tyr(tbu)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂：

在步驟(10)的

fmoc-phe-tyr(tbu)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂中，加入脫帽試劑10～50℃反應(yīng)5～30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10～50℃反應(yīng)10～60分鐘，抽干，用異丙醇、dmf、重蒸過的dmf洗滌，加入用dmf溶解的fmoc-ser(tbu)-oh、diea和tbtu/hobt、hbtu/hobt或bop/hobt中的至少一種混合物，10～50℃反應(yīng)10～60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇、dmf、重蒸過的dmf洗滌，抽干，獲得fmoc-sn(trt)-phe-tyr(tbu)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂；

所說的脫帽試劑的組分和體積比為：pip：dmf＝1：2-5；

fmoc-asn(trt)-oh摩爾數(shù)為樹脂的2～5倍：

fmoc-phe-tyr(tbu)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5～20ml/g；

tbtu/hbtu/bop的摩爾數(shù)為樹脂的2-5倍；

hobt/hoat摩爾數(shù)為樹脂的2-5倍；

(12)制備

fmoc-ser(tbu)-asn(trt)-phe-tyr(tbu)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂：

在步驟(11)的

fmoc-asn(trt)-phe-tyr(tbu)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂中，加入脫帽試劑10～50℃反應(yīng)5～30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10～50℃反應(yīng)10～60分鐘，抽干，用異丙醇、dmf、重蒸過的dmf洗滌，加入用dmf溶解的fmoc-ser(tbu)-oh、diea、tbtu/hobt或hbtu/hobt或bop/hobt的混合物，10～50℃反應(yīng)10～60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇、dmf、重蒸過的dmf洗滌，抽干，獲得

fmoc-ser(tbu)-asn(trt)-phe-tyr(tbu)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂；

所說的脫帽試劑的組分和體積比為：pip：dmf＝1：2-5；

fmoc-ser(tbu)-oh摩爾數(shù)為樹脂的2～5倍：

fmoc-asn(trt)-phe-tyr(tbu)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5～20ml/g；

tbtu/hbtu/bop的摩爾數(shù)為樹脂的2-5倍；

hobt/hoat摩爾數(shù)為樹脂的2-5倍；

(13)制備

ser(tbu)-asn(trt)-phe-tyr(tbu)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂：

在步驟(12)的

fmoc-ser(tbu)-asn(trt)-phe-tyr(tbu)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂中，加入脫帽試劑10～50℃反應(yīng)5～30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10～50℃反應(yīng)10～60分鐘，抽干，用異丙醇、dmf、重蒸過的dmf洗滌，甲醇洗滌2次，用甲醇浸泡0.5～3小時(shí)，抽干，用氮?dú)獯蹈蓸渲筛稍锏念w粒，所得到的樹脂為ser(tbu)-asn(trt)-phe-tyr(tbu)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂；

(14)粗品的獲得

把吹干的

ser(tbu)-asn(trt)-phe-tyr(tbu)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbu)-lys(boc)-樹脂倒入玻璃的切割瓶中，加入預(yù)冷至-20～10℃的切肽試劑(tfa/edt/h2o/thio＝90-95/2-5/2-5/1-5，體積比)，10℃-50℃反應(yīng)1-5小時(shí)，過濾除去樹脂，加-20～10℃的冰乙醚沉淀，離心收集沉淀物，用乙醚洗滌1～6次，低溫冷凍干燥10～24小時(shí)，獲得作為十二肽的靶分子多肽粗品；

切肽試劑中，樹脂的濃度為：5～50ml/g。

優(yōu)選的是其還包括粗品經(jīng)c18或c8色譜柱分離純化的步驟。

更優(yōu)選的是，其中粗品經(jīng)c18或c8色譜柱分離純化的步驟為：

將snf十二肽粗品溶于水溶液中，過濾，濾液經(jīng)c18或c8色譜柱純化，流動相有兩種：a：0.1％三氟乙酸加99.9％水；b：0.1％三氟乙酸加99.9％乙腈；梯度洗脫；流速為1-150ml/min；檢測波長為：215～285nm；用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液，凍干，獲得成品。

在本文中，如未特別指出，“常溫”表示室溫，即25℃。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明snf十二肽固相合成制備方法具有以下特點(diǎn)：原輔材料來源方便，工藝穩(wěn)定，收率高，質(zhì)量可控，產(chǎn)品純度高，生產(chǎn)周期短，成本低，可規(guī)?；a(chǎn)。采用本發(fā)明方法制備的snf十二肽極具市場競爭力，其生產(chǎn)規(guī)模完全能夠滿足snf十二肽的應(yīng)用需求，其質(zhì)量完全能夠達(dá)到snf十二肽的應(yīng)用要求。

另外，在本發(fā)明的工藝中，采用溫和的fmoc路線，每步脫fmoc僅用20％的pip，每步縮合反應(yīng)時(shí)間短，大大縮短了生產(chǎn)周期；采用合理封閉技術(shù)，提高粗肽產(chǎn)品的純度；切割采用tfa，避免了常用的氟化氫，減少了生產(chǎn)中產(chǎn)生的三廢，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。

前述過程中所采用的原料中英文列表1如下：

表1

實(shí)施例11g級別二氯樹脂(2clresin)的snf十二肽合成過程

(1)制備fmoe-lys(boc)-2clresin

稱取二氯樹脂1g(吉爾生化(上海)有限公司；loadding：1.0mmol/g)倒入反應(yīng)柱中，加入大約10mldcm，浸泡30分鐘(常溫)后用真空泵抽干，加入fmoc-lys(boc)-oh0.25g，diea0.9ml，dcm20ml，于常溫反應(yīng)2小時(shí)，再加入封閉試劑甲醇，常溫反應(yīng)3小時(shí)，樹脂用異丙醇洗滌3次，dmf洗滌3次，重蒸過的dmf洗滌2次，抽干，獲得fmoc-lys(boc)-2clresin；

(2)制備fmoc-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin

在步驟(1)的fmoe-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin中，加入脫帽試劑(20％哌啶的dmf溶液)，常溫反應(yīng)5分鐘，抽干，重新加入脫帽劑常溫反應(yīng)20分鐘，用異丙醇洗滌3次，dmf洗滌3次，重蒸過的dmf洗滌2次，抽干，加入fmoc-ser(tbn)-oh0.7g，diea0.4ml，tbtu0.34g，hobt1ml，dmf10ml常溫反應(yīng)1.5小時(shí)，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌3次，dmf洗滌3次，重蒸過的dmf洗滌2次，抽干，獲得fmoc-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin；

(3)制備fmoc-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin

在步驟(2)的fmoc-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin中，加入脫帽試劑(20％哌啶的dmf溶液)，常溫反應(yīng)5分鐘，抽干，重新加入脫帽劑常溫反應(yīng)20分鐘，用異丙醇洗滌3次，dmf洗滌3次，重蒸過的dmf洗滌2次，抽干，加入fmoc-gly-oh0.37g，diea0.4ml，tbtu0.38g，dmf10ml常溫反應(yīng)37min，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌3次，dmf洗滌3次，重蒸過的dmf洗滌2次，抽干，獲得fmoc-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin；

(4)制備fmoc-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin

在步驟(3)的fmoc-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin中，加入脫帽試劑(20％哌啶的dmf溶液)，常溫反應(yīng)5分鐘，抽干，重新加入脫帽劑常溫反應(yīng)20分鐘，用異丙醇洗滌3次，dmf洗滌3次，重蒸過的dmf洗滌2次，抽干，加入fmoc-gly-oh0.36g，diea0.4ml，tbtu0.38g，dmf10ml常溫反應(yīng)71min，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌3次，dmf洗滌3次，重蒸過的dmf洗滌2次，抽干，獲得fmoc-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin；

(5)制備fmoc-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin

在步驟(4)的fmoc-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin中，加入脫帽試劑(20％哌啶的dmf溶液)，常溫反應(yīng)5分鐘，抽干，重新加入脫帽劑常溫反應(yīng)20分鐘，用異丙醇洗滌3次，dmf洗滌3次，重蒸過的dmf洗滌2次，抽干，加入fmoc-gly-oh0.38g，diea0.4ml，tbtu0.42g，dmf10ml常溫反應(yīng)94min，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌3次，dmf洗滌3次，重蒸過的dmf洗滌2次，抽干，獲得fmoc-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin；

(6)制備fmoc-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin

在步驟(5)的fmoc-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin中，加入脫帽試劑(20％哌啶的dmf溶液)，常溫反應(yīng)5分鐘，抽干，重新加入脫帽劑常溫反應(yīng)20分鐘，用異丙醇洗滌3次，dmf洗滌3次，重蒸過的dmf洗滌2次，抽干，加入fmoc-leu-oh0.43g，diea0.4ml，tbtu0.37g，dmf10ml常溫反應(yīng)74min，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌3次，dmf洗滌3次，重蒸過的dmf洗滌2次，抽干，獲得fmoc-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin；

(7)制備fmoc-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin

在步驟(6)的fmoc-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin中，加入脫帽試劑(20％哌啶的dmf溶液)，常溫反應(yīng)5分鐘，抽干，重新加入脫帽劑常溫反應(yīng)20分鐘，用異丙醇洗滌3次，dmf洗滌3次，重蒸過的dmf洗滌2次，抽干，加入fmoc-pro-oh0.38g，diea0.4ml，tbtu0.37g，dmf10ml常溫反應(yīng)71min，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌3次，dmf洗滌3次，重蒸過的dmf洗滌2次，抽干，獲得fmoc--pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin；

(8)制備fmoc-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin

在步驟(7)的fmoc-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin中，加入脫帽試劑(20％哌啶的dmf溶液)，常溫反應(yīng)5分鐘，抽干，重新加入脫帽劑常溫反應(yīng)20分鐘，用異丙醇洗滌3次，dmf洗滌3次，重蒸過的dmf洗滌2次，抽干，加入fmoc-met-oh0.43g，diea0.4ml，tbtu0.37g，dmf10ml常溫反應(yīng)81min，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌3次，dmf洗滌3次，重蒸過的dmf洗滌2次，抽干，獲得fmoc-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin；

(9)制備

fmoc-tyr(tbn)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin

在步驟(8)的

fmoc-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin中，加入脫帽試劑(20％哌啶的dmf溶液)，常溫反應(yīng)5分鐘，抽干，重新加入脫帽劑常溫反應(yīng)20分鐘，用異丙醇洗滌3次，dmf洗滌3次，重蒸過的dmf洗滌2次，抽干，加入fmoc-tyr(tbn)-oh0.52g，diea0.4ml，tbtu0.36g，dmf10ml常溫反應(yīng)81min，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌3次，dmf洗滌3次，重蒸過的dmf洗滌2次，抽干，獲得fmoc-tyr(tbn)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin；

(10)制備

fmoc-phe-tyr(tbn)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin

在步驟(9)的fmoc-

tyr(tbn)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-

2clresin中，加入脫帽試劑(20％哌啶的dmf溶液)，常溫反應(yīng)5分鐘，抽干，重新加入脫帽劑常溫反應(yīng)20分鐘，用異丙醇洗滌3次，dmf洗滌3次，重蒸過的dmf洗滌2次，抽干，加入fmoc-phe-oh0.42g，diea0.4ml，tbtu0.36g，dmf10ml常溫反應(yīng)71min，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌3次，dmf洗滌3次，重蒸過的dmf洗滌2次，抽干，獲得fmoc-phe-tyr(tbn)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin；

(11)制備

fmoc-asn(trt)-phe-tyr(tbn)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin

在步驟(10)的

fmoc-phe-tyr(tbn)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin中，加入脫帽試劑(20％哌啶的dmf溶液)，常溫反應(yīng)5分鐘，抽干，重新加入脫帽劑常溫反應(yīng)20分鐘，用異丙醇洗滌3次，dmf洗滌3次，重蒸過的dmf洗滌2次，抽干，加入fmoc-asn(trt)-oh0.65g，diea0.4ml，tbtu0.39g，dmf10ml常溫反應(yīng)96min，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌3次，dmf洗滌3次，重蒸過的dmf洗滌2次，抽干，獲得fmoc-asn(trt)-phe-tyr(tbn)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin

(12)制備

fmoc-ser(tbn)-asn(trt)-phe-tyr(tbn)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin

在步驟(11)的fmoc-

asn(trt)-phe-tyr(tbn)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin中，加入脫帽試劑(20％哌啶的dmf溶液)，常溫反應(yīng)5分鐘，抽干，重新加入脫帽劑常溫反應(yīng)20分鐘，用異丙醇洗滌3次，dmf洗滌3次，重蒸過的dmf洗滌2次，抽干，加入fmoc-ser(tbn)-oh0.42g，diea0.4ml，tbtu0.38g，dmf10ml常溫反應(yīng)67min，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌3次，dmf洗滌3次，重蒸過的dmf洗滌2次，抽干，獲得fmoc-ser(tbn)-asn(trt)-phe-tyr(tbn)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin；

(13)制備

ser(tbn)-asn(trt)-phe-tyr(tbn)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin

在步驟(12)的

fmoc-ser(tbn)-asn(trt)-phe-tyr(tbn)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin中，加入脫帽試劑(20％哌啶的dmf溶液)，常溫反應(yīng)5分鐘，抽干，重新加入脫帽劑常溫反應(yīng)20分鐘，用dmf洗滌3次，異丙醇洗滌3次，重蒸過的dmf洗滌2次，甲醇洗滌2次，用甲醇浸泡1.5小時(shí)，抽干，用氮?dú)獯蹈蓸渲筛稍锏念w粒，所得到的樹脂為：

ser(tbn)-asn(trt)-phe-tyr(tbn)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin；

(14)制備粗品

把吹干的

ser(tbn)-asn(trt)-phe-tyr(tbn)-met-pro-leu-gly-gly-gly-ser(tbn)-lys(boc)-2clresin倒入玻璃的切割瓶中，加入預(yù)冷至-20℃的切肽試劑(tfa9.5ml，h2o0.5ml)，常溫反應(yīng)1.5小時(shí)，過濾除去樹脂，加冰乙醚500ml沉淀，3500轉(zhuǎn)3分鐘離心收集沉淀物，用乙醚洗滌3次，用純水溶解后，低溫冷凍干燥24小時(shí)，獲得snfymplgggsk肽粗品1.26g，經(jīng)hplc測定純度為78％(注：應(yīng)該大于0.69/1.23)；

(15)純化

將步驟(17)的snf十二肽粗品1.23g溶于13ml水中，過濾，濾液上樣于c18色譜柱，流動相為如下a、b液體的混合物：a：0.1％三氟乙酸加99.9％水；b：0.1％三氟乙酸加99.9％乙腈。從a液體占混合物比例100％開始梯度洗脫，期間b液體占混合物比例逐漸升高，直至占100％，流速為10ml/min，檢測波長為：215nm。收集目標(biāo)峰(用相同條件下以實(shí)驗(yàn)室級別生產(chǎn)的少量純品做對照指示目標(biāo)峰)的流出液，濃縮凍干，獲得成品，共獲得成品0.69g(mw：1419.6)，經(jīng)hplc測定純度大于98％。

實(shí)施例2食管腺癌特異性結(jié)合驗(yàn)證

選取食管腺癌細(xì)胞oe33，以人食管上皮細(xì)胞q-htert細(xì)胞作對照。

熒光偏振測定結(jié)合力

將epcam活性片段(abcam公司)用pbs(27mmkcl，137mmnacl，10.1mm，1.8mm，ph7.4)從濃度10μm起逐漸對半稀釋10次至0.001μm，分別加入黑色避光96孔板(corninglifescience,nonbindingsurfaceornbs)中，每孔60μl。每孔加入40μl100nmsnf-fitc室溫孵育60分鐘，熒光酶標(biāo)儀(tecaninfinitem1000fluorescenceplatereader)讀板，偏振值設(shè)為λex＝490nm和λem＝530nm。所得不同濃度的偏振值通過以下公式計(jì)算：

可得kd的偏振曲線，并算出kd值為kd＝172nmol/l(r^2＝0.997)。如圖1所示，熒光偏振測snf十二肽和epcam的結(jié)合力結(jié)果顯示，結(jié)合力kd值為kd＝172nmol/l(r^2＝0.997)，snf十二肽和epcam有結(jié)合，且結(jié)合力較高。。

rna干涉

在上海生物工程有限公司構(gòu)建合成sirna。將細(xì)胞鋪板(6孔板4x10⁵個(gè)細(xì)胞，8孔ezslide3x10⁴個(gè)細(xì)胞)，過夜，換培養(yǎng)基為opti-mem。將lipofectamine^tm2000(6孔板5ul/孔；8孔ezslide1ul/孔)與opti-mem(6孔板250ul/孔；8孔ezslide30ul/孔)混勻，靜置5min。同時(shí)將sirna(6孔板5ul/孔；8孔ezslide1ul/孔)與opti-mem(6孔板250ul/孔；8孔ezslide30ul/孔)混勻。將混勻后一半體積的lipofectamine^tm2000與混勻后的sirna混合，靜置20min。對照組僅加入lipofectamine^tm2000(6孔板255ul/孔；8孔ezslide31ul/孔)，實(shí)驗(yàn)組加入lipofectamine^tm2000與sirna的混合物(6孔板510ul/孔；8孔ezslide62ul/孔)。干涉結(jié)果，2天rna水平表達(dá)，3天蛋白水平表達(dá)。

qrt-pcr

1、細(xì)胞總rna提取

細(xì)胞鋪板(6孔板)，待細(xì)胞長滿后，預(yù)冷pbs(ph7.4)洗滌細(xì)胞三遍，加入trazol(1ml/孔)，冰上靜置5min，槍頭吹打。將各孔trazol吸到1.5mlep管中，加入預(yù)冷氯仿0.2ml/管，用力振搖15s。冰上靜置5min，離心(4℃，12000rpm，20min)。離心后液體分為三層(上層－無色水樣層為rna，中層白色為dna和底層紅色為蛋白質(zhì))，小心吸取上層無色液體移入一新的ep管中。加入等體積異預(yù)冷異丙醇，0.4－0.5ml，混勻，冰上靜置10min，離心(4℃，12000rpm，15min)。去上清，沉淀加入預(yù)冷乙醇1ml，震蕩搖勻，離心(4℃，12000rpm，10min)。小心去上清，管內(nèi)沉淀靜置干燥20min。加入20uldepc水溶解，酶標(biāo)儀紫外測rna濃度和純度。

2、反轉(zhuǎn)錄

rna稀釋，調(diào)節(jié)濃度為200ng/ul。加樣：10mmdntpmix2μl；樣品(rna)2μl；depc水6μl。反轉(zhuǎn)錄：37℃15min，85℃5s，4℃30min。所得樣品加90μldepc水稀釋。

3、qrt-pcr

加樣：上下游引物各1μl/孔；cdna2μl/孔；green10μl/孔。

程序：起始(50℃2min；95℃2min)；40個(gè)循環(huán)(95℃3s；60℃30)數(shù)據(jù)分析：求出2^(-δδct)值，進(jìn)行比較，如圖2所示，epcam在mrna水平的表達(dá)結(jié)果顯示，在mrna水平，oe33細(xì)胞中epcam的表達(dá)遠(yuǎn)高于在q-htert細(xì)胞中的表達(dá)。。

免疫印跡試驗(yàn)(westernblot)

1、培養(yǎng)細(xì)胞并做好rna干涉。

2、提取細(xì)胞總蛋白，加入5xloadingbuffer緩沖液，煮沸樣品10minutes。

3、電泳分離：上樣20μg至10％的sds-page膠(10cmx10cm)電泳。

4、轉(zhuǎn)膜：

(1)依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，將膠和pvdf膜浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡15min。pvdf膜需用純甲醇先浸泡飽和5秒鐘再移入轉(zhuǎn)移緩沖液中。

(2)裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿+3層濾紙+膠+膜+3層濾紙+海綿，每層放好后，趕去氣泡，膠放于負(fù)極面(黑色面)。

(3)將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治(黑色面對黑色面)，加轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，恒流，300ma1h。

5、免疫雜交與顯色：

(1)置膜于25ml封閉緩沖液中，4℃過夜，緩慢搖動。15mltbst洗3次(10min/次)。

(2)加入稀釋后的(1：1000)的一抗，4℃過夜，緩慢搖動。

(3)15mltbst洗3次(10min/次)。

(4)加入稀釋后的(1：5000)辣根過氧化酶(hrp)標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h，緩慢搖動。

(5)15mltbst洗3次(10min/次)。

(6)蛋白檢測，機(jī)器掃膜。見圖3所示epcam在蛋白水平的表達(dá)結(jié)果顯示，在蛋白水平，oe33細(xì)胞中epcam的表達(dá)遠(yuǎn)高于在q-htert細(xì)胞中的表達(dá)。

免疫熒光

1、培養(yǎng)細(xì)胞并做好rna干涉。

2、預(yù)冷pbs洗兩遍，山羊血清封閉20min

3、免疫熒光染色，抗體組(對照組)為間接抗體染色：每個(gè)孔加入200μl一抗(1：400)，4℃搖擺過夜；500μlpbs/孔，5min/次，清洗三遍；每個(gè)孔加入200μl熒光二抗(1：800)，室溫孵育30min；500μlpbs/孔，5min/次，清洗三遍；200μl4％多聚甲醛固定20min；500μlpbs/孔，5min/次，清洗一遍；100μldapi(1：100)染色7min；500μlpbs/孔，5min/次，清洗三遍；10μl抗熒光淬滅劑封片。snf組(實(shí)驗(yàn)組)：每個(gè)孔加入200μlsnf(800μg/ml)，室溫孵育30s；500μlpbs/孔，5min/次，清洗三遍；200μl4％多聚甲醛固定20min；500μlpbs/孔，5min/次，清洗一遍；100μldapi(1：100)染色7min；500μlpbs/孔，5min/次，清洗三遍；10μl抗熒光淬滅劑封片。

4、倒置熒光顯微鏡看片。免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測十二肽對epcam的靶向性結(jié)果顯示，在epcam表達(dá)量高的oe33細(xì)胞表面上結(jié)合的snf十二肽遠(yuǎn)高于在q-htert細(xì)胞表面的結(jié)合量。這證實(shí)snf十二肽對細(xì)胞的靶向性隨著epcam的增加而增加。

以上所述，僅是本申請的幾個(gè)實(shí)施例，并非對本申請做任何形式的限制，雖然本申請以較佳實(shí)施例揭示如上，然而并非用以限制本申請，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本申請技術(shù)方案的范圍內(nèi)，利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容做出些許的變動或修飾均等同于等效實(shí)施案例，均屬于技術(shù)方案范圍內(nèi)。