專(zhuān)利名稱(chēng)：上皮細(xì)胞粘附分子的核酸適體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種核酸，特別涉及EpCAM(Epithelialcell adhesion molecule)上皮細(xì)胞粘附分子的核酸適體制備方法及其在腫瘤早期檢測(cè)、治療和預(yù)后中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule)上皮細(xì)胞粘附分子屬于黏附分子家族，也稱(chēng)為 17-A, ESA, EGP40, Trop-1, KSA, CD326, TACSTDI, C017-1A，GA733-2 等。EpCAM 是一種由腫瘤相關(guān)I丐信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) I (tumor-associated calcium signal transducer1，TACSTD1)基因編碼的一個(gè)分子量30-40kDa的單次跨膜蛋白，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附、介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞遷移、增殖和分化等功能(I、Kurtz JE, Dufour P. Adecatumumab:ananti-EpCAM monoclonal antibody, from the bench to the bedside [ j] . ExpertOpin BioITher, 2010,10 (6) : 951-958 ；2> Trzpis M, McLaughlin PM, de Leij LM, et al.Epithelial cell adhesion molecule. More than a carcinoma marker and adhesion molecule [J]. Am J Pathol, 2007,171 (2):386-395)。EpCAM表達(dá)在人部分正常上皮細(xì)胞和大多數(shù)惡性上皮細(xì)胞表面，目前普遍認(rèn)為它對(duì)腫瘤的生物學(xué)特性起重要作用。病理情況下，EpCAM幾乎表達(dá)于所有的腺癌中，包括結(jié)直腸腺癌、胃腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、前列腺癌、胰腺癌以及肝細(xì)胞癌和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(l、Kurtz JE,Dufour P. Adecatumumab:an anti-EpCAM monoclonal antibody,from thebench to the bedside[j]. Expert Opin BiolTher, 2010,10 (6) : 951-958)。研究發(fā)現(xiàn)EpCAM也是一些腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)記物，Kimura等的研究發(fā)現(xiàn)EpCAM陽(yáng)性的肝癌干細(xì)胞能夠誘導(dǎo)免疫缺陷的小鼠發(fā)生腫瘤(3、Kimura O, Takahashi T, Ishii N, et al. Characterization oftheepithelial cell adhesion molecule (EpCAM)+cell population in hepatocellularcarcinoma cell lines[j]. Cancer Sci，2010，101 (10) : 2145-2155.)。將肝細(xì)胞癌 EpCAM陽(yáng)性及陰性亞群細(xì)胞分別注射到免疫缺陷的小鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示形成腫瘤所需的癌細(xì)胞數(shù)EpCAM陽(yáng)性者遠(yuǎn)少于EpCAM陰性者，且注射EpCAM陽(yáng)性癌細(xì)胞的小鼠所產(chǎn)生的腫瘤比注射EpCAM陰性者更大，說(shuō)明EpCAM陽(yáng)性的癌細(xì)胞致瘤性比EpCAM陰性的癌細(xì)胞大。肝細(xì)胞癌細(xì)胞系中EpCAM陽(yáng)性的亞群克隆速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于EpCAM陰性的亞群。研究還發(fā)現(xiàn)，EpCAM陽(yáng)性的癌細(xì)胞可以分化為EpCAM陽(yáng)性和陰性的細(xì)胞，而EpCAM陰性的癌細(xì)胞只能分化為EpCAM陰性的細(xì)胞，說(shuō)明EpCAM陽(yáng)性的癌細(xì)胞具有多項(xiàng)分化的潛能。腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移是其死亡率居高不下的主要原因，循環(huán)血腫瘤細(xì)胞則是腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的根源。及時(shí)發(fā)現(xiàn)循環(huán)血中腫瘤細(xì)胞，可以預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，提高患者生存率，改善預(yù)后。EpCAM抗體與芯片技術(shù)結(jié)合用于分離腫瘤患者外周血中的腫瘤細(xì)胞，結(jié)果在99.1% (115 / 116)的血樣品中成功分離出數(shù)量不等的腫瘤細(xì)胞(其中包括所有7例早期前列腺癌患者)；而且循環(huán)血腫瘤細(xì)胞數(shù)的改變與影像學(xué)檢查的疾病進(jìn)程高度關(guān)聯(lián)(4、NagratbS,Sequist LV,Mabeswaran S, et al. Isolation of rare circulating tumour cells incancer patients by microchip technology. Nature,2007,450(7173) :1235—1239)。但是，抗體由于分子量較大、位阻大、難儲(chǔ)存易降解等缺點(diǎn)，很大程度抑制了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)。EpCAM的表達(dá)與腫瘤的預(yù)后相關(guān)，可作為腫瘤靶向治療的一個(gè)靶位點(diǎn)。但是，目前由于EpCAM的免疫治療由于抗體特異性差、結(jié)合力低等原因，臨床試驗(yàn)結(jié)果不甚理想。因此設(shè)計(jì)一種高親和力和高選擇性的識(shí)別上皮細(xì)胞黏附因子EpCAM的分子探針將會(huì)對(duì)腫瘤的早期診斷、治療和預(yù)后具有重要的意義。核酸適體是指從人工合成的單鏈DNA/RNA文庫(kù)中篩選得到的能夠高特異性地和高親和力地與靶標(biāo)分子結(jié)合的單鏈寡核苷酸。核酸適體借助氫鍵、范德華力、疏水作用等分子間弱作用力形成特殊的三維結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾、假結(jié)、凸環(huán)、G-四聚體等，從而特異地識(shí)別靶物質(zhì)甚至影響其生物活性。核酸適體本身特有的生化特性使其在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域具有諸多優(yōu)勢(shì)，如靶分子范圍廣、親和力與特異性強(qiáng)、合成修飾方便快速、分子量較小、良好的生物兼 容性、無(wú)毒、體外穩(wěn)定性好等。核酸適體可以通過(guò)配體指數(shù)富集系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematicevolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)篩選獲得，其基本原理是在體外人工化學(xué)合成一個(gè)寡核苷酸文庫(kù)，包括RNA、ssDNA或修飾的RNA和ssDNA，通過(guò)寡核苷酸文庫(kù)與目標(biāo)分子的相互作用，結(jié)合PCR技術(shù)指數(shù)級(jí)放大與靶分子特異結(jié)合的寡核苷酸，經(jīng)過(guò)幾輪或數(shù)十輪篩選富集過(guò)程，獲得高親和力和高特異性的核酸適體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的在于提供具有高特異性和高親和力的上皮細(xì)胞粘附分子的核酸適體。本發(fā)明的第二目的在于提供具有高特異性和高親和力的表達(dá)上皮細(xì)胞粘附分子的細(xì)胞核酸適體。本發(fā)明的第三目的在于提供上皮細(xì)胞粘附分子的核酸適體的制備方法。所述上皮細(xì)胞粘附分子EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule)的核酸適體分別命名為 EpCAM A、EpCAM B、EpCAM C、EpCAM D 與 EpCAM Ccut，其序列如下EpCAMA agcgtcgaat accactacag tttggctctg ggggatgtgg aggggggtat gggtgggagt 60ctaatggagc tcgtggtcag80EpCAM B agcgtcgaat accactacag agctcggggt tttttggggt tttttggggt tttggtgggg 60ctaatggagc tcgtggtcag80EpCAM C agcgtcgaat accactacag aggttgcgtc tgtcccacgt tgtcatgggg ggttggcctg 60ctaatggagc tcgtggtcag80EpCAM D agcgtcgaat accactacag ctccggggtt tttgggggtt tttctggggt tttttggggc 60taatggagct cgtggtcag79EpCAM Ccut Cactacagaggttgcgtctgtcccacgttgtcatggggggttggcctgo
所述上皮細(xì)胞粘附分子EpCAM的核酸適體及基于上述結(jié)構(gòu)做切短、延長(zhǎng)、部分堿基替換的上皮細(xì)胞粘附分子EpCAM的核酸適體，所述上皮細(xì)胞粘附分子EpCAM的核酸適體具有G四聚體結(jié)構(gòu)或者莖環(huán)結(jié)構(gòu)。所述上皮細(xì)胞粘附分子EpCAM的核酸適體的制備方法，包括以下步驟I)合成單鏈DNA隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)；以Ni微珠為基質(zhì)，篩選除去DNA隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)中的非特異性結(jié)合部分，以上皮細(xì)胞粘附分子EpCAM微珠篩選得到與上皮細(xì)胞粘附分子EpCAM特異結(jié)合的核酸序列；2)將步驟I)所得與上皮細(xì)胞粘附分子EpCAM特異結(jié)合的核酸序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以鏈酶親和素微珠為基質(zhì)進(jìn)行分離，通過(guò)堿變性解鏈，過(guò)濾，純化，即得用于次輪篩選的單鏈DNA文庫(kù)，形成次一級(jí)核酸文庫(kù)；3)將步驟2)所得的單鏈DNA文庫(kù)進(jìn)行下一輪篩選，經(jīng)過(guò)12輪篩選后獲得目的寡核苷酸序列；克隆測(cè)序所述目的寡核苷酸序列，并通過(guò)流式分析法鑒定其與靶蛋白結(jié)合的 特異性和親和力。在步驟I)中，所述單鏈DNA隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)的兩端為固定序列，中間為40個(gè)堿基的隨機(jī)序列，即為 5’-AGC GTC GAA TAC CAC TAC AG-40nt_CTA ATG GAG CTC GTG GTCAG-3’，庫(kù)容量為IO15以上。 在步驟2)中，所述PCR擴(kuò)增的引物為引物I :5，-FAM-AGC GTC GAA TAC CAC TAC AG-3，；引物2 :5，-Biotin-CTG ACC ACG AGC TCC ATT AG-3，；所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為3’端帶有生物素標(biāo)記、5’端帶有FAM標(biāo)記的雙鏈DNA文庫(kù)。所述上皮細(xì)胞粘附分子EpCAM的核酸適體作為與表達(dá)EpCAM蛋白的細(xì)胞系的核酸適配體。本發(fā)明所述上皮細(xì)胞粘附分子EpCAM的核酸適體的制備方法包括設(shè)計(jì)并合成單鏈DNA隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)，篩選目的寡核苷酸序列，并通過(guò)流式分析法鑒定其與靶蛋白結(jié)合的特異性和親和力。篩選獲得的核酸適體無(wú)毒性，分子量小，滲透性好，易于合成與標(biāo)記，只特異性識(shí)別EpCAM蛋白，并且特異性識(shí)別表達(dá)EpCAM蛋白的細(xì)胞系，對(duì)不表達(dá)此蛋白的細(xì)胞系不具有識(shí)別功能。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于首先，通過(guò)真核表達(dá)的His標(biāo)簽的識(shí)別上皮細(xì)胞黏附因子EpCAM的蛋白，進(jìn)而通過(guò)Hid與Ni的親和反應(yīng)把靶蛋白固定到微珠上，避免了傳統(tǒng)方法中通過(guò)共價(jià)反應(yīng)偶聯(lián)到微珠上對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響，保證了蛋白的天然構(gòu)象，保證篩選得到的核酸適配體可以識(shí)別膜上表達(dá)上皮細(xì)胞黏附因子EpCAM的蛋白。其次，微珠-流式細(xì)胞分析法相結(jié)合的篩選方法使得篩選與檢測(cè)更為簡(jiǎn)便快速。而且，篩選獲得的核酸適體無(wú)毒性，分子量小，滲透性好，易于合成與標(biāo)記。通過(guò)SELEX方法篩選獲得的核酸適體只特異性識(shí)別皮細(xì)胞粘附分子EpCAM，對(duì)其他同源蛋白不具有識(shí)別功能。上述優(yōu)點(diǎn)使得所述核酸適體成為皮細(xì)胞粘附分子EpCAM檢測(cè)的有力工具，識(shí)別上皮細(xì)胞黏附因子EpCAM的核酸適配體在腫瘤的早期診斷、循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲、組織、活體成像和癌癥治療中具有重要的意義。


圖I為流式細(xì)胞儀檢測(cè)篩選進(jìn)程中DNA隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)對(duì)上皮細(xì)胞黏附因子EpCAM的富集圖。在圖I中，橫坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)為微珠數(shù)，曲線A為初始DNA隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)，曲線B為第5輪DNA隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)，曲線C為第12輪DNA隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)。圖2為流式細(xì)胞儀檢測(cè)篩選進(jìn)程中DNA隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)對(duì)于Ni微珠的富集圖。在圖2中，橫坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)為微珠數(shù)，曲線A為初始DNA隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)，曲線B為第5輪DNA隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)，曲線C為第12輪DNA隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)。圖3為流式細(xì)胞儀測(cè)定所得第12輪DNA隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)對(duì)上皮細(xì)胞黏附因子EpCAM的解離常數(shù)。在圖3中，橫坐標(biāo)為DNA濃度(nM)，縱坐標(biāo)為平均熒光強(qiáng)度， 代表初始DNA隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)，▽代表第12輪DNA隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)。圖4為流式細(xì)胞儀測(cè)定所得核酸適體EpCAM A、EpCAM B、EpCAM C、EpCAM D對(duì)上皮細(xì)胞粘附分子EpCAM蛋白的偏移。在圖4中，橫坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)為微珠數(shù)。曲線a 為 Oth ；b 為 12th ；c 為 EpCAM A ;d 為 pCAM B ;e 為 pCAM C ;f■為 pCAM D。
圖5和6為流式細(xì)胞儀測(cè)定所得核酸適體EpCAM A、EpCAM B、EpCAM C、EpCAM D對(duì)各種細(xì)胞系的偏移。在圖5和6中,橫坐標(biāo)為突光強(qiáng)度,縱坐標(biāo)為微珠數(shù)；曲線a為RS ;b為 EpCAM A ;c 為 EpCAM B ;d 為 EpCAM C ;f 為 EpCAM D。圖7為流式細(xì)胞儀測(cè)定所得核酸適體EpCAM A對(duì)HEK-293T和MDA-MB-231細(xì)胞系的解離常數(shù)。在圖7中，橫坐標(biāo)為DNA濃度(nmol/L)，縱坐標(biāo)為平均熒光強(qiáng)度， 代表MDA-MB-231細(xì)胞系，〇代表HEK-293T細(xì)胞系。圖8為流式細(xì)胞儀測(cè)定所得核酸適體EpCAM C對(duì)HEK-293T和MDA-MB-231細(xì)胞系的解離常數(shù)。在圖8中，橫坐標(biāo)為DNA濃度(nmol/L)，縱坐標(biāo)為平均熒光強(qiáng)度，〇代表MDA-MB-231細(xì)胞系， 代表HEK-293T細(xì)胞系。圖9為通過(guò)圓二色譜法檢測(cè)所得EpCAM A、EpCAM B,EpCAM D核酸適體形成平行G四聚體結(jié)構(gòu)。在圖9中，橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)(nm),縱坐標(biāo)為實(shí)測(cè)橢圓度(mdeg);曲線a為EpCAMA ；b 為 EpCAM B ;c 為 pCAM D。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I體外篩選與上皮細(xì)胞粘附分子EpCAM特異結(jié)合的核酸適體I)將合成好的5nmol單鏈DNA核酸庫(kù)溶于結(jié)合緩沖液(12mmol/L PBS,O. 55mmol/LMgCl2)中，進(jìn)行熱處理95°C加熱5min，在冰上放置lOmin，然后室溫下放置IOmin ；2)將處理好的單鏈DNA核酸庫(kù)與Ni微珠進(jìn)行孵育，收集未與Ni微珠結(jié)合的液體；3)將未與Ni微珠結(jié)合的液體與EpCAM Ni微珠一起于37°C下孵育40min ；4)使用結(jié)合緩沖液洗滌孵育后的EpCAM Ni微珠，再將結(jié)合了寡核苷酸的EpCAM Ni微珠做PCR反應(yīng)；PCR 反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性 3min，94°C 30s, 53°C 30s, 68°C 30s，擴(kuò)增 10 個(gè)循環(huán),最后68°C終延伸5min,引物I :5，-FAM-AGC GTC GAA TAC CAC TAC AG-3，；引物2 :5，-Biotin-CTG ACC ACG AGC TCC ATT AG-3，；5) PCR反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物為3’端帶有生物素標(biāo)記，5’端帶有FAM標(biāo)記的雙鏈DNA，加入鏈酶親和素微珠，反應(yīng)30min，然后用O. lmol/L NaOH進(jìn)行單鏈化，經(jīng)脫鹽柱純化即得到用于下一輪篩選的單鏈DNA文庫(kù)；
6)之后每輪使用200pmol的單鏈DNA文庫(kù)，并且逐步增加洗滌次數(shù)以增強(qiáng)篩選強(qiáng)度。共進(jìn)行12輪篩選，而后通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)單鏈DNA文庫(kù)的富集情況，結(jié)果顯示第12輪庫(kù)與靶蛋白EpCAM有比較明顯的結(jié)合(參見(jiàn)圖1)，而與Ni蛋白沒(méi)有結(jié)合(參見(jiàn)圖2)，最后把第12輪庫(kù)送去克隆測(cè)序。實(shí)施例2以流式分析法檢測(cè)所得單鏈DNA與上皮細(xì)胞粘附分子EpCAM的結(jié)合能力首先PCR擴(kuò)增帶熒光標(biāo)記的單鏈DNA，使用引物2 :5’ -Biotin-CTG ACC ACG AGCTCC ATT AG-3’ 與引物 3 :5，-FAM-AGC GTC GAA TAC CAC TAC AG-3’，PCR 產(chǎn)物為 5’端帶有FAM并且3’端帶有生物素的雙鏈DNA，加入鏈酶親和素微珠，反應(yīng)30min，然后用0. Imol/LNaOH進(jìn)行單鏈化，經(jīng)脫鹽柱純化即得到用于流式分析的帶FAM標(biāo)記的單鏈DNA。使用Onmol/L,5nmol/L,10nmol/L,20nmol/L,50nmol/L,lOOnmol/L,200nmol/L 濃度梯度的單鏈DNA與靶蛋白EpCAM Ni微珠來(lái)測(cè)定解離常數(shù)(Kd=22. 8±6. O)。用200 yl 結(jié)合緩沖液配置上述各濃度的DNA溶液，95°C加熱5min,冰上放置IOmin,然后室溫下放置IOmin0加入155nmol/L的EpCAM微珠，37°C下孵育40min。使用結(jié)合緩沖液洗滌微珠3次，而后把微珠重懸在250 u L結(jié)合緩沖液中。設(shè)置未經(jīng)過(guò)篩選的初始DNA隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)作對(duì)照。使用BD公司的FACSAria流式細(xì)胞儀對(duì)微珠進(jìn)行熒光測(cè)定，而后用sigma plot軟件作圖，計(jì)算出所得核酸適體的解離常數(shù)(參見(jiàn)圖3、7和8)。實(shí)施例3篩選得到核酸適配體與各種細(xì)胞系特異結(jié)合I)將合成好的5nmol單鏈DNA核酸溶于結(jié)合緩沖液(12mmol/L PBS,0. 55mmol/LMgCl2)中，進(jìn)行熱處理95°C加熱5min，在冰上放置lOmin，然后室溫下放置IOmin ；2)將處理好的單鏈DNA核酸與10000個(gè)細(xì)胞種于24孔板24h進(jìn)行孵育，37°C下孵育30min或者4°C下孵育40min。3)孵育好后，去緩沖溶液洗兩次，再將細(xì)胞刮下來(lái)溶于200 u L緩沖溶液，使用BD公司的FACSAria流式細(xì)胞儀對(duì)微珠進(jìn)行熒光測(cè)定(參見(jiàn)圖5和6)。實(shí)施例4以圓二色譜法測(cè)定所得核酸適體EpCAM A形成平行G四聚體結(jié)構(gòu)用結(jié)合緩沖液配制I U mol/L核酸適體EpCAM A溶液,進(jìn)行熱處理95°C加熱5min,冰上放置IOmin,然后室溫下放置lOmin。而后使用圓二色譜儀以0. Inm為步長(zhǎng)掃描400nm到200nm的⑶光譜，重復(fù)掃描8次，結(jié)果分別在240nm與260nm處形成一個(gè)負(fù)峰和正峰，此峰型與文獻(xiàn)(5、Sattanathan Paramasivan, Iulian Rujan, Philip H. Bolton. Circulardichroism of quadruplex DNAs:Applications to structure,cation effects andligand binding, 2007, 43:324-331.)中報(bào)道的平行G四聚體的特征峰吻合，由此可判斷所獲得的核酸適體EpCAMA具有平行G四聚體結(jié)構(gòu)(參見(jiàn)圖9)。
權(quán)利要求
1.上皮細(xì)胞粘附分子EpCAM的核酸適體，其特征在于所述上皮細(xì)胞粘附分子EpCAM的核酸適體分別命名為EpCAM A、EpCAM B、EpCAM C、EpCAM D與EpCAM Ccut，其序列如下EpCAMA agcgtcgaat accactacag tttggctctg ggggatgtgg aggggggtat gggtgggagt 60ctaatggagc tcgtggtcag80EpCAM B agcgtcgaat accactacag agctcggggt tttttggggt tttttggggt tttggtgggg 60ctaatggagc tcgtggtcag80EpCAM C agcgtcgaat accactacag aggttgcgtc tgtcccacgt tgtcatgggg ggttggcctg 60ctaatggagc tcgtggtcag80EpCAMD agcgtcgaat accactacag ctccggggtt tttgggggtt tttctggggt tttttggggc 60taatggagct cgtggtcag79EpCAM Ccut Cactacagaggttgcgtctgtcccacgttgtcatggggggttggcctgο
2.如權(quán)利要求I所述的上皮細(xì)胞粘附分子EpCAM的核酸適體，其特征在于所述上皮細(xì)胞粘附分子EpCAM的核酸適體及基于上述結(jié)構(gòu)做切短、延長(zhǎng)、部分堿基替換的上皮細(xì)胞粘附分子EpCAM的核酸適體，所述上皮細(xì)胞粘附分子EpCAM的核酸適體具有G四聚體結(jié)構(gòu)或者莖環(huán)結(jié)構(gòu)。
3.如權(quán)利要求I所述的上皮細(xì)胞粘附分子EpCAM的核酸適體的制備方法，其特征在于包括以下步驟 O合成單鏈DNA隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)；以Ni微珠為基質(zhì)，篩選除去DNA隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)中的非特異性結(jié)合部分，以上皮細(xì)胞粘附分子EpCAM微珠篩選得到與上皮細(xì)胞粘附分子EpCAM特異結(jié)合的核酸序列； 2)將步驟I)所得與上皮細(xì)胞粘附分子EpCAM特異結(jié)合的核酸序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以鏈酶親和素微珠為基質(zhì)進(jìn)行分離，通過(guò)堿變性解鏈，過(guò)濾，純化，即得用于次輪篩選的單鏈DNA文庫(kù)，形成次一級(jí)核酸文庫(kù)； 3)將步驟2)所得的單鏈DNA文庫(kù)進(jìn)行下一輪篩選，經(jīng)過(guò)12輪篩選后獲得目的寡核苷酸序列；克隆測(cè)序所述目的寡核苷酸序列，并通過(guò)流式分析法鑒定其與靶蛋白結(jié)合的特異性和親和力。
4.如權(quán)利要求3所述的上皮細(xì)胞粘附分子EpCAM的核酸適體的制備方法，其特征在于在步驟I)中，所述單鏈DNA隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)的兩端為固定序列，中間為40個(gè)堿基的隨機(jī)序列，即為 5’-AGC GTC GAA TAC CAC TAC AG-40nt_CTA ATG GAG CTC GTG GTC AG-3’，庫(kù)容量為IO15以上。
5.如權(quán)利要求3所述的上皮細(xì)胞粘附分子EpCAM的核酸適體的制備方法，其特征在于在步驟2)中，所述PCR擴(kuò)增的引物為引物 I :5’-FAM-AGC GTC GAA TAC CAC TAC AG-3’ ；引物 2 :5，-Biotin-CTG ACC ACG AGC TCC ATT AG-3，；所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為3’端帶有生物素標(biāo)記、5’端帶有FAM標(biāo)記的雙鏈DNA文庫(kù)。
6.如權(quán)利要求I所述的上皮細(xì)胞粘附分子EpCAM的核酸適體作為與表達(dá)EpCAM蛋白的細(xì)胞系的核酸適配體。
全文摘要
上皮細(xì)胞粘附分子的核酸適體及其制備方法，涉及一種核酸。提供具有高特異性和高親和力的上皮細(xì)胞粘附分子EpCAM的核酸適體及其制備方法與應(yīng)用。所述上皮細(xì)胞粘附分子EpCAM的核酸適體具有G四聚體結(jié)構(gòu)或者莖環(huán)結(jié)構(gòu)，制備方法包括設(shè)計(jì)并合成單鏈DNA隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)，篩選目的寡核苷酸序列，并通過(guò)流式分析法鑒定其與靶蛋白結(jié)合的特異性和親和力。篩選獲得的核酸適體無(wú)毒性，分子量小，滲透性好，易于合成與標(biāo)記，只特異性識(shí)別EpCAM蛋白，并且特異性識(shí)別表達(dá)EpCAM蛋白的細(xì)胞系，對(duì)不表達(dá)此蛋白的細(xì)胞系不具有識(shí)別功能。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102827845SQ201210362899
公開(kāi)日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月24日
發(fā)明者楊朝勇, 宋彥齡, 安源, 鄒遠(yuǎn), 張薇婷, 鄔杰, 莊峙廈 申請(qǐng)人:廈門(mén)大學(xué)