專(zhuān)利名稱：一種從林蛙組織中萃取膠原螺旋肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到用林蛙體萃取膠原旋肽的制備方法。
技術(shù)背景林蛙以其特有的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，而日漸被人們所重視，成為蛙類(lèi) 中經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的一種。又因其專(zhuān)攝取昆蟲(chóng)類(lèi)食物，又被譽(yù)為"純綠色食 品"。林蛙是延緩衰老、滋補(bǔ)強(qiáng)壯、美容健膚、增強(qiáng)機(jī)體免疫力的最佳進(jìn)補(bǔ) 良藥。目前林蛙人工養(yǎng)殖數(shù)量日益增多，科學(xué)加工林蛙已是相關(guān)科研單位 研究的主要課題。經(jīng)研究表明源自兩棲動(dòng)物的肽，具有螺旋肽兩親性結(jié)構(gòu)， 與細(xì)胞膜的肌膚有高親和性。它們?cè)谕茴?lèi)的兩棲動(dòng)物的肌健、骨膜、皮膚 腺體中形成生物防護(hù)素，即膠原螺旋肽。本發(fā)明是從林蛙體中萃取膠原螺 旋肽的方法，為林蛙藥用保健價(jià)值提供新的空間。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供從林蛙體中萃取膠原螺旋肽的制備方法，使林蛙體 生物活性物質(zhì)得到更廣泛的應(yīng)用，為人們能在日常生活中獲得林蛙的營(yíng)養(yǎng)、 藥用、美容價(jià)值的保健食品提供方便，也為林蛙產(chǎn)業(yè)發(fā)展起到促進(jìn)作用。一種從林蛙組織中萃取膠原螺旋肽的制備方法1、 林蛙體的獲取1.1林蛙體的選擇在秋季捕捉林蛙，經(jīng)干制法被剝?nèi)×滞苡秃蟮拇菩?林蛙和雄性林蛙體，或經(jīng)鮮活制法剝?nèi)⊥苡秃蟮男迈r雌性蛙體，或鮮活的 雄性林蛙體為原料。1.2林蛙體的貯存A、收集干制的雄蛙干或取油后的雌蛙干，貯于0 一4。C冷藏庫(kù)內(nèi)；B、收集鮮活雄蛙或被剝?nèi)⊥苡偷拇仆?，速凍后貯存于一 18。C的冷凍庫(kù)內(nèi)備用；2、 林蛙體的預(yù)處理2.1取干制的林蛙體，用中藥切片機(jī)切成1.0—5.0mm的蛙體片，然后 將蛙體片置于不銹鋼槽內(nèi)，加入1一5倍蛙體重量的蒸餾水或純凈水，同時(shí) 加入1一3%蛙體重量的擰檬酸鈉、酒石酸或Vc，浸泡4一10小時(shí)，水溫控 制在20-40。C之內(nèi)，每隔20-60min攪拌一次；2.2取冷凍貯存的蛙體，采用電動(dòng)刨肉機(jī)，將蛙體均勻的刨成l.O— 5.0mm的薄片，然后置于不銹鋼槽內(nèi)，加入l一3倍蛙體重量的蒸餾水或純 凈水，同時(shí)加入1一3%蛙體重量的檸檬酸鈉、酒石酸或Vc，浸泡2—6小 時(shí)，每隔20-60min攪拌一次，水溫控制在10-20°C;3、 生物酶解3.1復(fù)合酶解將預(yù)處理后的林蛙片連同浸泡汁，加入真空反應(yīng)釜內(nèi)，加熱至35—60。C，調(diào)整PH值為6—8，每千克林蛙體加入2—6g的1398 中性蛋白酶，l一3g的1203脂肪酶，l一5g防腐劑乳酸菌素或氟硅酸鈉， 每100萬(wàn)單位酶活量加入2—8g亞硫酸鈉或Vc作為酶激活劑；真空度控制 在100—800Pa，攪拌下酶解反應(yīng)6—12h;然后用100—300目的雙聯(lián)過(guò)濾 器過(guò)濾出骨渣等雜物；在復(fù)合酶解反應(yīng)下，有脫脂反應(yīng)過(guò)程和酶解蛋白質(zhì) 過(guò)程；得復(fù)合酶解液；3.2生物酶修飾經(jīng)酶降解液體含有蛋白酶與肽酶復(fù)合體，味比較苦， 為修飾苦味和徹底酶解，將復(fù)合酶解液用空氣壓力輸送至生物酶修飾反應(yīng) 釜中，調(diào)整PH值為6 8，溫度控制在40 60。C，加入蛙體質(zhì)量0.2 2.0%的 丹麥諾維信功能食品工業(yè)生產(chǎn)的Flavourzyme復(fù)合風(fēng)味蛋白酶、0.1 1.0%的 磷脂酯?；饷?俗稱:磷脂酶A)，真空度為200 800Pa攪拌酶修飾3 8h; 通過(guò)酶修飾成黏度3/mpa.s6 12、產(chǎn)率16 36%的膠原螺旋肽分子液；3.3滅酶，采用超高溫瞬間滅酶法在120—15(TC/s，出料溫度為30—50 。C的條件下滅酶，或加溫60—8(TC/ 30—60min使酶失活；4、 膠原螺旋肽分離純化4.1離心分離采用高速離心機(jī)將酶解液以6000—60000r/min的速度離 心6—20min，將上層液和中層液合并輸入稀釋罐體內(nèi)，即酶解分離液，下 層液被分離出去；4.2稀釋將酶解分離液，按l: l一3重量比例加入純凈水或蒸餾水， 在真空度100—800Pa攪拌稀釋?zhuān)?.3超微膜純化將稀釋液用循環(huán)泵加壓0.2MPa—0.8MPa通過(guò)平衡保 險(xiǎn)分離器在0.1um—0.5um的精度下進(jìn)行分離，然后用5—50mVh的循環(huán)泵 將濾液在0.6—1.6MPa的壓力下通過(guò)50000道爾頓的超微膜純化，獲得分子 量大于等于50000道爾頓的膠原螺旋肽液；4.4低溫濃縮為保持膠原螺旋肽活性，不被高溫破壞螺旋肽活性成份， 采用熱隔膜低溫濃縮技術(shù)對(duì)膠原螺旋肽液進(jìn)行濃縮，溫度為40—6(TC，真 空度為0.3—1.8MPa，除去膠原螺旋肽液中30—70%體積的水分，然后將濃 縮液輸送到平衡罐內(nèi)；5、 干燥成型5.1噴霧干燥將濃縮液用濃漿泵以100—500r/min的流速輸入180— 26(TC的離心噴霧干燥塔內(nèi)干燥成粉沫；在出料口收集膠原螺旋肽粉，用復(fù) 合袋密封，獲得分子量大于等于50000道爾頓的膠原螺旋肽粉；5.2將干燥后的膠原螺旋肽糖，經(jīng)自動(dòng)充膠囊機(jī)灌上每粒200—300毫 克的硬膠囊，然后泡罩成PVC和鋁箔每板10粒。經(jīng)檢驗(yàn)包裝成精品盒或 獲得林蛙膠原螺旋肽膠囊成品。本發(fā)明的積極效果1.采用生物蛋白酶解技術(shù)將雄性林蛙和被剝?nèi)⊥苡偷拇仆芙到獬赡z原 螺旋肽。2. 采用超微膜和低溫濃縮技術(shù)分離林蛙酶解液純化林蛙膠原螺旋肽分 子量。使產(chǎn)品具有穩(wěn)定性、抗氧化性、易保存，易被人體吸收。3. 采用林蛙干或鮮林蛙制備林蛙螺旋肽膠囊，使人們?cè)谌粘Ｉ钪屑?食莢豌豆獲得林蛙的保健功效，為林蛙的藥用價(jià)值、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值提供新的發(fā) 展空間?？傊捎蒙锛夹g(shù)將林蛙體具有螺旋狀兩親性結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜和肌膚有 高親和性的林蛙生物防護(hù)素——膠原螺旋肽通過(guò)生物酶解、修飾、分離純 化、濃縮成林蛙膠原螺旋肽生物保健品，為林蛙的藥用價(jià)值、食用價(jià)值， 提供了新的途徑。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。 實(shí)施例1取秋季捕捉經(jīng)干制剝?nèi)×滞苡偷拇菩粤滞芎托坌粤滞?0kg，采用中草 藥切片機(jī)將干制林蛙切成2mm的林蛙片，置于300L的不銹鋼槽內(nèi)，加入 200kg的蒸餾水和3kg的檸檬酸鈉，浸泡8小時(shí)，水溫控制在2(TC。用木 攪拌棒每隔30min攪動(dòng)3min，將500L不銹鋼真空酶反應(yīng)釜用100PPM/L 的二氧化氯消毒液消毒，放出消毒液后，再將浸泡的林蛙片連同浸泡汁一 起倒入酶反應(yīng)釜內(nèi)，調(diào)整PH值為7，蒸汽加熱、，溫度控制在37。C，加入 1398中性蛋白酶150g，酶活力每克90000U， 1203脂肪酶100g、乳酸菌素 100g、 Vc10.8g。密封加料罐蓋，抽真空300Pa，維持260Pa，啟動(dòng)攪拌器 攪拌使酶反應(yīng)8小時(shí)。然后用供料泵通過(guò)200目的雙聯(lián)過(guò)濾器濾出骨渣等 雜物。濾液輸送至500L的酶修飾反應(yīng)釜內(nèi)，調(diào)整PH值為7，溫度為50'C， 加入丹麥諾維信功能食品工業(yè)生產(chǎn)的FLAUOURZYME復(fù)合風(fēng)味蛋白酶 150g、磷脂酶50g，密封罐口，抽真空400Pa，維持真空360Pa。啟動(dòng)攪拌 器，攪拌酶降解6小時(shí)后，形成勃氏黏度60。C測(cè)試為8，產(chǎn)出肽蛋白率為 36%的酶解液。采用供料泵將酶解液通過(guò)140°C/s的超高溫瞬間滅酶，出料 溫度控制在50°C。趁熱用6000r/min的蝶式分離機(jī)分離酶解液10min，除去 下層液和雜質(zhì)，合并中、上層液體。輸入1000L不銹鋼稀釋罐內(nèi)加入400kg 的純凈水?dāng)嚢柘♂?0min，真空度為200Pa。啟動(dòng)板式超微膜分離器，將 580kg的稀釋液在0.4MPa循環(huán)泵的輸出壓力下通過(guò)0.2um的微膜過(guò)濾保安 器。然后啟動(dòng)5mVh的循環(huán)泵在l.OMPa的壓力下通過(guò)50000道爾頓的126 層膜板，分離出50000分子量的膠原螺旋肽液體。啟動(dòng)真空熱隔膜泵式低 溫濃縮器將分離出在55°C、真空l(shuí).OMPa的環(huán)境下除去水份70%濃縮174kg 的濃縮液。用供料泵輸入平衡罐內(nèi)。啟動(dòng)濃漿泵設(shè)置200r/min的流速將濃 縮液輸送到24(TC的離心噴霧干燥塔內(nèi)進(jìn)行干燥，在二級(jí)旋風(fēng)口集膠原螺旋 肽糖18kg，再將18kg膠原螺旋肽糖，經(jīng)自動(dòng)充膠囊，每粒膠囊300mg，共 灌300mg膠囊60000粒。采用膠囊泡罩機(jī)用PVC和鋁箔復(fù)合每板10粒。 然后每?jī)砂?0粒裝入精品盒內(nèi)獲得3000盒膠原螺旋肽膠囊成品。實(shí)施例2與實(shí)施例l不同之處在于，取秋季捕捉鮮活林蛙，100kg采用鮮活取法 剝?nèi)×滞苡秃蟮拇菩粤滞荏w和雄性林蛙。清洗干凈后裝2000克的鐵盒內(nèi)， 共裝48盒，送入一35。C的速凍盒內(nèi)進(jìn)行冷凍4小時(shí)。凍透后，將48個(gè)鐵 盒放入涼水槽內(nèi)沖3min倒出林蛙冷凍體，用電動(dòng)刨肉機(jī)刨成3mm的薄片。 放在300L不銹鋼浸泡槽內(nèi)，加入150kg的純凈水和2kg的Vc，浸泡6小 時(shí)，水溫控制在20。C，用木棒每隔30min攪動(dòng)2min，將500L不銹鋼真空 酶反應(yīng)釜用100PPM/L的二氧化氯消毒，放出消毒液后，再將浸泡的林蛙片 連同浸泡汁一起倒入酶反應(yīng)釜內(nèi)，調(diào)整PH值為7，加溫至37。C，加入1398 中性蛋白酶200g、 1203脂肪酶150g、氟硅酸鈉100g、亞硫酸鈉15g，密封 罐口，抽真空260Pa，攪拌酶反應(yīng)8小時(shí)。采用料泵通過(guò)200目的雙聯(lián)過(guò)濾 器濾出骨渣等雜物，濾液輸送至500L的酶修飾反應(yīng)釜內(nèi)，調(diào)整PH值為7、 溫度為50°C，加入丹麥諾維信功能食品工業(yè)生產(chǎn)的FLAVOURZYME200g、 磷脂酶50g，密封罐口，抽真空360Pa，攪拌酶降解4小時(shí)，通過(guò)140°C/s 瞬間滅酶。趁熱用6000r/min的分離機(jī)分離出酶解液輸入稀釋罐內(nèi)加入 400kg蒸餾水真空攪拌稀釋20min，用超微膜分離純化50000分子量的膠原 螺旋肽液體，真空低溫濃縮成210kg的膠原螺旋肽濃縮液，噴霧干燥成21kg 膠原螺旋肽糖，制成300mg的膠囊70000粒，包裝成精品3500盒林蛙膠原 螺旋肽成品。實(shí)施例3與實(shí)施例1不同之處在于a.林蛙體的貯存，收集干制的雄蛙干或取 油后的雌蛙干，貯于0—4"C冷藏庫(kù)內(nèi)備用；b. 取干制的林蛙體，用中藥切片機(jī)切成l.Omm的蛙體片，然后將蛙體 片置于不銹鋼槽內(nèi)，加入5倍蛙體重量的蒸餾水或純凈水，同時(shí)加入3%蛙 體重量的檸檬酸鈉、酒石酸或Vc，浸泡10小時(shí)，水溫控制在4(TC之內(nèi)， 每隔-60min攪拌一次；c. 復(fù)合酶解將預(yù)處理后的林蛙片連同浸泡汁，加入真空反應(yīng)釜內(nèi)，加 熱至35。C，調(diào)整PH值為6，每千克林蛙體加入6g的1398中性蛋白酶，lg 的1203脂肪酶，lg防腐劑乳酸菌素或氟硅酸鈉，每100萬(wàn)單位酶活量加入 2g亞硫酸鈉或Vc作為酶激活劑；真空度控制在100Pa，攪拌下酶解反應(yīng)6h; 然后用100目的雙聯(lián)過(guò)濾器過(guò)濾出骨渣等雜物；在復(fù)合酶解反應(yīng)下，有脫 脂反應(yīng)過(guò)程和酶解蛋白質(zhì)過(guò)程；得復(fù)合酶解液；d. 生物酶修飾經(jīng)酶降解液體含有蛋白酶與肽酶復(fù)合體，味比較苦， 為修飾苦味和徹底酶解，將復(fù)合酶解液用空氣壓力輸送至生物酶修飾反應(yīng) 釜中，調(diào)整PH值為6，溫度控制在4(TC，加入蛙體質(zhì)量0.2%的丹麥諾維 信功能食品工業(yè)生產(chǎn)的Flavourzyme復(fù)合風(fēng)味蛋白酶、0.1%的磷脂酯酰基水 解酶(俗稱磷脂酶A)，真空度為800Pa攪拌酶修飾8h;通過(guò)酶修飾成黏 度3/mpa.s6 12、產(chǎn)率36%的膠原螺旋肽分子液.
權(quán)利要求
1. 一種從林蛙組織中萃取膠原螺旋肽的制備方法，其特征在于1)林蛙體的獲取1.1林蛙體的選擇在秋季捕捉林蛙，經(jīng)干制法被剝?nèi)×滞苡秃蟮拇菩粤滞芎托坌粤滞荏w，或經(jīng)鮮活制法剝?nèi)⊥苡秃蟮男迈r雌性蛙體，或鮮活的雄性林蛙體為原料；1.2林蛙體的貯存A、收集干制的雄蛙干或取油后的雌蛙干，貯于0-4℃冷藏庫(kù)內(nèi)；B、收集鮮活雄蛙或被剝?nèi)⊥苡偷拇仆埽賰龊筚A存于-18℃的冷凍庫(kù)內(nèi)備用；2)林蛙體的預(yù)處理2.1取干制的林蛙體，用中藥切片機(jī)切成1.0-5.0mm的蛙體片，然后將蛙體片置于不銹鋼槽內(nèi)，加入1-5倍蛙體重量的蒸餾水或純凈水，同時(shí)加入1-3％蛙體重量的檸檬酸鈉、酒石酸或VC，浸泡4-10小時(shí)，水溫控制在20-40℃之內(nèi)，每隔20-60min攪拌一次；2.2取冷凍貯存的蛙體，采用電動(dòng)刨肉機(jī)，將蛙體均勻的刨成1.0-5.0mm的薄片，然后置于不銹鋼槽內(nèi)，加入1-3倍蛙體重量的蒸餾水或純凈水，同時(shí)加入1-3％蛙體重量的檸檬酸鈉、酒石酸或VC，浸泡2-6小時(shí)，每隔20-60min攪拌一次，水溫控制在10-20℃；3)生物酶解3.1復(fù)合酶解將預(yù)處理后的林蛙片連同浸泡汁，加入真空反應(yīng)釜內(nèi)，加熱至35-60℃，調(diào)整PH值為6-8，每千克林蛙體加入2-6g的1398中性蛋白酶，1-3g的1203脂肪酶，1-5g防腐劑乳酸菌素或氟硅酸鈉，每100萬(wàn)單位酶活量加入2-8g亞硫酸鈉或VC作為酶激活劑；真空度控制在100-800Pa，攪拌下酶解反應(yīng)6-12h；然后用100-300目的雙聯(lián)過(guò)濾器過(guò)濾，得復(fù)合酶解液；3.2生物酶修飾經(jīng)酶降解液體含有蛋白酶與肽酶復(fù)合體，味比較苦，為修飾苦味和徹底酶解，將復(fù)合酶解液用空氣壓力輸送至生物酶修飾反應(yīng)釜中，調(diào)整PH值為6-8，溫度控制在40-60℃，加入蛙體質(zhì)量0.2-2.0％的丹麥諾維信功能食品工業(yè)生產(chǎn)的Flavourzyme復(fù)合風(fēng)味蛋白酶、0.1-1.0％的磷脂酯酰基水解酶，真空度為200-800Pa攪拌酶修飾3-8h；得膠原螺旋肽分子液；3.3滅酶，采用超高溫瞬間滅酶法在120-150℃/s，出料溫度為30-50℃的條件下滅酶，或加溫60-80℃/30-60min使酶失活；4)膠原螺旋肽分離純化4.1離心分離采用高速離心機(jī)將酶解液以6000-60000r/min的速度離心6-20min，將上層液和中層液合并輸入稀釋罐體內(nèi)，即酶解分離液，下<pb pnum="1"/>層液被分離出去；4.2稀釋將酶解分離液，按1∶1-3重量比例加入純凈水或蒸餾水，在真空度100-800Pa攪拌稀釋?zhuān)?.3超微膜純化將稀釋液用循環(huán)泵加壓0.2MPa-0.8MPa通過(guò)平衡保險(xiǎn)分離器在0.1um-0.5um的精度下進(jìn)行分離，然后用5-50m3/h的循環(huán)泵將濾液在0.6-1.6MPa的壓力下通過(guò)50000道爾頓的超微膜純化，獲得分子量大于等于50000道爾頓的膠原螺旋肽液；4.4低溫濃縮采用熱隔膜低溫濃縮技術(shù)對(duì)膠原螺旋肽液進(jìn)行濃縮，溫度為40-60℃，真空度為0.3-1.8MPa，除去膠原螺旋肽液中30-70％體積的水分，然后將濃縮液輸送到平衡罐內(nèi)；5)干燥成型5.1噴霧干燥將濃縮液用濃漿泵以100-500r/min的流速輸入180-260℃的離心噴霧干燥塔內(nèi)干燥成粉沫；在出料口收集膠原螺旋肽粉，用復(fù)合袋密封，獲得分子量大于等于50000道爾頓的膠原螺旋肽粉。
2.按權(quán)利要求1所述的的制備方法，其特征在于將干燥后的膠原螺 旋肽粉，經(jīng)自動(dòng)充膠囊機(jī)灌上每粒200—300毫克的硬膠囊，然后泡罩成PVC 和鋁箔每板10粒。經(jīng)檢驗(yàn)包裝成精品盒或獲得林蛙膠原螺旋肽膠囊成品。
全文摘要
一種從林蛙組織中萃取膠原螺旋肽的制備方法，用干制與鮮活秋季捕捉野生或人工養(yǎng)殖雄性林蛙或被剝?nèi)×滞苡偷拇菩粤滞荏w作原料，經(jīng)預(yù)處理、復(fù)合酶解、生物酶修飾、離心分離、稀釋、超微膜純化、低溫濃縮、離心噴霧干燥、膠囊包裝成林蛙膠原螺旋肽成品。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為采用生物技術(shù)將林蛙體具有螺旋狀兩親性結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜和肌膚有高親和性的林蛙生物防護(hù)素——膠原螺旋肽通過(guò)生物酶解、修飾、分離純化、濃縮成林蛙膠原螺旋肽生物保健品，為林蛙的藥用價(jià)值、食用價(jià)值，提供了新的途徑。
文檔編號(hào)A61P37/00GK101270379SQ20071001068
公開(kāi)日2008年9月24日 申請(qǐng)日期2007年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月21日
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