專利名稱：一種螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及螺旋藻深加工及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法。
背景技術(shù)：
螺旋藻(Spirulina platensis)是ー種藍(lán)藻，具有護(hù)肝，抗氧化，防病毒，抗癌和增強(qiáng)免疫力等生理功能.螺旋藻蛋白質(zhì)占其干重的50-70%，是迄今發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)含量最高的物種之一.螺旋藻蛋白質(zhì)組成最接近于世界糧農(nóng)組織( FAO)規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，包含18種氨基酸，并具有人體必須的全部8種氨基酸，是ー種優(yōu)質(zhì)蛋白源.目前，螺旋藻主要以干粉和片劑形式使用。由于其溶解性有限，不利于人體直接吸收等問題，使其應(yīng)用受到一定的限制。因此，從螺旋藻中分離純化活性肽具有巨大的社會經(jīng)濟(jì)效益和廣泛的應(yīng)用前景。生物活性肽是指對生物機(jī)體的生命活動有益或具有生物活性的氨基酸聚合物，又稱為功能肽。其結(jié)構(gòu)松散，小至由兩個氨基酸大到由數(shù)百個氨基酸通過肽鍵連接而成?，F(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)表明，蛋白質(zhì)經(jīng)消化道酶作用后并不一定以完全游離氨基酸的形式吸收，且主要是低肽的形式吸收，具有更高的營養(yǎng)價值和生物效價。酶水解法獲得生物活性肽已經(jīng)成為エ業(yè)化生產(chǎn)生物活性肽的主要手段。惡性腫瘤已經(jīng)成為我國居民死亡的首要原因之一。目前對腫瘤患者的治療方法主要是化療和放療手段，對人體損傷嚴(yán)重。幾十年來，人們一直在探索對人體損傷小治療腫瘤方法，大多從天然動植物中尋找活性高、毒副作用小的廣譜抗腫瘤新藥。迄今為止，發(fā)現(xiàn)多種生物活性肽具有抗腫瘤活性，抗腫瘤肽因其分子量小、腫瘤細(xì)胞穿透能力強(qiáng)、提高免疫應(yīng)答、抑制腫瘤血管形成等特點(diǎn)，已經(jīng)成為腫瘤治療研究的熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
為拓展螺旋藻在食品和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，本發(fā)明的目的是提供ー種螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，采用如下技術(shù)方案
ー種螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法，首先采用反復(fù)凍融與超聲破碎相結(jié)合的方法提取螺旋藻蛋白，再由木瓜蛋白酶水解螺旋藻蛋白，然后經(jīng)超濾離心管過濾，獲得螺旋藻抗腫瘤多肽。ー種螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法，具體包括如下步驟
(I)螺旋藻粉5 50 g溶于100 1000 mL Milli-Q水中，常溫下磁力攪拌10 60 min，待其全部溶解后置于-20で冰箱中冷凍80 min中，再置于4で冰箱中解凍，依此反復(fù)凍融ー次以上；然后，采用超聲破碎方法將螺旋藻壁破碎，使得蛋白質(zhì)游離出來，將樣品置于冰浴中；最后，將獲得的溶液于溫度4 0C ,轉(zhuǎn)速為5000 10000 r/min下離心10 60 min，去除沉淀獲得蛋白上清液，再真空冷凍干燥，獲得螺旋藻蛋白質(zhì)粉。(2)以步驟(I)得到的螺旋藻蛋白質(zhì)粉為基礎(chǔ)，配置濃度為廣5% (w/v，g/mL)的螺旋藻蛋白溶液，加入木瓜蛋白酶進(jìn)行水解；水解后再滅酶，室溫冷卻后將水解液在5000r/min下離心25 min，取上清；然后，在6000 g、4で條件下經(jīng)截留分子量為10 KD的超濾離心管過濾，濾液再經(jīng)過3 KD、5 KDUO KD的超濾離心管過濾，即獲得分子量大小范圍為0-3 KD,3-5 KD,5-10 KD, >10 KD的螺旋藻多肽水解液。上述的ー種螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法，步驟(I)所述反復(fù)凍融次數(shù)為三次。上述的ー種螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法，步驟(I)所述超聲破碎方法為在10^300 W的超聲功率下每超聲5 20 s間隔:TlO s’共超聲1(Γ300次將螺旋藻壁破碎。上述的ー種螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法， 步驟(2)所述水解條件是溫度3(Γ60で，pH= 4 9，酶與底物的比2% 7% (w/v，g/mL)，水解5 12 h。上述的ー種螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法，步驟(2)所述滅酶為在100で水中滅酶 10 min。上述的制備方法，步驟(I廣(2)得到的螺旋藻多肽具有抗腫瘤活性，例如，對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和肝癌細(xì)胞H印G-2體外生長具有一定的抑制作用。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)ー步的詳細(xì)描述，但具體實(shí)施方式
不應(yīng)理解為是對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。實(shí)施例I
螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法，步驟如下
(I)螺旋藻粉25 g溶于250 mL Milli-Q水中，常溫下磁力攪拌30 min。待其全部溶解后置于-20で冰箱中冷凍80 min中，再置于4で冰箱中解凍，如此反復(fù)凍融三次。然后，采用超聲破碎方法，在130W的超聲功率下每超聲10 s間隔5 S，共超聲200次將螺旋藻壁破碎，使得蛋白質(zhì)游離出來。為了防止超聲過程中產(chǎn)生的熱量使蛋白質(zhì)變性，將樣品置于冰浴中。最后，將獲得的溶液于溫度4 °C,轉(zhuǎn)速為7000 r/min下離心30 min，去除沉淀獲得蛋白上清液，再迅速真空冷凍干燥，獲得螺旋藻蛋白質(zhì)粉。(2)以步驟(I)得到的螺旋藻蛋白質(zhì)粉為基礎(chǔ)，配置濃度為2%的螺旋藻蛋白溶液，加入木瓜蛋白酶進(jìn)行水解.實(shí)驗(yàn)條件是溫度45 °C，pH= 6. 5，酶與底物的比1.5%.水解9 h后，在100で水中滅酶10 min，室溫冷卻后將水解液在6000 r/min下離心25 min,取上清液。然后，在6000 g、4で條件下經(jīng)截留分子量為10 KD的超濾離心管過濾。濾液再經(jīng)過3 KD,5 KDUO KD的超濾離心管過濾。即可獲得分子量大小范圍為0_3 KD,3-5 KD、5-10 KD, >10 KD的螺旋藻多肽水解液。(3)步驟(I) (2)所得的螺旋藻多肽-殼聚糖納米粒進(jìn)行抗腫瘤活性檢測(使用MTT檢測方法).當(dāng)濃度為I mg/mL時，0-3 KD, 3 -5 KD,5-10 KD和>10 KD多肽對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7體外生長抑制率分別達(dá)到2%、12%、14%和11%。當(dāng)濃度為I mg/mL時，0_3KD,3 -5 KD,5-10 KD和>10 KD多肽對肝癌細(xì)胞(HepG_2)體外生長抑制率分別達(dá)到19%、12%、13% 和 12%。實(shí)施例2
螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法，步驟如下
(I)螺旋藻粉30 g溶于200 mL Milli-Q水中，常溫下磁力攪拌20 min。待其全部溶解后置于-20で冰箱中冷凍80 min中，再置于4で冰箱中解凍，如此反復(fù)凍融三次。然后，采用超聲破碎方法，在50 W的超聲功率下每超聲5 s間隔6 S，共超聲200次將螺旋藻壁破碎，使得蛋白質(zhì)游離出來。為了防止超聲過程中產(chǎn)生的熱量使蛋白質(zhì)變性，將樣品置于冰浴中。最后，將獲得的溶液于溫度4 °C,轉(zhuǎn)速為6000 r/min下離心30 min，去除沉淀獲得蛋白上清液，再迅速真空冷凍干燥，獲得螺旋藻蛋白質(zhì)粉。(2)以步驟(I)得到的螺旋藻蛋白質(zhì)粉為基礎(chǔ)，配置濃度為2%的螺旋藻蛋白溶液，加入木瓜蛋白酶進(jìn)行水解.實(shí)驗(yàn)條件是溫度55 °C，pH= 6，酶與底物的比5%.水解8 h后，在100で水中滅酶10 min，室溫冷卻后將水解液在5000 r/min下離心25 min，取上清液。然后，在6000 g、4で條件下經(jīng)截留分子量為10 KD的超濾離心管過濾。濾液再經(jīng)過3 KD,5 KDUO KD的超濾離心管過濾。即可獲得分子量大小范圍為0_3 KD,3-5 KD,5-10KD, >10 KD的螺旋藻多肽水解液。檢測方法與結(jié)果基本同實(shí)施例I。實(shí)施例3 螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法，步驟如下
(I)螺旋藻粉30 g溶于400 mL Milli-Q水中，常溫下磁力攪拌50 min。待其全部溶解后置于-20で冰箱中冷凍80 min中，再置于4で冰箱中解凍，如此反復(fù)凍融三次。然后，采用超聲破碎方法，在150 W的超聲功率下每超聲10 s間隔6 S，共超聲120次將螺旋藻壁破碎，使得蛋白質(zhì)游離出來。為了防止超聲過程中產(chǎn)生的熱量使蛋白質(zhì)變性，將樣品置于冰浴中。最后，將獲得的溶液于溫度4 0C ,轉(zhuǎn)速為5000 r/min下離心40 min，去除沉淀獲得蛋白上清液，再迅速真空冷凍干燥，獲得螺旋藻蛋白質(zhì)粉。(2)以步驟(I)得到的螺旋藻蛋白質(zhì)粉為基礎(chǔ)，配置濃度為2%的螺旋藻蛋白溶液，加入木瓜蛋白酶進(jìn)行水解.實(shí)驗(yàn)條件是溫度50 °C，pH= 9，酶與底物的比6%.水解12h后，在100で水中滅酶10 min，室溫冷卻后將水解液在5000 r/min下離心25 min，取上清液。然后，在6000 g、4で條件下經(jīng)截留分子量為10 KD的超濾離心管過濾。濾液再經(jīng)過3 KD,5 KDUO KD的超濾離心管過濾。即可獲得分子量大小范圍為0_3 KD,3-5 KD,5-10KD, >10 KD的螺旋藻多肽水解液。檢測方法與結(jié)果基本同實(shí)施例I。實(shí)施例4
螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法，步驟如下
(I)螺旋藻粉40 g溶于700 mL Milli-Q水中，常溫下磁力攪拌50 min。待其全部溶解后置于-20で冰箱中冷凍80 min中，再置于4で冰箱中解凍，如此反復(fù)凍融三次。然后，采用超聲破碎方法，在200 W的超聲功率下每超聲15 s間隔8 S，共超聲150次將螺旋藻壁破碎，使得蛋白質(zhì)游離出來。為了防止超聲過程中產(chǎn)生的熱量使蛋白質(zhì)變性，將樣品置于冰浴中。最后，將獲得的溶液于溫度4 0C ,轉(zhuǎn)速為6000 r/min下離心50 min，去除沉淀獲得蛋白上清液，再迅速真空冷凍干燥，獲得螺旋藻蛋白質(zhì)粉。(2)以步驟(I)得到的螺旋藻蛋白質(zhì)粉為基礎(chǔ)，配置濃度為2%的螺旋藻蛋白溶液，加入木瓜蛋白酶進(jìn)行水解.實(shí)驗(yàn)條件是溫度40 °C，pH=6，酶與底物的比6%.水解8h后，在100で水中滅酶10 min，室溫冷卻后將水解液在5000 r/min下離心25 min，取上清液。然后，在6000 g、4で條件下經(jīng)截留分子量為10 KD的超濾離心管過濾。濾液再經(jīng)過3 KD,5 KDUO KD的超濾離心管過濾。即可獲得分子量大小范圍為0_3 KD,3-5 KD,5-10KD, >10 KD的螺旋藻多肽水解液。檢測方法與結(jié)果基本同實(shí)施例I。
權(quán)利要求
1.一種螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法，其特征在于，首先采用反復(fù)凍融與超聲破碎相結(jié)合的方法提取螺旋藻蛋白，再由木瓜蛋白酶水解螺旋藻蛋白，然后經(jīng)超濾離心管過濾，獲得螺旋藻抗腫瘤多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法，其特征在于，具體包括如下步驟 (1)螺旋藻粉5 50g溶于100 1000 mL Milli-Q水中，常溫下磁力攪拌10 60 min,#其全部溶解后置于-20 °C冰箱中冷凍80 min中，再置于4 °C冰箱中解凍，依此反復(fù)凍融一次以上；然后，采用超聲破碎方法將螺旋藻壁破碎，使得蛋白質(zhì)游離出來，將樣品置于冰浴中；最后，將獲得的溶液于溫度4 0C ,轉(zhuǎn)速為5000 10000 r/min下離心10 60 min，去除沉淀獲得蛋白上清液，再真空冷凍干燥，獲得螺旋藻蛋白質(zhì)粉； (2)以步驟(I)得到的螺旋藻蛋白質(zhì)粉為基礎(chǔ)，配置濃度為f5% (w/v)的螺旋藻蛋白溶液，加入木瓜蛋白酶進(jìn)行水解；水解后再滅酶，室溫冷卻后將水解液在5000 r/min下離心25 min，取上清；然后，在6000 g、4 1條件下經(jīng)截留分子量為10 KD的超濾離心管過濾，濾液再經(jīng)過3 KD,5 KDUO KD的超濾離心管過濾，即獲得分子量大小范圍為0-3 KD、3-5 KD,5-10 KD, >10 KD的螺旋藻多肽水解液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法，其特征在于，步驟(I)所述反復(fù)凍融次數(shù)為三次。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法，其特征在于，步驟(I)所述超聲破碎方法為在1(T300 W的超聲功率下每超聲5 20 s間隔:TlO s,共超聲1(Γ300次將螺旋藻壁破碎。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述水解條件是溫度30 60 °C,pH= 4 9，酶與螺旋藻蛋白溶液的比2% 7%. (w/v)，水解5 12h0
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述滅酶為在100 1水中滅酶10 min。
全文摘要
本發(fā)明提供一種螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法，主要采用反復(fù)凍融與超聲破碎相結(jié)合的方法提取螺旋藻蛋白，再由木瓜蛋白酶水解螺旋藻蛋白,超濾離心管過濾,獲得分子量大小范圍為0-3KD、3-5KD、5-10KD以及大于10KD的螺旋藻多肽,并且,這樣制備的螺旋藻多肽具有抗腫瘤活性,有利于抗腫瘤保健食品和醫(yī)藥產(chǎn)品的開發(fā)利用。
文檔編號A61P35/00GK102851344SQ20121031808
公開日2013年1月2日 申請日期2012年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月31日
發(fā)明者張學(xué)武, 許平平, 張博超 申請人:華南理工大學(xué)