專利名稱：小球藻抗腫瘤多肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及小球藻深加工及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及小球藻抗腫瘤多肽的制備方法。
背景技術(shù)：
小球藻(Chlorella pyenoidosa)是ー類普生性單細胞綠藻,屬于綠藻門、小球藻屬，生長速度快，易于培養(yǎng)，應(yīng)用價值高.小球藻含有豐富的生物活性物質(zhì)和藥用成分，作為ー種新型保健食品和藥物蘊藏著巨大潛力。小球藻具有抗腫瘤活性、増加免疫力、解毒保肝、降壓作用等，其粗蛋白含量高(50%左右)，品質(zhì)好，已經(jīng)成為小球藻應(yīng)用領(lǐng)域十分活 躍、備受重視的ー個方面.
生物活性肽是指那些具有特殊生理活性或功能特性的肽類。絕大多數(shù)蛋白質(zhì)都是具有一定功能作用的生物活性肽的前體物質(zhì)，其肽鏈結(jié)構(gòu)中存在著具有一定生物活性的氨基酸序列片段(功能區(qū))，在正常狀態(tài)下，其功能區(qū)肽段隱藏在肽鏈中，但一旦單獨從蛋白質(zhì)肽鏈中釋放出來，在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境下，就能顯示出獨特的生物活性，這個功能肽段就是生物活性肽?，F(xiàn)代生物代謝研究發(fā)現(xiàn)人類攝取的蛋白質(zhì)經(jīng)過消化道的多種酶水解后，更多的是以低肽的形式直接吸收，具有更高的營養(yǎng)價值和生物效價。酶水解法獲得生物活性肽已經(jīng)成為エ業(yè)化生產(chǎn)生物活性肽的主要手段。惡性腫瘤是嚴重威脅人類健康和生命的疾病之一，目前已有的抗腫瘤藥物雖對大多數(shù)腫瘤有一定療效，但仍存在著治療效率低、選擇性差、毒副反應(yīng)大、易產(chǎn)生瘤細胞耐藥等問題。因此，從不同途徑尋找高效、低毒、特異強的抗腫瘤藥物仍是藥物治療腫瘤的當(dāng)務(wù)之急。近年來，人們越來越重視生物活性肽的研究和開發(fā)，各種生物活性肽不斷被發(fā)現(xiàn)和制備，多肽類藥物因其分子量小、無免疫原性、結(jié)構(gòu)簡單、副作用小，其抗腫瘤活性的研究正在引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容
為拓展小球藻在食品和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，本發(fā)明的目的是提供小球藻抗腫瘤多肽的制備方法。為實現(xiàn)本發(fā)明目的，采用如下技術(shù)方案
小球藻抗腫瘤多肽的制備方法，具體包括如下步驟
(1)將小球藻粉和純水混合后攪拌得混合溶液，在所述混合溶液中提取小球藻蛋白質(zhì)，得到的粗提液作為下一次的待提取溶液進行再提取，將獲得的溶液離心，去除沉淀獲得蛋白上清液，再真空冷凍干燥，獲得小球藻蛋白質(zhì)粉；
(2)以步驟(I)得到的小球藻蛋白質(zhì)粉為基礎(chǔ)，配置濃度為廣4%(w/v, g/mL)的小球藻蛋白水溶液，加胰蛋白酶進行水解，水解后，滅酶，冷卻至室溫后將水解液離心，取上清液，然后，在經(jīng)截留分子量為10 KD的超濾離心管過濾，濾液再經(jīng)過3 KD、5 KD的超濾離心管過濾，即可獲得分子量大小范圍為< 3 KD,3-5 KD,5-10 KD, >10 KD的小球藻多肽水解液。上述的小球藻抗腫瘤多肽的制備方法，步驟(I)所述小球藻粉和純水的質(zhì)量比為1:10 1:40，所述攪拌時間為30 120分鐘。上述的小球藻抗腫瘤多肽的制備方法，步驟(I)所述提取小球藻蛋白質(zhì)為在溫度4°C 10°C、壓カ50MPa 250MPa的條件下提取。上述的小球藻抗腫瘤多肽的制備方法，步驟(I)所述再提取所提取的次數(shù)為I次 8次，姆次提取的時間為IOmin 60min。上述的一種小球藻抗腫瘤多肽的制備方法，步驟(I)所述離心為在溫度Γ8 0C，轉(zhuǎn)速為 5000^10000 r/min 下離心 10 60 min。
上述的一種小球藻抗腫瘤多肽的制備方法，步驟(2)所述水解的條件是溫度3(T70 °C, pH= 5 10，水解時間為4 12h ;所述胰蛋白酶與小球藻蛋白質(zhì)水溶液的比為1% 5% (w/v, g/mL)。上述的一種小球藻抗腫瘤多肽的制備方法，步驟(2)所述滅酶為在100で水中滅酶 10 min。上述的一種小球藻抗腫瘤多肽的制備方法，步驟(2)所述離心為在8000 r/min下離心25 min。上述的一種小球藻抗腫瘤多肽的制備方法，步驟(2)所述過濾為在8000 g、4で條件下經(jīng)超濾離心管過濾。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點和技術(shù)效果
本發(fā)明得到的小球藻多肽具有下述抗腫瘤活性對人肝癌細胞H印G2體外生長具有一定的抑制作用，當(dāng)濃度為I mg/mL時，0-3 KD,3 -5 KD和5-10 KD多肽對肝癌細胞(H印G-2)體外生長抑制率分別達到7%、14%和10%。因而本發(fā)明得到的小球藻抗腫瘤多肽有利于抗腫瘤保健食品和醫(yī)藥產(chǎn)品的開發(fā)利用。
具體實施例方式以下結(jié)合實例對本發(fā)明的具體實施作進ー步說明，但本發(fā)明的實施和保護范圍不限于此。實施例I
小球藻抗腫瘤多肽的制備方法，步驟如下
(1)采用低溫超高壓連續(xù)流細胞破碎機對小球藻蛋白質(zhì)進行提取將小球藻粉和純水以1:20的質(zhì)量比混合后攪拌50分鐘得混合溶液。將上述混合溶液在溫度為6°C、壓カ為IOOMPa的條件下提取小球藻蛋白質(zhì)，得到粗提液作為下一次的待提取溶液進行再提取，提取的次數(shù)為3次，每次提取的時間為20min。最后，將獲得的溶液于溫度4 V，轉(zhuǎn)速為6000r/min下離心30 min,去除沉淀獲得蛋白上清液，再真空冷凍干燥,獲得小球藻蛋白質(zhì)粉.
(2)以步驟(I)得到的小球藻蛋白質(zhì)粉為基礎(chǔ)，配置濃度為2%的小球藻蛋白溶液，加入胰蛋白酶進行水解.實驗條件是溫度40°C，pH= 6，酶與小球藻蛋白質(zhì)水溶液的比3%.水解5 h后,在100 °C水中滅酶10 min,室溫冷卻后將水解液在8000 r/min下離心25min，取上清液。然后，在8000 g、4で條件下經(jīng)截留分子量為10 KD的超濾離心管過濾。濾液再經(jīng)過3 KD、5 KD的超濾離心管過濾(同樣在8000 g、4で條件下)。即可獲得分子量大小范圍為0-3 KD,3-5 KD,5-10 KD、>10 KD的小球藻多肽水解液。通過步驟(I) (2)所得的小球藻多肽進行抗腫瘤活性檢測(使用MTT檢測方法)，結(jié)果表明，小球藻多肽對人肝癌細胞H印G2體外生長具有一定的抑制作用，當(dāng)濃度為I mg/mL時，0-3 KD,3 -5 KD和5-10 KD多肽對肝癌細胞(!fepG-2)體外生長抑制率分別達到 7%、14% 和 10%ο實施例2
小球藻抗腫瘤多肽的制備方法，步驟如下
(1)采用低溫超高壓連續(xù)流細胞破碎機對小球藻蛋白質(zhì)進行提取將小球藻粉和純水以1:30的質(zhì)量比混合后攪拌80分鐘得混合溶液。將上述混合溶液在溫度為8°C、壓カ為150MPa的條件下提取小球藻蛋白質(zhì)，得到粗提液作為下一次的待提取 溶液進行再提取，提取的次數(shù)為6次，每次提取的時間為50min。最后，將獲得的溶液于溫度4 V，轉(zhuǎn)速為5000r/min下離心20 min,去除沉淀獲得蛋白上清液，再迅速真空冷凍干燥,獲得小球藻蛋白質(zhì)粉.
(2)以步驟(I)得到的小球藻蛋白質(zhì)粉為基礎(chǔ)，配置濃度為2%的小球藻蛋白溶液，カロ入胰蛋白酶進行水解.實驗條件是溫度50 V，pH=8，酶與底物的比4%.水解6 h后，在100°C水中滅酶10 min,室溫冷卻后將水解液在8000 r/min下離心25 min,取上清液。然后，在8000 g、4で條件下經(jīng)截留分子量為10 KD的超濾離心管過濾。濾液再經(jīng)過3 KD,5 KD的超濾離心管過濾。即可獲得分子量大小范圍為0-3 KD,3-5 KD,5-10 KD, >10 KD的小球藻多肽水解液。檢測方法與結(jié)果同實施例I。實施例3
小球藻抗腫瘤多肽的制備方法，步驟如下
(1)采用低溫超高壓連續(xù)流細胞破碎機對小球藻蛋白質(zhì)進行提取將小球藻粉和純水以1:35的質(zhì)量比混合后攪拌100分鐘得混合溶液。將上述混合溶液在溫度為9°C、壓カ為200MPa的條件下提取小球藻蛋白質(zhì)，得到粗提液作為下一次的待提取溶液進行再提取，提取的次數(shù)為2次，每次提取的時間為lOmin。最后，將獲得的溶液于溫度4 V，轉(zhuǎn)速為8000r/min下離心30 min,去除沉淀獲得蛋白上清液，再迅速真空冷凍干燥，獲得小球藻蛋白質(zhì)粉.
(2)以步驟(I)得到的小球藻蛋白質(zhì)粉為基礎(chǔ)，配置濃度為2%的小球藻蛋白溶液，カロ入胰蛋白酶進行水解.實驗條件是溫度30°C，pH= 5，酶與底物的比5%.水解8 h后，在100°C水中滅酶10 min,室溫冷卻后將水解液在8000 r/min下離心25 min,取上清液。然后，在8000 g、4で條件下經(jīng)截留分子量為10 KD的超濾離心管過濾。濾液再經(jīng)過3 KD,5 KD的超濾離心管過濾。即可獲得分子量大小范圍為0-3 KD,3-5 KD,5-10 KD, >10 KD的小球藻多肽水解液。檢測方法與結(jié)果同實施例I。實施例4
小球藻抗腫瘤多肽的制備方法，步驟如下
(I)采用低溫超高壓連續(xù)流細胞破碎機對小球藻蛋白質(zhì)進行提取將小球藻粉和純水以1:10的質(zhì)量比混合后攪拌90分鐘得混合溶液。將上述混合溶液在溫度為9°C、壓カ為250MPa的條件下提取小球藻蛋白質(zhì)，得到粗提液作為下一次的待提取溶液進行再提取，提取的次數(shù)為4次，每次提取的時間為40minn。最后，將獲得的溶液于溫度4で，轉(zhuǎn)速為10000 r/min下離心60 min,去除沉淀獲得蛋白上清液，再迅速真空冷凍干燥,獲得小球藻蛋白質(zhì)粉.
(2)以步驟(I)得到的小球藻蛋白質(zhì)粉為基礎(chǔ)，配置濃度為2%的小球藻蛋白溶液，力口入胰蛋白酶進行水解.實驗條件是溫度60 V，pH= 7，酶與底物的比3%.水解10 h后，在100 1水中滅酶10 min，室溫冷卻后將水解液在8000 r/min下離心25 min，取上清液。然后，在8000 g、4 1條件下經(jīng)截留分子量為10 KD的超濾離心管過濾。濾液再經(jīng)過3 KD、5 KD的超濾離心管過濾。即可獲得分子量大小范圍為0-3 KD,3-5 KD,5-10 KD,>10 KD的小球藻多肽水解液。檢測方法與結(jié)果同實施例I。
權(quán)利要求
1.小球藻抗腫瘤多肽的制備方法，其特征在于具體包括如下步驟 (1)將小球藻粉和純水混合后攪拌得混合溶液，在所述混合溶液中提取小球藻蛋白質(zhì)，得到的粗提液作為下一次的待提取溶液進行再提取，將獲得的溶液離心，去除沉淀獲得蛋白上清液，再真空冷凍干燥，獲得小球藻蛋白質(zhì)粉； (2)以步驟(I)得到的小球藻蛋白質(zhì)粉為基礎(chǔ)，配置濃度為f4%(w/v)的小球藻蛋白水溶液，加胰蛋白酶進行水解，水解后，滅酶，冷卻至室溫后將水解液離心，取上清液，然后，在經(jīng)截留分子量為10 KD的超濾離心管過濾，濾液再經(jīng)過3 KD、5 KD的超濾離心管過濾，SP可獲得分子量大小范圍為< 3 KD,3-5 KD,5-10 KD, >10 KD的小球藻多肽水解液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的小球藻抗腫瘤多肽的制備方法，其特征在于步驟(I)所述小球藻粉和純水的質(zhì)量比為1:10 1:40，所述攪拌時間為30 120分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的小球藻抗腫瘤多肽的制備方法，其特征在于步驟(I)所述提取小球藻蛋白質(zhì)為在溫度4°C 10°C、壓力50MPa 250MPa的條件下提取。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的小球藻抗腫瘤多肽的制備方法，其特征在于步驟(I)所述再提取所提取的次數(shù)為I次 8次，每次提取的時間為IOmin 60min。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種小球藻抗腫瘤多肽的制備方法，其特征在于步驟(I)所述離心為在溫度4 8 V，轉(zhuǎn)速為5000 10000 r/min下離心10 60 min。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種小球藻抗腫瘤多肽的制備方法，其特征在于步驟(2)所述水解的條件是溫度3(T70 °C, pH= 5 10，水解時間為4 12h ;所述胰蛋白酶與小球藻蛋白質(zhì)水溶液的比為1% 5% (w/v)。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種小球藻抗腫瘤多肽的制備方法，其特征在于步驟(2)所述滅酶為在100 1水中滅酶10 min。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種小球藻抗腫瘤多肽的制備方法，其特征在于步驟(2)所述離心為在8000 r/min下離心25 min。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種小球藻抗腫瘤多肽的制備方法，其特征在于步驟(2)所述過濾為在8000 g、4 °C條件下經(jīng)超濾離心管過濾
全文摘要
本發(fā)明提供小球藻抗腫瘤多肽的制備方法，其特征在于，首先采用低溫超高壓連續(xù)流細胞破碎機提取小球藻蛋白，再用胰蛋白酶水解小球藻蛋白,超濾離心管過濾,獲得分子量大小范圍為0-3KD、3-5KD、5-10KD以及大于10KD的小球藻多肽。本發(fā)明制備的小球藻多肽具有抗腫瘤活性,例如,對人肝癌細胞HepG2體外生長具有一定的抑制作用，當(dāng)濃度為1mg/mL時，0-3KD、3-5KD和5-10KD多肽對肝癌細胞(HepG-2)體外生長抑制率分別達到7%、14%和10%，有利于抗腫瘤保健食品和醫(yī)藥產(chǎn)品的開發(fā)利用。
文檔編號A61P35/00GK102851345SQ20121031809
公開日2013年1月2日 申請日期2012年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月31日
發(fā)明者張學(xué)武, 王曉琴 申請人:華南理工大學(xué)