穩(wěn)定的α螺旋肽及其用途
【專(zhuān)利摘要】在此描述了新的多肽及其制備方法和用途。該多肽包括交聯(lián)的(“烴環(huán)鉤”)部分以在兩個(gè)氨基酸部分之間提供限制該多肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的栓鏈。在此描述的多肽可用于治療以過(guò)度的或不適當(dāng)?shù)募?xì)胞死亡為特征的疾病。
【專(zhuān)利說(shuō)明】穩(wěn)定的α螺旋肽及其用途
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2004年11月05日和發(fā)明名稱(chēng)為“穩(wěn)定的α螺旋肽及其用途”的200480039945.9號(hào)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002]優(yōu)先權(quán)的請(qǐng)求
[0003]本申請(qǐng)?jiān)?5USC§ 119(e)下要求于2003年11月5日提交的U.S.專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)60/517，848和于2004年7月27日提交的U.S.專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)60/591，548的優(yōu)先權(quán)，其每個(gè)申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容在此并入作為參考。
[0004]背景
[0005]細(xì)胞凋亡或程序性細(xì)胞死亡在所有的多細(xì)胞生物體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的發(fā)展和保持中發(fā)揮重要的作用。對(duì)細(xì)胞凋亡的敏感性在細(xì)胞當(dāng)中是顯著不同的，并且受外部和內(nèi)部細(xì)胞事件的影響。已經(jīng)定義了介導(dǎo)細(xì)胞命運(yùn)的正反調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，并且已經(jīng)在廣譜的人類(lèi)疾病，包括各種癌癥的發(fā)病中證明了這些蛋白質(zhì)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的失調(diào)。BCL-2是這個(gè)細(xì)胞凋亡蛋白質(zhì)家族的基本成員，并且首先在t(14 ；18) (q32 ；q21)淋巴瘤的染色體斷裂點(diǎn)被鑒定出來(lái)(Bakhashi et al.1985Cell41:899 ；Cleary et al.1985Proc.Nat，1.Acad.Sc1.USA82:7439)。
[0006]基因重排將BCL-2置于免疫球蛋白重鏈基因座的轉(zhuǎn)錄調(diào)控下，產(chǎn)生BCL-2的不適當(dāng)高水平且導(dǎo)致病理性細(xì)胞存活。已經(jīng)在淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞性白血病和許多其他的惡性腫瘤的細(xì)胞凋亡中鑒定出這種失常，并且它已經(jīng)與腫瘤進(jìn)展和對(duì)化療-誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的獲得性耐受力有關(guān)。BCL-2家族的蛋白質(zhì)已有相當(dāng)多的闡述，并且包括提供控制細(xì)胞死亡敏感性的制約與平衡的促-和抗-細(xì)胞凋亡分子(圖1)。不會(huì)令人驚訝地，細(xì)胞凋亡蛋白質(zhì)已經(jīng)成為開(kāi)發(fā)防止細(xì)胞損失疾病中突然的細(xì)胞死亡并且活化惡性腫瘤中細(xì)胞死亡通路的治療劑的關(guān)鍵靶物。
[0007]BCL-2家族被定義為存在多達(dá)四個(gè)命名為BH1、BH2、BH3、和BH4的保守的“BCL-2同源，，(BH)結(jié)構(gòu)域，其都包括 α -螺旋節(jié)段(Chittenden et al.1995EMB014:5589 ；ffang etal.1996Genes Dev.10:2859)?？?細(xì)胞凋亡蛋白質(zhì)，例如BCL-2和BCL-X^在所有的BH結(jié)構(gòu)域顯示序列保守性。促-細(xì)胞凋亡蛋白質(zhì)被分為在BH1、BH2和BH3結(jié)構(gòu)域中具有同源性的“多結(jié)構(gòu)域”成員(例如BAK、BAX)，和包含專(zhuān)門(mén)在BH3兩親性的α -螺旋節(jié)段中的序列同源性的“只有ΒΗ3-結(jié)構(gòu)域”成員(例如BID、BAD、BIM, BIK、NOXA, PUMA)。BCL-2家族成員具有形成同型和雜二聚物的能力，表明在促-和抗-細(xì)胞凋亡蛋白水平之間的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合和比例支配了對(duì)死亡刺激的敏感性?？?細(xì)胞凋亡蛋白質(zhì)能夠保護(hù)細(xì)胞避免促-細(xì)胞凋亡過(guò)量，即過(guò)度的程序性細(xì)胞死亡。附加的“安全”測(cè)量包括調(diào)節(jié)促-細(xì)胞凋亡蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄并保持他們?yōu)榉腔罨臉?gòu)象體，其需要蛋白水解的活化、去磷酸化、或配體-誘導(dǎo)的構(gòu)象變化來(lái)活化促-死亡功能。在某些細(xì)胞類(lèi)型中，在質(zhì)膜收到的死亡信號(hào)通過(guò)線(xiàn)粒體途徑觸發(fā)細(xì)胞凋亡(圖2)。線(xiàn)粒體可通過(guò)隔離細(xì)胞色素C，這一活化胱冬蛋白酶9而導(dǎo)致致命的下游蛋白水解事件的細(xì)胞溶質(zhì)復(fù)合物的關(guān)鍵成分來(lái)作為細(xì)胞死亡的看門(mén)者發(fā)揮作用。多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)，例如BCL-2/BCL-X^和BAK/BAX在線(xiàn)粒體膜發(fā)揮保護(hù)者和執(zhí)行者的作用，其活性進(jìn)一步受到上游BH3-BCL-2家族的唯一成員的調(diào)節(jié)。例如，BID是促-細(xì)胞凋亡蛋白質(zhì)的“只有BH3-結(jié)構(gòu)域”子集中的成員，并且傳輸在質(zhì)膜收到的死亡信號(hào)至在線(xiàn)粒體膜的效應(yīng)物促-細(xì)胞凋亡蛋白質(zhì)。BID具有與促-和抗-細(xì)胞凋亡蛋白質(zhì)相互作用的獨(dú)特能力，并且當(dāng)受到胱冬蛋白酶8的活化時(shí)，觸發(fā)細(xì)胞色素c釋放和線(xiàn)粒體的細(xì)胞凋亡。缺失和誘變研究確定促細(xì)胞凋亡家族成員的兩親性α -螺旋ΒΗ3節(jié)段起死亡結(jié)構(gòu)域的作用，并且因此表現(xiàn)出與多結(jié)構(gòu)域細(xì)胞凋亡蛋白質(zhì)相互作用的決定性結(jié)構(gòu)基序。結(jié)構(gòu)研究已經(jīng)證明ΒΗ3螺旋通過(guò)插入由BHl、2和3結(jié)構(gòu)域的接觸面形成的疏水性溝槽而與抗-細(xì)胞凋亡蛋白質(zhì)相互作用。活化的BID可被抗-細(xì)胞凋亡蛋白質(zhì)結(jié)合和隔離(例如，BCL-2和BCL-XJ并且可觸發(fā)促-細(xì)胞凋亡蛋白質(zhì)BAX和BAK的活化，導(dǎo)致細(xì)胞色素c釋放和線(xiàn)粒體的細(xì)胞凋亡程序。
[0008]BAD也是“只有ΒΗ3-結(jié)構(gòu)域”(BH3_domain only)的促-細(xì)胞凋亡家族成員，其表達(dá)同樣觸發(fā)BAX/BAK的活化。然而與BID相反，BAD顯示優(yōu)先結(jié)合抗-細(xì)胞凋亡成員，BCL-2和BCL-Xp盡管BAD BH3結(jié)構(gòu)域顯示高親合力結(jié)合BCL-2，BAD BH3肽不能體外活化細(xì)胞色素c從線(xiàn)粒體釋放，表明BAD不是BAX/BAK的直接活化劑。過(guò)表達(dá)BCL-2的線(xiàn)粒體抗BID-誘導(dǎo)細(xì)胞色素c釋放，但與BAD的共同治療可恢復(fù)BID靈敏性。由BAD誘導(dǎo)的線(xiàn)粒體的細(xì)胞凋亡看來(lái)似乎是由于:(I) BAX/BAK活化劑，例如BID和BID-樣的蛋白質(zhì)從BCL-2/BCL-X^結(jié)合袋的置換(displacement)，或(2) BCL_2/BCL_Xl結(jié)合袋被BAD選擇性占據(jù)而阻止BID-樣蛋白質(zhì)被抗-細(xì)胞凋亡蛋白質(zhì)螯合分離。因此，已經(jīng)出現(xiàn)兩種類(lèi)型的“只有BH3-結(jié)構(gòu)域”的蛋白質(zhì)，BID-樣蛋白質(zhì)直接活化線(xiàn)粒體的細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)AD-樣蛋白質(zhì)具有敏化線(xiàn)粒體為被多結(jié)構(gòu)域抗-細(xì)胞凋亡蛋白質(zhì)的結(jié)合袋占據(jù)的BID-樣促-細(xì)胞凋亡的能力。
[0009]已經(jīng)對(duì)鑒定或產(chǎn)生小分子以體外探測(cè)細(xì)胞凋亡蛋白質(zhì)功能并且在體內(nèi)特異控制細(xì)胞凋亡途徑的目的提出挑戰(zhàn)。高流通量篩選已經(jīng)鑒定了抑制BAK BH3結(jié)構(gòu)域與BCL-X^微摩爾親合力的相互作用的若干分子。除鑒定低親合力化合物的潛在缺陷之外，該技術(shù)在產(chǎn)生適合蛋白質(zhì)家族個(gè)別成員的精細(xì)結(jié)合特異性的化合物控制板的其能力方面受到限制?？刂萍?xì)胞凋亡途徑的備選途徑來(lái)源于 肽工程化，該技術(shù)使用非特異的肽序列來(lái)產(chǎn)生具有所需要三維結(jié)構(gòu)的化合物。這種技術(shù)的一個(gè)應(yīng)用涉及產(chǎn)生由用于通過(guò)破裂線(xiàn)粒體膜來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的非特異性肽序列組成的“促-細(xì)胞凋亡” α -螺旋。
[0010]α-螺旋是蛋白質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)成份之一并且經(jīng)常在蛋白質(zhì)接觸界面被發(fā)現(xiàn)，其參與多種分子間的生物學(xué)識(shí)別事件。理論上，螺旋肽，例如ΒΗ3螺旋，可用于有選擇地干擾或穩(wěn)定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，由此控制生理學(xué)過(guò)程。然而，當(dāng)從全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的范圍內(nèi)取出并被放入溶液中時(shí)，蛋白質(zhì)內(nèi)的生物學(xué)活化的螺旋基序一般具有很少的結(jié)構(gòu)。因此，蛋白質(zhì)肽片段已經(jīng)由于二級(jí)結(jié)構(gòu)螺旋的損失損害了其作為體內(nèi)反應(yīng)物的效力，其對(duì)蛋白水解的敏感性退化，并且不能透入完整細(xì)胞。盡管已經(jīng)報(bào)道了共價(jià)螺旋穩(wěn)定化的若干方法，大多數(shù)方法論涉及極化和/或不穩(wěn)定的交聯(lián)(Phelan et al.1997J.Am.Chem.Soc.119:455 ；Leuc et al.2003Proc.Nat，1.Acad.Sc1.USAlOO:11273 ；Bracken et al., 1994J.Am.Chem.Soc.116:6432 ；Yan et al.2004Bioorg.Med.Chem.14:1403)。隨后，Verdine 及其同事開(kāi)發(fā)了備選的基于置換的方法，其使用包含烷基栓鏈(tethers)的α，α-二取代的非天然氨基酸(Schafmeister et al.，2000J.Am.Chem.Soc.122:5891 ；Blackwell et al.1994AngewChem.1nt.Ed.37:3281)。
[0011]概述
[0012]本發(fā)明部分地基于具有至少兩個(gè)改變氨基酸(定義為“烴環(huán)鉤”(hydro carbonstapling)方法)的穩(wěn)定交聯(lián)的多肽可幫助構(gòu)象地賦予該多肽天然二級(jí)結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)。例如，使傾向于具有α-螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽交聯(lián)可約束該多肽至其天然的α-螺旋構(gòu)象。被約束的二級(jí)結(jié)構(gòu)可增加該多肽對(duì)蛋白水解切割的耐受性并且也增加疏水性。令人驚訝地，在有些情況下，該多肽可透過(guò)細(xì)胞膜(例如，通過(guò)能量-依賴(lài)的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，例如胞飲作用)。因此,在此描述的交聯(lián)多肽可相對(duì)于相應(yīng)的未交聯(lián)多肽具有改善的生物活性。例如該交聯(lián)的多肽可包括BCL-2家族成員多肽的α -螺旋結(jié)構(gòu)域(例如，BID-BH3結(jié)構(gòu)域)，其可結(jié)合ΒΑΚ/ΒΑΧ和/或BCL-2/BCL-X^以在受試體中促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在有些情況下，該交聯(lián)的多肽可用于抑制細(xì)胞凋亡。可治療性地使用該在此所描述的交聯(lián)多肽，例如，在受試體中用于治療癌癥。
[0013]在一個(gè)方面，本發(fā)明描述了通式⑴的多肽，
[0014]
【權(quán)利要求】
1.通式(I)的多肽，
2.權(quán)利要求1的多肽，其中該多肽結(jié)合BCL-2家族多肽。
3.權(quán)利要求1的多肽,其中該多肽結(jié)合抗-細(xì)胞凋亡多肽。
4.權(quán)利要求1的多肽，其中該多肽結(jié)合ΒΗ1、ΒΗ2或ΒΗ3結(jié)構(gòu)域。
5.權(quán)利要求1的多肽,其中該多肽活化線(xiàn)粒體的細(xì)胞死亡。
6.權(quán)利要求1的多肽,其中該多肽活化細(xì)胞死亡。
7.權(quán)利要求1的多肽,其中該多肽抑制細(xì)胞死亡。
8.權(quán)利要求1的多肽，其中該多肽包括ΒΗ3結(jié)構(gòu)域。
9.權(quán)利要求1的多肽，其中X是2、3、或6。
10.權(quán)利要求1的多肽,其中每個(gè)y獨(dú)立地是3和15之間的整數(shù)。
11.權(quán)利要求1的多肽，其中R1和R2各自獨(dú)立地是H或C1-C6烷基。
12.權(quán)利要求1的多肽，其中R1和R2各自獨(dú)立地是C1-C3烷基。
13.權(quán)利要求11的多肽，其中R1和R2中的至少一個(gè)是甲基。
14.權(quán)利要求12的多肽，其中R1和R2是甲基。
15.權(quán)利要求1的多肽，其中R3是烷基。
16.權(quán)利要求14的多肽，其中X是3。
17.權(quán)利要求15的多肽，其中R3是C8烷基。
18.權(quán)利要求14的多肽，其中X是6。
19.權(quán)利要求17的多肽，其中R3是C11烷基。
20.權(quán)利要求1的多肽，其中R3是烯基。
21.權(quán)利要求18的多肽，其中X是3。
22.權(quán)利要求20的多肽，其中R3是C8烯基。
23.權(quán)利要求19的多肽，其中X是6。
24.權(quán)利要求19的多肽，其中R3是C11烯基。
25.權(quán)利要求1的多肽，其中R3是直鏈烷基、烯基、或炔基。
26.權(quán)利要求1的多肽，其中R3是[R4-K-R4];以及R4是直鏈烷基、烯基、或炔基。
27.權(quán)利要求1的多肽，該多肽包括與SEQID NO:1的氨基酸序列至少大約60%同一性的氨基酸序列。
28.權(quán)利要求15的多肽，其中R3是烷基或烯基。
29.權(quán)利要求15的多肽，其中R1或R2中的至少一個(gè)是烷基。
30.權(quán)利要求11的多肽，其中每個(gè)R1和R2獨(dú)立地是H或C1-C3烷基。
31.權(quán)利要求1的多肽，其中R1和R2是甲基。
32.權(quán)利要求1的多肽，其中X是3或7以及ζ是O。
33.權(quán)利要求1的多肽，其中R3是C8或C11烷基或烯基。
34.權(quán)利要求1的多肽，該多肽包括與SEQID NO:2的氨基酸序列至少大約80%同一性的氨基酸序列。
35.權(quán)利要求1的多肽，其中該多肽轉(zhuǎn)運(yùn)通過(guò)細(xì)胞膜。
36.權(quán)利要求1的多肽，其中該多肽主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)通過(guò)細(xì)胞膜。
37.權(quán)利要求1的多肽，進(jìn)一步包括熒光部分或放射性同位素。
38.權(quán)利要求1的多肽，其中該多肽包括23個(gè)氨基酸； R1和R2是甲基； R3是C8烷基、C11烷基、C8烯基或C11烯基；以及 X是2、3或6。
39.權(quán)利要求1的多肽,進(jìn)一步包括親和標(biāo)記。
40.權(quán)利要求1的多肽，進(jìn)一步包括靶部分。
41.權(quán)利要求1的多肽，進(jìn)一步包括生物素部分。
42.權(quán)利要求1的多肽，其中該多肽是選自圖5所示多肽的多肽。
43.制備通式(III)的多肽的方法，包括 提供通式(II)的多肽；以及
44.權(quán)利要求43的方法，其中該多肽結(jié)合BCL-2家族成員多肽。
45.權(quán)利要求43的方法，其中該催化劑是釕催化劑。
46.權(quán)利要求43的方法，進(jìn)一步包括在環(huán)閉合置換作用之后提供還原劑或氧化劑。
47.權(quán)利要求46的方法，其中該還原劑是H2或氧化劑是四氧化鋨
48.治療受試體的方法，包括將權(quán)利要求1的化合物施用于該受試體。
49.權(quán)利要求48的方法，進(jìn)一步包括施用附加的治療劑。
50.在受試體中治療癌癥的方法，包括將權(quán)利要求1的化合物施用于該受試體。
51.權(quán)利要求45的方法，進(jìn)一步包括施用附加的治療劑。
52.權(quán)利要求1，通式(I)的化合物的文庫(kù)。
53.鑒定用于促進(jìn)細(xì)胞凋亡的候選化合物的方法，包括； 提供線(xiàn)粒體； 使該線(xiàn)粒體與權(quán)利要求1的化合物接觸； 測(cè)量細(xì)胞色素c釋放；以及 與缺少權(quán)利要求1的化合物時(shí)的細(xì)胞色素c釋放比較在存在權(quán)利要求1的化合物時(shí)的細(xì)胞色素c釋放，其中在存在權(quán)利要求1的化合物時(shí)細(xì)胞色素c釋放增加則鑒定該權(quán)利要求I的化合物為用于促進(jìn)細(xì)胞凋亡的候選化合物。
54.通式(IV)的多肽，

55.通式(I)的多肽，
56.權(quán)利要求55的多肽，其中通過(guò)圓二色光譜測(cè)定該多肽具有至少35%的α螺旋度。
57.權(quán)利要求55的多肽，其屮通過(guò)圓二色光譜測(cè)定該多肽具有至少50%的α螺旋度。
58.權(quán)利要求55的多肽,其屮通過(guò)圓二色光譜測(cè)定該多肽具有至少60%的α螺旋度。
59.權(quán)利要求55的多肽,其中通過(guò)圓二色光譜測(cè)定該多肽具有至少70%的α螺旋度。
60.權(quán)利要求55的多肽,其中通過(guò)圓二色光譜測(cè)定該多肽具有至少80%的α螺旋度。
61.權(quán)利要求55的多肽,其中通過(guò)圓二色光譜測(cè)定該多肽具有至少90%的α螺旋度。
62.通式(I)的多肽，
63.權(quán)利要求62，通式(I)的多肽，其中通過(guò)圓二色光譜測(cè)定該多肽與通式(IV)的多肽相比具有至少1.5倍的α螺旋度增加。
64.權(quán)利要求62，通式(I)的多肽，其中通過(guò)圓二色光譜測(cè)定該多肽與通式(IV)的多肽相比具有至少1.75倍的α螺旋度增加。
65.權(quán)利要求62，通式(I)的多肽，其中通過(guò)圓二色光譜測(cè)定該多肽與通式(IV)的多肽相比具有至少2.0倍的α螺旋度增加。
66.權(quán)利要求62，通式(I)的多肽，其中通過(guò)圓二色光譜測(cè)定該多肽與通式(IV)的多肽相比具有至少2.5倍的α螺旋度增加。
67.權(quán)利要求62，通式(I)的多肽，其中通過(guò)圓二色光譜測(cè)定該多肽與通式(IV)的多肽相比具有至少3倍的α螺旋度增加。
68.權(quán)利要求62，通式(I)的多肽，其中通過(guò)圓二色光譜測(cè)定該多肽與通式(IV)的多肽相比具有至少4倍的α螺旋度增加。
69.鑒定用于抑制細(xì)胞凋亡的候選化合物的方法，包括； 提供線(xiàn)粒體； 使該線(xiàn)粒體與權(quán)利要求1的化合物接觸； 測(cè)量細(xì)胞色素c釋放；以及 與缺少權(quán)利要求1的化合物時(shí)的細(xì)胞色素c釋放比較在存在權(quán)利要求1的化合物時(shí)的細(xì)胞色素c釋放，其中在存在權(quán)利要求1的化合物時(shí)細(xì)胞色素c釋放降低則鑒定該權(quán)利要求I的化合物為用于抑制細(xì)胞凋亡的候選化合物。
【文檔編號(hào)】C07K14/00GK103467588SQ201310178526
【公開(kāi)日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2004年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2003年11月5日
【發(fā)明者】洛倫·D·沃倫斯基, 斯坦利·J·科斯邁耶, 格雷戈里·弗迪恩 申請(qǐng)人:達(dá)納-法伯癌癥研究所股份有限公司, 哈佛大學(xué)的校長(zhǎng)及成員們