本發(fā)明主要涉及免疫檢測(cè)技術(shù)。具體而言，本發(fā)明涉及可用于診斷系統(tǒng)性紅斑狼瘡的多肽檢測(cè)器件、檢測(cè)試劑盒及診斷方法。
背景技術(shù)：
系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemiclupuserythematosus,sle)是一種以自身抗體產(chǎn)生和免疫復(fù)合物形成為特征的自身免疫性疾病，臨床表現(xiàn)為全身癥狀及多系統(tǒng)多器官受累的癥狀，嚴(yán)重影響患者的壽命和生活質(zhì)量。我國(guó)sle的發(fā)病率為70.1/10萬(wàn)，并且有逐年上升的趨勢(shì)。sle的早期診斷、早期治療是改善預(yù)后的關(guān)鍵。然而我國(guó)自身免疫性疾病診斷水平較低，并且診斷試劑主要依賴進(jìn)口，造成診斷費(fèi)用昂貴，增加了國(guó)家和患者的醫(yī)療成本，也不利于向基層醫(yī)院普及。因此，建立穩(wěn)定、快捷、適合推廣的檢測(cè)方法，是目前需要解決的問題。
目前臨床開展的sle相關(guān)自身抗體常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目主要有抗核抗體(ana)、抗dsdna抗體、抗ena抗體(包括抗sm、抗u1rnp、抗ssa/ro、抗ssb/la、抗rrnp、抗scl-70和抗jo-1等)、抗核抗體和抗磷脂抗體等。對(duì)于臨床疑似sle的病人應(yīng)進(jìn)行自身抗體檢測(cè)。在美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)修訂的sle分類標(biāo)準(zhǔn)中，免疫學(xué)異常和自身抗體陽(yáng)性包括抗sm抗體、抗dsdna抗體、抗磷脂抗體和ana陽(yáng)性?，F(xiàn)有技術(shù)中的檢測(cè)方法由于特異性和靈敏度不高，還不存在較理想的血清學(xué)檢測(cè)指標(biāo)。比如現(xiàn)有技術(shù)中scofieldrh等人報(bào)道ssa或者說抗核抗體陽(yáng)性率只有60％左右(anti-rofinespecificitydefinedbymultipleantigenicpeptidesidentifiescomponentsoftertiaryepitopes.clinexpimmunol109:480-7.)。如果能夠建立sle特異的“自身抗體譜”檢測(cè)方法，同時(shí)檢測(cè)多種特異性抗體，提高檢出率及準(zhǔn)確性,將為sle的診斷、分類、療效觀察和預(yù)后判斷提供可靠的依據(jù)，這將具有重要的臨床意義。因此，尋找一種敏感性強(qiáng)、特異性高而又簡(jiǎn)便易行的血清學(xué)檢測(cè)方法，對(duì)sle的早期診斷及治療具有重要意義。
同時(shí)，大量自身抗體的出現(xiàn)是自身免疫性疾病的重要特征之一，但由于其發(fā)病機(jī)制尚不明確，難以直接利用自身抗原檢測(cè)抗體?？乖砦?epitope)是抗原分子中識(shí)別、結(jié)合抗體的基礎(chǔ)，因此是檢測(cè)抗體的實(shí)際有效組分。以抗原表位肽或其模擬肽(mimotope)作為診斷工具有以下幾個(gè)優(yōu)勢(shì)：1)可以提高診斷的靈敏度和特異性，避免了生物大分子易產(chǎn)生的非特異性結(jié)合(deroosetal(2001)combchemhighthroughputscreen4:75–115)；2)擴(kuò)大疾病診斷的范圍，對(duì)于研究較少或難以體外應(yīng)用的自身抗原如核酸抗原、多糖抗原、脂類抗原，以模擬肽作為天然抗原的替代物進(jìn)行診斷，也可以獲得與天然抗原表位一致的結(jié)果(bruceg(1997)procnatlacadsciusa94：1955–1960；jinapingqetal(1999)hyridoma18(1)：103–109)；3)多肽制備、應(yīng)用的成本低、易于質(zhì)控。因此，自身抗原表位肽或其模擬肽(meloenrhetal(2000)jmolrecognit13:352-359)的獲得是制備自身抗體的多肽檢測(cè)試劑的基礎(chǔ)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供新的可用于診斷sle的檢測(cè)器件、診斷試劑盒，以及診斷sle的方法。此外，本發(fā)明還提供特定多肽的組合在制備用于sle疾病的試劑盒或檢測(cè)器件中的用途。
現(xiàn)有技術(shù)中關(guān)于ssa或者抗核抗體陽(yáng)性率只有60％左右，本發(fā)明人提供了11條多肽表位。在以受試者來(lái)源的生物樣本是否對(duì)所述11條多肽中的至少兩條或兩條以上有響應(yīng)作為判定受試者是否為sle患者的指標(biāo)的情況下，可以高達(dá)89.4％的靈敏度(且準(zhǔn)確性達(dá)到92.4％)診斷和篩查sle。
因此，本發(fā)明一方面提供一種檢測(cè)器件，其包括固體載體，以及獨(dú)立地連接于該固體載體上的下述的多肽：
seqidno：1所示的多肽；
seqidno：2所示的多肽；
seqidno：3所示的多肽；
seqidno：4所示的多肽；
seqidno：5所示的多肽；
seqidno：6所示的多肽；
seqidno：7所示的多肽；
seqidno：8所示的多肽；
seqidno：9所示的多肽；
seqidno：10所示的多肽；和
seqidno：11所示的多肽。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，所述的固體載體是ipdms薄膜。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，其用于sle的診斷。
此外，本發(fā)明的另一方面是提供一種sle診斷試劑盒，其包括一個(gè)或多個(gè)固體載體，以及連接于所述一個(gè)或多個(gè)固體載體上的下述多肽：、
seqidno：1所示的多肽；
seqidno：2所示的多肽；
seqidno：3所示的多肽；
seqidno：4所示的多肽；
seqidno：5所示的多肽；
seqidno：6所示的多肽；
seqidno：7所示的多肽；
seqidno：8所示的多肽；
seqidno：9所示的多肽；
seqidno：10所示的多肽；和
seqidno：11所示的多肽。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，所述固體載體是ipdms薄膜。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，其中，seqidno：1～11所示的多肽獨(dú)立地連接于同一固體載體上。
另外，本發(fā)明的另一方面提供下述多肽在制備sle診斷試劑盒或檢測(cè)器件中的用途：
seqidno：1所示的多肽；
seqidno：2所示的多肽；
seqidno：3所示的多肽；
seqidno：4所示的多肽；
seqidno：5所示的多肽；
seqidno：6所示的多肽；
seqidno：7所示的多肽；
seqidno：8所示的多肽；
seqidno：9所示的多肽；
seqidno：10所示的多肽；和
seqidno：11所示的多肽。
此外，本發(fā)明的另一方面提供一種診斷受試者是否為sle患者的方法，該方法包括：
使用權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)器件、或者權(quán)利要求4～6中任一項(xiàng)所述的sle檢測(cè)seqidno：1～11所示的多肽是否對(duì)受試者來(lái)源的血液樣本有響應(yīng)；其中，
當(dāng)檢測(cè)到選自下述多肽1～11中的至少兩個(gè)或兩個(gè)以上的多肽對(duì)所述受試者來(lái)源的血液樣本有響應(yīng)時(shí)，判定受試者是sle患者；否則，判定受試者不是sle患者。
seqidno：1所示的多肽；
seqidno：2所示的多肽；
seqidno：3所示的多肽；
seqidno：4所示的多肽；
seqidno：5所示的多肽；
seqidno：6所示的多肽；
seqidno：7所示的多肽；
seqidno：8所示的多肽；
seqidno：9所示的多肽；
seqidno：10所示的多肽；和
seqidno：11所示的多肽。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，所述血液樣本為全血、血漿或血清。
具體實(shí)施方式
本說明書中，下述多肽1～11：
seqidno：1所示的多肽相當(dāng)于60kdaro蛋白(60kdaro/ssaautoantigen)的1位～20位；
seqidno：2所示的多肽相當(dāng)于52kdaro蛋白(52kdaro/ssaautoantigen)的221位～240位；
seqidno：3所示的多肽相當(dāng)于60kdaro蛋白(60kdaro/ssaautoantigen)的421位～440位；
seqidno：4所示的多肽相當(dāng)于60kdaro蛋白(60kdaro/ssaautoantigen)的451位～470位；
seqidno：5所示的多肽相當(dāng)于組織蛋白酶g(cathepsing)的186位～200位；
seqidno：6所示的多肽相當(dāng)于組織蛋白酶g(cathepsing的191位～210位；
seqidno：7所示的多肽相當(dāng)于sm自身抗原(smithautoantigen的106位～126位；
seqidno：8所示的多肽相當(dāng)于sm自身抗原(smithautoantigen的1位～20位。
seqidno：9所示的多肽相當(dāng)于sm自身抗原(smithautoantigen的70位～90位；
seqidno：10所示的多肽相當(dāng)于sm自身抗原(smithautoantigen的83位～105位。
seqidno：11所示的多肽相當(dāng)于sm自身抗原(smithautoantigen的90位～119位。
在本說明書中，檢出率是指：用臨床診斷方法確診的陽(yáng)性樣本，經(jīng)本法測(cè)定的陽(yáng)性樣本的比例。假陽(yáng)性率是指：用臨床診斷方法確診的陰性樣本，經(jīng)本法測(cè)定的陽(yáng)性樣本的比例。診斷是指：確診或?yàn)榇_診提供參考信息。
如實(shí)施例所示，所述多肽集合對(duì)sle疾病人的血清呈陽(yáng)性反應(yīng)，而對(duì)健康正常人或非sle病人血清呈陰性反應(yīng)，因此，所述多肽集合作為sle引起的疾病(例如sle)的診斷工具是有用的。
本說明書中，陽(yáng)性反應(yīng)是指：選自所述多肽1～11中的至少任意兩個(gè)或兩個(gè)以上多肽對(duì)所述受試者來(lái)源的血液樣本有響應(yīng)；否則為陰性反應(yīng)。響應(yīng)是指：信噪比(snr)大于或等于2，其中，信噪比＝(多肽點(diǎn)信號(hào)值-陰性對(duì)照點(diǎn)信號(hào)值)/陰性對(duì)照點(diǎn)信號(hào)值。
所述多肽可以適宜采用(1)化學(xué)合成方法、或(2)酶反應(yīng)合成方法等公知方法來(lái)獲得，其中化學(xué)合成更為簡(jiǎn)便。在化學(xué)合成本發(fā)明的多肽情況下，通過使用肽合成儀合成或者半合成該多肽來(lái)進(jìn)行。作為化學(xué)合成方法，可以列舉出例如肽固相合成法等。這樣合成的肽可以采用常規(guī)手段例如離子交換色譜、反相高效液體色譜、親和色譜等進(jìn)行純化。這樣的肽固相合成方法以及其后的肽純化都是本技術(shù)領(lǐng)域公知的。
此外，在通過酶反應(yīng)生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的情況下，可以采用例如國(guó)際公開小冊(cè)子wo2004/011653號(hào)所述的方法。即，可以這樣來(lái)生產(chǎn)：將一方的氨基酸或二肽的羧基末端被酯化或酰胺化而得到的氨基酸或二肽、與氨基酸處于游離狀態(tài)的氨基酸(例如羧基保護(hù)的氨基酸)在肽合成酶的存在下進(jìn)行反應(yīng)，生成的二肽或三肽。作為肽合成酶，可以列舉出：具有生成肽的能力的微生物的培養(yǎng)物、由該培養(yǎng)物分離的微生物菌體、或該微生物的菌體處理物、或該微生物來(lái)源的肽合成酶。
特別是多肽的化學(xué)合成已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化，可以通過委托專業(yè)的多肽合成公司來(lái)合成所述多肽。
檢測(cè)器件
本發(fā)明提供一種檢測(cè)器件，包括一個(gè)或多個(gè)固體載體，以及獨(dú)立地連接于所述一個(gè)或多個(gè)固體載體上的多肽組合物。
在本發(fā)明中，對(duì)固體載體沒有特殊限制，只要是作為固體或不溶性材料(例如是可以通過過濾、沉淀、磁性分離等從反應(yīng)混合物中分離的材料)的載體即可。
構(gòu)成固體載體的材料包括但不限于：硅膠(聚二甲基硅氧烷，pdms)、纖維素、特氟隆tm、硝基纖維素、瓊脂糖、葡聚糖、殼聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚丙烯、尼龍、聚偏二氟乙烯、膠乳、二氧化硅、玻璃、玻璃纖維、金、鉑、銀、銅、鐵、不銹鋼、鐵氧體、硅晶片、聚乙烯、聚乙烯亞胺、聚乳酸、樹脂、多糖類、蛋白(白蛋白等)、碳或它們的組合等。
固體載體的形狀包括但不限于：珠子、磁珠、薄膜、微細(xì)管、濾膜、板、微量板、碳納米管、傳感器芯片等。正如本技術(shù)領(lǐng)域公知的那樣，薄膜或板等平坦的固體載體上可以設(shè)置凹坑、溝槽、濾膜底部等。
在本發(fā)明中，磁珠可以具有約25nm～約1mm范圍的球體直徑。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，磁珠具有約50nm～約10μm范圍的直徑。磁珠的尺寸可以根據(jù)特定的用途來(lái)進(jìn)行選擇。
在本發(fā)明中，由sepharose等高交聯(lián)球形瓊脂糖制成的珠子具有約24μm～約165μm范圍的直徑。優(yōu)選地，高交聯(lián)球形瓊脂糖珠具有約24μm～約44μm范圍的直徑。高交聯(lián)球形瓊脂糖珠的尺寸可以根據(jù)特定的用途來(lái)進(jìn)行選擇。
具有疏水性表面的固體載體的例子包括可從polysciences，warrington，pa或spherotech，liberville，il購(gòu)買的制品等聚苯乙烯膠乳珠。
二氧化硅(sio2)-處理或二氧化硅(sio2)基的固體載體的例子包括可從polysciences，warrington，pa購(gòu)買的超常磁性二氧化硅珠等，其可以用于捕捉核酸(例如dna)。或者，還可以使用可從dynalbiotech購(gòu)買的m-280等。
具有親水性表面的磁珠可用于捕捉增殖期的細(xì)菌細(xì)胞、核酸以及其它成分。作為該磁珠的例子，可以列舉出polysciences，warrington，pa銷售的珠子(名稱：biomag(注冊(cè)商標(biāo))羧基)、或者bangslaboratory，inc.，fishers，in的名稱為mc02n/2928的珠子。或者，可以使用dynalbiotech銷售的m-270等。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述固體載體是ipdms薄膜，其是蘇州偲聚生物材料有限公司開發(fā)的一種硅橡膠材質(zhì)的微陣列固體支撐材料(ipdms薄膜，參見中國(guó)專利cn101265329a)。這種材料是以生物學(xué)研究常用的pdms為基礎(chǔ)，在其中加入特定的引發(fā)劑成分(使該材料可通過表面引發(fā)聚合反應(yīng)(sip)實(shí)現(xiàn)表面功能化修飾)，再經(jīng)過聚乙二醇甲基丙烯酸酯(poly(oligo(ethyleneglycol)methacrylate),poegma)表面修飾獲得的。ipdms薄膜具有優(yōu)秀的抗蛋白質(zhì)非特異性吸附(nonspecificproteinadsorption,npa)能力，可以將復(fù)雜蛋白免疫檢測(cè)中的非特異性蛋白質(zhì)吸附控制到接近“絕對(duì)0”水平(接近或低于儀器的檢測(cè)極限)，不僅可以免除封閉和多次清洗的麻煩，還可以通過使用更強(qiáng)的信號(hào)擴(kuò)增手段來(lái)提高蛋白質(zhì)微陣列的靈敏性。而且其硅橡膠的本質(zhì)賦予了該材料較強(qiáng)的機(jī)械性能和良好的可操作性。蘇州偲聚公司已經(jīng)成功地將ipdms薄膜應(yīng)用于11個(gè)腫瘤標(biāo)志物組成的多指標(biāo)聯(lián)檢微陣列elisa試劑盒，實(shí)現(xiàn)了高通量和高靈敏的檢測(cè)，證明了這種材料是一種優(yōu)秀的蛋白質(zhì)微陣列固體支撐材料。同時(shí)，這種材料還具有表面性質(zhì)可調(diào)的特性，可以通過控制修飾反應(yīng)時(shí)間在一定范圍內(nèi)調(diào)整其表面形貌。
本發(fā)明中，多肽與固體載體的連接可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多肽與固體載體的連接方法來(lái)進(jìn)行。例如，對(duì)于蛋白質(zhì)/多肽與改性硅膠表面的連接而言，可以通過1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺[1-ethyl-3-(3-dimethylami-nopropyl)carbodiimide,edc]和n-羥基琥珀酰亞胺(n-hydroxysuccinimide,nhs)的反應(yīng)將改性硅膠表面高分子鏈上的羧基(-cooh)基團(tuán)改為活化基團(tuán)，該活化基團(tuán)可與蛋白/多肽上所帶的氨基(-nh2)反應(yīng)從而實(shí)現(xiàn)將蛋白/多肽固定于固體載體表面。
對(duì)于點(diǎn)樣時(shí)使用的點(diǎn)樣液中多肽的濃度沒有特殊限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以依常規(guī)選擇，優(yōu)選為1μg～1000μg/ml，更優(yōu)選10μg～500μg/ml。此外，對(duì)于多肽在固體載體上分布的密度沒有特殊限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以依常規(guī)選擇，優(yōu)選為1～100點(diǎn)/10mm2，更優(yōu)選5～50點(diǎn)/10mm2。
本發(fā)明的檢測(cè)器件可以用于檢測(cè)sle疾病、或者制備用于診斷sle疾病的試劑盒。
sle診斷試劑盒
本發(fā)明還涉及一種sle診斷試劑盒，其包括
一個(gè)或多個(gè)固體載體，以及連接于所述一個(gè)或多個(gè)固體載體上的下述多肽：
seqidno：1所示的多肽；
seqidno：2所示的多肽；
seqidno：3所示的多肽；
seqidno：4所示的多肽；
seqidno：5所示的多肽；
seqidno：6所示的多肽；
seqidno：7所示的多肽；
seqidno：8所示的多肽；
seqidno：9所示的多肽；
seqidno：10所示的多肽；和
seqidno：11所示的多肽。
令人驚奇的是，在本發(fā)明的試劑盒包含上述全部多肽的情況下，本發(fā)明的試劑盒能夠以高達(dá)89.4％的靈敏度(且準(zhǔn)確性達(dá)到92.4％)診斷sle疾病。本說明書中，靈敏度是指：用“金標(biāo)準(zhǔn)”方法確認(rèn)的陽(yáng)性樣本中，被其他方法測(cè)定為陽(yáng)性樣本的比例。假陽(yáng)性率是指：用“金標(biāo)準(zhǔn)”方法確認(rèn)的陰性樣本中，被其他方法測(cè)定為陽(yáng)性樣本的比例。本技術(shù)領(lǐng)域檢測(cè)sle的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法是臨床癥狀確診，臨床癥狀確診的標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(americancollegeofrheumatology,acr)1997年sle分類標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上做了新的修訂，具體為1、頰部紅斑；2、盤狀紅斑；3、光過敏；4、口腔潰瘍；5、關(guān)節(jié)炎；6、漿膜炎；7、腎損害：8、神經(jīng)系統(tǒng)異常：9、血液學(xué)異常：10、免疫學(xué)異常：11、抗核抗體陽(yáng)性。以上11項(xiàng)中先后或同時(shí)至少4項(xiàng)陽(yáng)性者可診斷。本說明書中，“診斷”可以是確診，也可以是為確診提供參考信息。
該sle診斷試劑盒優(yōu)選用于sle疾病的診斷。
本發(fā)明的sle診斷試劑盒中的固體載體可以是一個(gè)，也可以是多個(gè)，但優(yōu)選為一個(gè)，即本發(fā)明的sle診斷試劑盒優(yōu)選包含本發(fā)明的檢測(cè)器件。
關(guān)于所述固體載體，可以參照“檢測(cè)器件”部分中關(guān)于固體載體的描述。
本發(fā)明的sle診斷試劑盒還可以包括：
1.配好的血清稀釋液或血清稀釋液組分溶液：血清稀釋液，例如有北京賽馳生物科技有限公司的樣本稀釋液(產(chǎn)品編號(hào)070021-s2)、鄭州博威嘉生物科技有限公司的加樣變色樣本稀釋液(產(chǎn)品編號(hào)bwj010103)等。該血清稀釋液用來(lái)稀釋血清，試劑盒檢測(cè)的血清要稀釋適當(dāng)倍數(shù)，例如2～200倍，優(yōu)選10～100倍。
本發(fā)明的sle診斷試劑盒還可以包括：
2.濃縮洗液：固體載體表面孵育血清及酶標(biāo)二抗后，需用洗液清洗掉固體載體表面未結(jié)合的抗體和酶標(biāo)二抗。濃縮洗液例如是1％的吐溫20水溶液，使用時(shí)需稀釋2～40倍、優(yōu)選5～20倍。
本發(fā)明的sle診斷試劑盒還可以包括：
3.酶標(biāo)二抗溶液：sle病人血清中的sle自身抗體可與固體載體(例如ipdms薄膜)上的本發(fā)明的多肽結(jié)合，二抗可與抗體結(jié)合，而二抗上的標(biāo)記物可與發(fā)光底物反應(yīng)，從而發(fā)出可檢測(cè)的光。酶標(biāo)二抗可以是例如辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人igg。作為酶標(biāo)二抗溶液，可以列舉出北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗人igg(h+l)，產(chǎn)品編號(hào)zb-2304。對(duì)酶標(biāo)二抗在酶標(biāo)二抗溶液中的濃度沒有特殊限制，可以是例如1ng～1000ng/ml。
本發(fā)明的sle紅斑狼瘡診斷試劑盒還可以包括：
4.發(fā)光液組分溶液：發(fā)光液可與二抗上標(biāo)記的辣根過氧化物酶反應(yīng)，使得反應(yīng)發(fā)出儀器可檢測(cè)到的化學(xué)光。發(fā)光液由兩種溶液混合而成，分別是a液—過氧化氫溶液，及b液—發(fā)光氨溶液。發(fā)光氨(魯米諾)只有用氧化劑處理過才會(huì)發(fā)光。通常使用雙氧水和一種氫氧化物堿的混合水溶液作為激發(fā)劑。在辣根過氧化物酶催化下，雙氧水分解為氧氣和水：
2h2o2→o2+2h2o
魯米諾與氫氧化物反應(yīng)時(shí)生成了一個(gè)雙負(fù)離子，它可被過氧化氫分解出的氧氣氧化，產(chǎn)物為一個(gè)有機(jī)過氧化物。該過氧化物很不穩(wěn)定，立即分解出氮?dú)?，生成激發(fā)態(tài)的3-氨基鄰苯二甲酸。激發(fā)態(tài)至基態(tài)轉(zhuǎn)化中，釋放的能量以光子的形式存在，波長(zhǎng)位于可見光的藍(lán)光部分。發(fā)光液組分溶液的例子例如thermoseientific公司的
本發(fā)明的sle診斷試劑盒還可以包括：
5.一個(gè)或兩個(gè)以上的反應(yīng)腔體(例如中國(guó)專利授權(quán)公告cn202054829u)。
本發(fā)明的sle診斷試劑盒還可以包括：
6.其他用于檢測(cè)系統(tǒng)性紅斑狼疾病(的檢測(cè)分子(例如多肽、蛋白質(zhì)、核酸等)。
本發(fā)明的sle診斷試劑盒還可以包括：
7.使用說明書。
本發(fā)明的sle診斷試劑盒還可以包括：
8.連接于所述一個(gè)或多個(gè)固體載體、或其他獨(dú)立的固體載體上的陽(yáng)性質(zhì)控點(diǎn)(例如h-igg)和/或陰性質(zhì)控點(diǎn)(例如pb)。
診斷方法
本發(fā)明還提供一種診斷受試者是否為sle患者的方法，該方法包括：
使用上述本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)多肽組合物中的多肽seqidno：1～11所示的多肽是否對(duì)受試者來(lái)源的血液樣本有響應(yīng)；其中，
當(dāng)檢測(cè)到分別來(lái)自下述多肽1～11中的至少兩個(gè)或兩個(gè)以上的多肽對(duì)所述受試者來(lái)源的血液樣本有響應(yīng)時(shí)，判定受試者是sle患者；否則，判定受試者不是sle患者。
在本說明書中，“響應(yīng)”是指：信噪比(snr)大于或等于2，其中，信噪比＝(多肽點(diǎn)信號(hào)值-陰性對(duì)照點(diǎn)信號(hào)值)/陰性對(duì)照點(diǎn)信號(hào)值。
本說明書中，對(duì)本發(fā)明的試劑盒的陽(yáng)性反應(yīng)是指：受試者來(lái)源的血液樣本滿足上述判據(jù)；否則為陰性反應(yīng)。
所述血液樣本可以為全血、血漿或血清。
實(shí)施例
1.多肽的制備與確認(rèn)
實(shí)施例中使用的多肽由吉爾生化(上海)有限公司合成，并通過質(zhì)譜對(duì)其進(jìn)行了確認(rèn)。其中，
seqidno：1所示的多肽序列為meesvnqmqplnekqiansq，分子量為2318；
seqidno：2所示的多肽序列為qsqalqeliseldrrchssa，分子量為2271；
seqidno：3所示的多肽序列為pcpvttdmtlqqvlmamsqi，分子量為2208；
seqidno：4所示的多肽序列為etfaggvhpaialreyrkkm，分子量為2274；
seqidno：5所示的多肽序列為prrqicvgdrrerkaafkgd，分子量為2359；
seqidno：6所示的多肽序列為rerkaafkgdsggpllcnnv，分子量為2132；
seqidno：7所示的多肽序列為qvaargrgrgmgrgnifqkrr，分子量為2372；
seqidno：8所示的多肽序列為msllnkpksemtpeelqkre，分子量為2389；
seqidno：9所示的多肽序列為vkemwtevpksgkgkkkskpv，分子量為2372；
seqidno：10所示的多肽序列為gkkkskpvnkdryiskmflrgds，分子量為2683，
seqidno：11所示的多肽序列kkreavagrgrgrgrgrgrgrgrgrggprr，分子量為3244
2.試劑盒的制備
檢測(cè)芯片是以ipdms薄膜為固體支撐材料，在其上通過點(diǎn)樣固定多肽溶液制備而成。改性硅膠是在傳統(tǒng)的聚二甲基硅氧烷材料中加入帶烯烴末端的、表面引發(fā)聚合反應(yīng)的引發(fā)劑，并通過熱交聯(lián)(硅氫鍵鍵合)固定到聚二甲基硅氧烷的三維結(jié)構(gòu)中，得到一種新的材料即ipdms薄膜。其制作過程參見國(guó)際專利公開wo2014/044184。
制好的ipdms薄膜薄膜可保存在4℃冰箱中。
采用
1)預(yù)處理
將ipdms薄膜薄片(15×15mm2)浸泡在活化液中，30min后取出用去離子水淋洗3次，用氮?dú)獯蹈?，馬上用于點(diǎn)樣。
2)點(diǎn)樣
將點(diǎn)樣液稀釋好并轉(zhuǎn)移到384孔板相應(yīng)的微孔中，將帶樣本的384孔板置于點(diǎn)樣儀基臺(tái)上，同時(shí)將預(yù)處理的改性硅膠薄片置于點(diǎn)樣儀的基臺(tái)上，馬上進(jìn)行點(diǎn)樣。點(diǎn)樣環(huán)境條件為室溫(25℃)，濕度設(shè)定為50％。將下述多肽在ipdms薄膜薄片上點(diǎn)成微陣列，每個(gè)多肽點(diǎn)樣一個(gè)點(diǎn)，另外點(diǎn)樣一個(gè)h-igg點(diǎn)作為陽(yáng)性質(zhì)控點(diǎn)以及一個(gè)pb點(diǎn)作為陰性質(zhì)控點(diǎn)。制成的多肽微陣列上每個(gè)點(diǎn)的點(diǎn)樣量約為0.6nl，樣點(diǎn)半徑為200μm。
這里，試劑盒的改性硅膠薄片上點(diǎn)樣的多肽具體如下：
seqidno：1～11所示的多肽。
3)化學(xué)固定
剛制好的多肽微陣列要放在恒溫恒濕箱(26℃,60％濕度)中固定至少6h?；瘜W(xué)固定過程參見國(guó)際專利公開wo2014/044184。
首先通過點(diǎn)樣儀將包含有捕獲多肽分子的緩沖液點(diǎn)在改性硅膠薄膜上，接著緩沖液開始蒸發(fā)，捕獲多肽分子與ipdms薄膜表面親密接觸并相互作用，通過化學(xué)結(jié)合，改性硅膠表面的ploy(oegma)高分子的末端-cooh與多肽分子的－nh2形成穩(wěn)定共價(jià)鍵，進(jìn)而將有化學(xué)活性的多肽分子固定在ipdms薄膜表面。
4)裝配
固定6h的多肽微陣列必須在兩天內(nèi)裝配好。首先通過背膠將ipdms薄膜薄片貼在專門的反應(yīng)柱上，蓋上反應(yīng)腔體。一個(gè)反應(yīng)器由兩個(gè)反應(yīng)柱和一個(gè)反應(yīng)腔體組成。
5)保存
裝配好的多肽微陣列，需要抽真空密封，保存在4℃的冰箱中，備用。
3.用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)
檢驗(yàn)步驟
(1)開始檢測(cè)前，將濃縮清洗液按1:10的比例加入純化水或蒸餾水進(jìn)行稀釋，稀釋完成后直接使用。使用移液槍將2ml清洗液加到芯片表面，浸泡芯片3分鐘，保證芯片表面被完全浸潤(rùn)。
(2)將待測(cè)血清樣本用樣本稀釋液按1:200稀釋混勻。
(3)棄去浸泡芯片的清洗液，在芯片表面完全濕潤(rùn)的狀態(tài)下，每個(gè)血清樣本吸取200μl稀釋后的血清加入到芯片反應(yīng)器內(nèi)。
(4)將芯片反應(yīng)器放入芯片固定座，放到搖床上，開啟搖床，頻率150轉(zhuǎn)/分鐘，4℃孵育12-16小時(shí)。
(5)棄去芯片反應(yīng)器內(nèi)的血清樣本，用15ml洗液清洗反應(yīng)腔體和芯片表面3次。
(6)清洗完成后，每個(gè)芯片反應(yīng)器分別加入200μl酶標(biāo)抗體溶液，將芯片反應(yīng)器放入芯片固定座，放到搖床上，開啟搖床，頻率150轉(zhuǎn)/分鐘，4℃孵育12-16小時(shí)。
(7)棄去芯片反應(yīng)器內(nèi)的酶標(biāo)抗體溶液，用15ml洗液清洗反應(yīng)腔體和芯片表面3次。
(8)清洗完成后，取下反應(yīng)腔體，每個(gè)芯片表面分別加入15μl發(fā)光底物液，使發(fā)光液能均勻的鋪于芯片表面。
(9)將加入了發(fā)光液的芯片置于凝膠成像儀中化學(xué)發(fā)光成像并判定結(jié)果，作為凝膠成像儀，使用例如天能5500型微陣列成像儀、偲捷牌tn5500型或偲捷牌clear4000型等均可。
(10)結(jié)果判定：對(duì)于每一份血清，分別統(tǒng)計(jì)試劑盒中的每一條多肽是否有響應(yīng)(即，信噪比(snr)大于等于2)，并根據(jù)上述“診斷方法”部分中所描述的判據(jù)進(jìn)行判定。即，
當(dāng)檢測(cè)到分別來(lái)自下述多肽1～11中的至少兩個(gè)或兩個(gè)以上的多肽對(duì)所述受試者來(lái)源的血液樣本有響應(yīng)時(shí)，判定受試者是sle患者；否則，判定受試者不是sle患者。
其中，信噪比＝(多肽點(diǎn)信號(hào)值-陰性對(duì)照點(diǎn)信號(hào)值)/陰性對(duì)照點(diǎn)信號(hào)值。多肽點(diǎn)信號(hào)值是指成像儀配套軟件讀取的多肽點(diǎn)的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值，陰性對(duì)照點(diǎn)信號(hào)值是指成像儀配套軟件讀取的陰性對(duì)照點(diǎn)的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值。
實(shí)施例1
對(duì)于576份血清樣本，分別采用上述步驟2中制備的試劑盒(按上述3的步驟)以及傳統(tǒng)的臨床綜合確證的方法進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表1所示。
準(zhǔn)確率＝(144+388)/576＝92.4％；
靈敏度＝144/161＝89.4％；
特異性＝388/415＝93.5％；
假陽(yáng)性率＝27/415＝6.5％
在這576份血清中，采用sle臨床癥狀確診，sle病人陽(yáng)性血清為161例，sle病人陰性血清為415例；而采用本發(fā)明的試劑盒診斷sle病人陽(yáng)性血清為144例，sle病人陰性血清為388例，準(zhǔn)確率為＝92.4％，靈敏度為＝89.4％，特異性＝93.5％，假陽(yáng)性率＝6.5％。由此可知，上述試劑盒與臨床診斷數(shù)據(jù)基本一致，其完全符合作為診斷試劑盒的要求，具有良好的準(zhǔn)確率、靈敏度和特異性，適用于sle的診斷適合各級(jí)醫(yī)院的臨床檢驗(yàn)中心使用。
以上，通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體的說明，但并不是對(duì)本發(fā)明技術(shù)范圍的限定。通過本說明書的記載，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易的對(duì)本發(fā)明進(jìn)行修飾/改變，這些包含在本發(fā)明的技術(shù)范圍內(nèi)。