本申請是申請?zhí)枮?01080042336.4的中國專利申請的分案申請，原申請是2010年9月21日提交的pct國際申請pct/ca2010/001489于2012年3月22日進入中國國家階段的申請。本發(fā)明涉及制備植物來源的蛋白質(zhì)的方法。更具體地，本發(fā)明提供從植物和植物組織獲取蛋白質(zhì)(包括蛋白超結(jié)構(gòu)(suprastructure))的方法。
背景技術(shù)：
：目前宿主細胞(如大腸桿菌、昆蟲細胞培養(yǎng)物和哺乳動物細胞培養(yǎng)物)中的重組表達策略在培養(yǎng)基中以非常高的水平表達和分泌蛋白質(zhì)。使用這些系統(tǒng)獲得了高水平表達、正確蛋白質(zhì)折疊和蛋白質(zhì)翻譯后修飾。此外，由于可以容易地將細胞內(nèi)蛋白質(zhì)與其他組分(dna、囊泡、膜、色素等)分離，所表達蛋白質(zhì)的純化得以簡化。對于植物或酵母表達系統(tǒng)，細胞壁阻止表達的蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中。廣泛使用不同的科學(xué)方法來產(chǎn)生細胞提取物。對于某些類型的蛋白質(zhì)或細胞組分，通常不選擇機械方法來破壞細胞壁并釋放其內(nèi)容物。將目的蛋白質(zhì)直接表達入細胞培養(yǎng)基，使得能通過離心或過濾去除細胞內(nèi)雜質(zhì)，從而使目的蛋白質(zhì)被簡單快速地富集。還可期望在將目的蛋白超結(jié)構(gòu)用于疫苗配制之前，從存在于植物或植物物質(zhì)中的一些或全部蛋白質(zhì)、dna、膜片段、囊泡、色素、碳水化合物等中分離目的蛋白質(zhì)或蛋白超結(jié)構(gòu)，包括蛋白花環(huán)(proteinrosette)、納米顆粒、大蛋白復(fù)合物、抗體或病毒樣顆粒(virus-likeparticle，vlp)等等。免疫球蛋白(igg)是對多種性質(zhì)的特定抗原性對應(yīng)物有特征性親和力的復(fù)雜異多聚體蛋白質(zhì)。當(dāng)今igg產(chǎn)生細胞系的常規(guī)分離和igg定向進化和分子改造技術(shù)的出現(xiàn)極大地影響了它們作為生物治療劑和在一般生命科學(xué)應(yīng)用中的改進。治療性單克隆igg(單克隆抗體，mab)在目前的新抗炎藥和抗癌藥市場中占主導(dǎo)地位，并且目前正在對數(shù)百種新候選藥物進行研究和臨床開發(fā)以獲得改進的或新的應(yīng)用。每年mab的市場需求從幾克(診斷)、幾千克(抗毒素)到一百或數(shù)百千克(生物防護、抗癌、抗感染、抗炎)。wo2008/151440(通過引用并入本文)描述了從植物生產(chǎn)經(jīng)修飾的糖蛋白的方法。pct公開wo00/09725(turpen等)描述了一種從植物細胞間間隙提取蛋白質(zhì)的方法，其包括真空和離心處理以提供包含目的蛋白質(zhì)的間質(zhì)液(interstitialfluid)提取物。該方法適于能在真空和離心條件下通過微纖維網(wǎng)格的小蛋白質(zhì)(50kda或更小)，但不適于較大蛋白質(zhì)、超級結(jié)構(gòu)蛋白(superstructureprotein)、蛋白花環(huán)、納米顆粒、大蛋白復(fù)合物如抗體或vlp。1999年mccormick等(procnatlacadsciusa96：703-708)公開了使用與單鏈fv(scfv)表位融合的大米淀粉酶信號肽將表達的蛋白質(zhì)靶向到細胞外部分(compartment)，隨后通過對葉和莖組織進行真空過濾來回收scfv多肽。2008年moehnke等(biotechnollett30：1259-1264)描述了使用mccormick的真空過濾法通過質(zhì)外體提取從煙草中獲得重組植物過敏原。pct公開wo2003/025124(zhang等)公開了在植物中表達scfv免疫球蛋白，其通過鼠信號序列靶向質(zhì)外體空間。病毒樣顆粒(vlp)可用于制備流感疫苗。超結(jié)構(gòu)(如vlp)模擬病毒衣殼結(jié)構(gòu)，但缺少基因組，從而不能復(fù)制或提供再次感染。vlp刺激強免疫應(yīng)答，為分離(可溶)的重組抗原提供了替代方法。vlp在特定病毒蛋白表達后進行組裝并具有類似于其同類病毒的外表面，但不同于真的病毒顆粒，遺傳物質(zhì)不會整合到其中。與天然病毒類似的顆粒狀多價結(jié)構(gòu)抗原的呈遞引發(fā)具有均衡的體液和細胞成分的增強的免疫應(yīng)答刺激。認(rèn)為優(yōu)于分離抗原產(chǎn)生之刺激的這種改進對于包膜病毒尤其適用，因為包膜vlp以其天然膜結(jié)合狀態(tài)呈遞表面抗原(grgacic和anderson，2006年，methods40，60-65)。此外，已證明與重組血凝素ha(即單體ha，或組成花環(huán)的ha；3-8個三聚體的ha組裝物)相比，擁有納米顆粒組織結(jié)構(gòu)的流感vlp是更佳的候選疫苗，并且他們能激活體液和細胞免疫應(yīng)答。(bright，r.a.，等，2007，vaccine25，3871-3878)。已通過在培養(yǎng)的哺乳動物細胞中共表達全部10種流感病毒蛋白獲得流感vlp(mena等，1996年，j.virol.70，5016-5024)。幾種病毒蛋白對于vlp的生產(chǎn)是可缺省的，而且在疫苗發(fā)展中已通過共表達2種主要抗原性包膜蛋白(ha和na)以及m1或者僅共表達ha和m1生產(chǎn)流感vlp(kang等，2009年，virusres.143，140-146)。chen等(2007年，j.virol.81，7111-7123)證實單獨的ha可以驅(qū)動vlp形成和出芽，在他們的系統(tǒng)中可以省去m1共表達。但是，由于發(fā)現(xiàn)ha與產(chǎn)生vlp的哺乳動物細胞表面的唾液酸化糖蛋白結(jié)合，所以共表達了病毒唾液酸酶以使vlp在出芽后從生產(chǎn)細胞中釋放。pct公開wo2006/119516(williamson和rybicki)公開了在植物中表達流感病毒a/越南/1194/2004的全長和截短的人密碼子優(yōu)化h5ha。截短的構(gòu)建體缺少膜錨定結(jié)構(gòu)域。通過靶向er的構(gòu)建體獲得最高的ha蛋白積累。缺少膜靶向結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建體沒有產(chǎn)生可檢測的ha。沒有報道vlp的生產(chǎn)情況。之前wo2009/009876和wo2009/076778的發(fā)明人已描述了包含脂質(zhì)包膜的流感havlp的生產(chǎn)(d'aoust等；兩者均通過引用并入本文)。對于包膜病毒，病毒保留脂質(zhì)層或膜可以是有利的。不同系統(tǒng)的脂質(zhì)構(gòu)成可以有所不同(例如植物生成的包膜病毒會在包膜中包含植物脂質(zhì)或植物甾醇)，這可有助于增強免疫應(yīng)答。mason等描述了表達hbv表面抗原(hbsag)的轉(zhuǎn)基因煙草中包膜vlp的組裝(1992年，proc.natl.acad.sci.usa89，11745-11749)。已證明植物生成的hbvvlp在腸胃外施用時在小鼠中顯示出誘導(dǎo)強b和t細胞免疫應(yīng)答((huang等，2005年，vaccine23，1851-1858)，但飼喂實驗的口服免疫僅誘導(dǎo)了中度的免疫應(yīng)答(smith等，2003年，vaccine21，4011-4021)。greco(2007年，vaccine25，8228-8240)證明與hbsag融合的人免疫缺陷病毒(hiv)表位在轉(zhuǎn)基因煙草和擬南芥(arabidopsis)中表達時累積為vlp，產(chǎn)生了二價vlp疫苗。在轉(zhuǎn)基因煙草和馬鈴薯植株中表達病毒衣殼蛋白(nvcp)導(dǎo)致無包膜vlp的組裝(mason等，1996年，proc.natl.acad.sci.usa93，5335-5340)。已在農(nóng)桿菌浸潤的本塞姆氏煙草(n.benthamiana)葉中產(chǎn)生了nvcpvlp(huang等2009年，biotechnol.bioeng.103，706-714)，并且在小鼠中證實了其口服施用后的免疫原性(santi等，2008年，vaccine26，1846-1854)。給健康成人志愿者施用含有215-751μgvlp形式的nvcp的2或3劑量生馬鈴薯在95％的免疫志愿者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答(tacket等2000年，j.infect.dis.182，302-305)。還由hbv核心抗原(hbcag；huang等，2009年，biotechnol.bioeng.103，706-714)、人乳頭狀瘤病毒(hpv)主要衣殼蛋白l1(varsani等，2003年，arch.virol.148，1771-1786)的表達獲得了無包膜vlp。期望有更簡單的蛋白質(zhì)或蛋白超結(jié)構(gòu)生產(chǎn)系統(tǒng)，例如依賴于僅一種或幾種蛋白質(zhì)的表達的系統(tǒng)。于植物系統(tǒng)中生產(chǎn)蛋白質(zhì)或蛋白超結(jié)構(gòu)(例如但不限于蛋白花環(huán)、納米顆粒、大蛋白復(fù)合物如抗體或vlp)是有利的，因為植物可以培養(yǎng)在溫室或田間，并且不需要無菌組織培養(yǎng)法和處理。期望有這樣的蛋白質(zhì)制備方法，或蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白，其中蛋白質(zhì)基本上不含植物蛋白質(zhì)或容易與其分離，但仍保留蛋白的結(jié)構(gòu)和特性。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明涉及制備植物來源的蛋白質(zhì)的方法。更具體地，本發(fā)明提供從植物和植物組織中獲得蛋白質(zhì)(包括蛋白超結(jié)構(gòu))的方法。本發(fā)明的一個目的是提供制備植物來源的蛋白質(zhì)的改進方法。本發(fā)明提供了制備植物來源之蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的方法(a)，包括獲取定位于質(zhì)外體(apoplast)中的包含植物來源之蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的植物或植物物質(zhì)；產(chǎn)生原生質(zhì)體(protoplast)和質(zhì)外體級分，質(zhì)外體級分包含植物來源的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白；回收質(zhì)外體級分。該方法還可包括從質(zhì)外體級分純化植物來源之蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的步驟。植物來源之蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白可以是嵌合植物來源蛋白或超結(jié)構(gòu)蛋白。植物來源之蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白對于植物來說可以是異源的。植物來源之蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白可以包括蛋白花環(huán)、蛋白復(fù)合物、蛋白酶體、代謝區(qū)室(metabolon)、轉(zhuǎn)錄復(fù)合物、重組復(fù)合物、光合復(fù)合物、膜轉(zhuǎn)運復(fù)合物、核孔復(fù)合物、蛋白納米顆粒、糖蛋白、抗體、多克隆抗體、單克隆抗體、單鏈單克隆抗體、病毒樣顆粒、病毒包膜蛋白(viralenvelopeprotein)、病毒結(jié)構(gòu)蛋白、病毒衣殼蛋白、和病毒外殼蛋白(viralcoatprotein)、嵌合蛋白、嵌合蛋白復(fù)合物、嵌合蛋白納米顆粒、嵌合糖蛋白、嵌合抗體、嵌合單克隆抗體、嵌合單鏈單克隆抗體、嵌合血凝素、病毒包膜蛋白、病毒結(jié)構(gòu)蛋白、病毒衣殼蛋白和病毒外殼蛋白。植物來源的單克隆抗體可以包括嵌合小鼠人單克隆抗體，例如但不限于c2b8。植物來源的vlp可以包含流感血凝素。質(zhì)外體和原生質(zhì)體級分可以通過用酶組合物處理植物或植物物質(zhì)來產(chǎn)生。酶組合物可以包括一種或多于一種果膠酶、一種或多于一種纖維素酶，或者一種或多于一種果膠酶和一種或多于一種纖維素酶。此外，如期望，酶組合物不包括脂肪酶或蛋白酶，或該組合物不包括添加的脂肪酶或蛋白酶。植物或植物物質(zhì)可以通過種植、收集或者種植并收集植物來獲得。植物物質(zhì)可以包括一部分或整株植物、植物細胞、葉、莖、根或培養(yǎng)的植物細胞中的一種或多于一種。本發(fā)明提供了如上所述(方法a)制備植物來源之蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的方法，其中編碼蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的核酸以瞬時方式引入植物?；蛘?，核酸穩(wěn)定地整合進植物基因組。本發(fā)明提供如上所述(方法a)制備植物來源的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的方法，其還包括從質(zhì)外體級分純化植物來源的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的步驟。純化步驟可以包括通過深層過濾(depthfiltration)來過濾所述質(zhì)外體級分以產(chǎn)生澄清的提取物，然后用陽離子交換樹脂、親和層析或體積排阻層析或者其組合來層析所述澄清的提取物。不希望被理論所約束，從質(zhì)外體獲取的蛋白質(zhì)較為均一，因為翻譯后修飾蛋白的中間形式或包含在多種細胞內(nèi)部分(例如線粒體、葉綠體和其他細胞器)進行之其他類型的加工的蛋白質(zhì)沒有被共提取。重組蛋白均一性水平更高通常使得包含該蛋白質(zhì)的制劑的質(zhì)量更高，并可生成具有更高的效力、更長的半衰期或更好的免疫力的有益特性的產(chǎn)品。例如，與含有復(fù)合糖基化的蛋白質(zhì)相比，含有高度甘露糖糖基化的血液蛋白在血液循環(huán)中被更快地被清除。產(chǎn)生于質(zhì)外體級分的糖基化蛋白表現(xiàn)出更復(fù)合類型的糖基化。因此，使用本文所述方法(其涉及細胞壁消化)制備的質(zhì)外體來源蛋白表現(xiàn)出，例如在循環(huán)中更長的半衰期。植物來源的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白可以包括蛋白花環(huán)、蛋白復(fù)合物、蛋白納米顆粒、抗體、單克隆抗體、vlp。vlp可以包含一種或更多種流感ha多肽。超結(jié)構(gòu)蛋白可以是嵌合超結(jié)構(gòu)蛋白，例如，單克隆抗體可以是嵌合單克隆抗體，或流感ha多肽可以是嵌合ha多肽。如果超結(jié)構(gòu)蛋白是vlp，則植物來源的vlp還可包含凝血活性。植物或植物物質(zhì)可以通過培養(yǎng)、收集或者培養(yǎng)并收集植物來獲得。植物物質(zhì)可以包括一部分或整株植物，或者植物細胞、葉、莖、根或培養(yǎng)細胞中的一種或多于一種。本發(fā)明還提供了制備植物來源的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的方法(b)，包括獲取包含植物來源的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的植物或植物物質(zhì)，用細胞壁降解酶組合物消化植物物質(zhì)以產(chǎn)生消化級分，過濾消化級分以產(chǎn)生過濾級分，以及從過濾級分中回收植物來源的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白。酶組合物可以包含一種或多于一種果膠酶、一種或多于一種纖維素酶，或者一種或多于一種果膠酶和一種或多于一種纖維素酶。此外，如期望，酶組合物不包含脂肪酶或蛋白酶，或該組合物不包含添加的脂肪酶或蛋白酶。植物來源的超結(jié)構(gòu)蛋白可以是嵌合的植物來源超結(jié)構(gòu)蛋白。植物來源的蛋白質(zhì)超結(jié)構(gòu)可以包括蛋白花環(huán)、蛋白復(fù)合物、蛋白酶體、代謝區(qū)室、轉(zhuǎn)錄復(fù)合物、重組復(fù)合物、光合復(fù)合物、膜轉(zhuǎn)運復(fù)合物、核孔復(fù)合物、蛋白納米顆粒、糖蛋白、抗體、多克隆抗體、單克隆抗體、單鏈單克隆抗體、病毒樣顆粒、病毒包膜蛋白、病毒結(jié)構(gòu)蛋白、病毒衣殼蛋白和病毒外殼蛋白、嵌合蛋白、嵌合蛋白復(fù)合物、嵌合蛋白納米顆粒、嵌合糖蛋白、嵌合抗體、嵌合單克隆抗體、嵌合單鏈單克隆抗體、嵌合血凝素、病毒包膜蛋白、病毒結(jié)構(gòu)蛋白、病毒衣殼蛋白和病毒外殼蛋白。植物來源的單克隆抗體可以包括嵌合的小鼠人單克隆抗體，例如但不限于c2b8。植物來源的vlp可以包含流感血凝素。本發(fā)明提供了如上所述(方法b)制備植物來源之蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的方法，其中編碼蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的核酸以瞬時方式引入植物。或者，核酸穩(wěn)定地整合進植物基因組。本發(fā)明提供如上所述(方法b)的制備植物來源的vlp的方法，其還包括將過濾級分中的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白與細胞碎片和不溶物質(zhì)分離的步驟。分離步驟可以通過離心、深層過濾或者離心并深層過濾來進行以產(chǎn)生澄清的級分。植物來源的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白可以通過層析來進一步純化，例如，澄清的提取物可以使用陽離子交換樹脂、親和樹脂、體積排阻層析或者其組合來純化。植物來源的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白可以包括蛋白花環(huán)、蛋白復(fù)合物、蛋白納米顆粒、糖蛋白、抗體、單克隆抗體、vlp。vlp可以包含一種或更多種流感ha多肽。超結(jié)構(gòu)蛋白可以是嵌合超結(jié)構(gòu)蛋白，例如，單克隆抗體可以是嵌合單克隆抗體，或流感ha多肽可以是嵌合ha多肽。如果超結(jié)構(gòu)蛋白是vlp，那么植物來源的vlp還可包含凝血活性。不希望被理論所約束，包含植物來源脂質(zhì)的植物制得的vlp可以誘導(dǎo)比用其他生產(chǎn)系統(tǒng)制得的vlp更強的免疫反應(yīng)，并且這些植物制得的vlp誘導(dǎo)的該免疫反應(yīng)比活或減毒全病毒疫苗所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)更強。從宿主細胞獲得的蛋白提取物成分是復(fù)雜的，并且往往包含與待分離的目的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)一起的細胞外和細胞內(nèi)成分。制備質(zhì)外體級分隨后進行分離細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和成分的步驟是有利的，因為目的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)可以在制造過程中被富集和提高效力。包括更少有效步驟的更簡單過程可以顯著增加產(chǎn)量并且降低成本。還發(fā)現(xiàn)用細胞壁降解酶消化細胞壁的過程提高超結(jié)構(gòu)蛋白的產(chǎn)量，即使在原生質(zhì)體在提取過程中不保持完整的情況下也是如此。不希望被理論所約束，細胞壁消化步驟可松動細胞壁的多聚成分，并有助于使蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白釋放而非結(jié)合在細胞壁中。該方案還可以將細胞內(nèi)成分對蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的污染降到最低。消化植物細胞壁的方法是已知的，并且消化細胞壁的酶混合物(enzymecocktailmixture)可以有所不同。本發(fā)明并不受所用的細胞壁消化方法限制。與使用勻漿、攪拌(blending)或研磨來制備植物來源之超結(jié)構(gòu)蛋白的方法相比，本文所述方法使植物來源的超結(jié)構(gòu)蛋白提取物受到更少的破壞和污染。本文所述方法提供植物組織的質(zhì)外體級分并且可以保持原生質(zhì)體及其成分的完整性。本文所述方法即使在原生質(zhì)體或原生質(zhì)體的一部分失去其完整性而不再完整的情況下也能有效純化蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白。與涉及標(biāo)準(zhǔn)組織破碎技術(shù)(例如，勻漿、攪拌或研磨)的超結(jié)構(gòu)蛋白提取方法相比，這些方法提供更高的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白產(chǎn)量。更高的產(chǎn)量可以部分歸因于破壞蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白(在vlp的情形中為脂質(zhì)包膜)之結(jié)構(gòu)完整性的剪切力的減少。從質(zhì)外體級分制備蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白可以是有利的，因為質(zhì)外體級分具有顯著降低的細胞質(zhì)蛋白或不含細胞質(zhì)蛋白。因此，在質(zhì)外體級分中將其他蛋白質(zhì)和物質(zhì)(包括單體、二聚體、三聚體超結(jié)構(gòu)蛋白或其片段)與超結(jié)構(gòu)蛋白分離可以被容易地實施。但是，即使原生質(zhì)體制備物或部分原生質(zhì)體制備物是不完整的，蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的產(chǎn)量增加也可以通過本文所述方法來實現(xiàn)。與不消化細胞壁的提取方法(例如攪拌提取的植物)相比，分泌到質(zhì)外體的糖蛋白(包括超結(jié)構(gòu)糖蛋白，例如單克隆抗體)包含更高百分比的完成成熟的n-聚糖，并且包含末端n-乙酰葡糖胺或半乳糖殘基(復(fù)合n-聚糖)。與包含末端甘露糖殘基(未成熟的n聚糖)的單克隆抗體相比，發(fā)現(xiàn)包含復(fù)合n聚糖的超結(jié)構(gòu)糖蛋白(例如單克隆抗體)在血流中顯示出半衰期增加的有益特性。通過酶消化細胞壁，可以釋放出一批包含已成熟之n-聚糖的質(zhì)外體抗體。這種提取方法可允許回收具有復(fù)合n-聚糖之糖基化抗體的富集類群或均質(zhì)類群，并與原生質(zhì)體級分中不成熟形式的糖基化抗體分離。如果期望獲得這批具有未成熟之n-聚糖的抗體，可以保留原生質(zhì)體級分并且從原生質(zhì)體級分中純化抗體。與通過標(biāo)準(zhǔn)組織破碎技術(shù)獲得的vlp相比，本發(fā)明的vlp的特征還在于顯示出更高的凝血活性。這種改進的凝血活性可歸因于完整vlp產(chǎn)量更高(溶液中游離的ha單體或三聚體更少)、具有完整脂質(zhì)包膜的完整vlp產(chǎn)量更高，或其組合。與用全病毒制成的疫苗相比，用vlp制成的疫苗的優(yōu)勢在于它們是無感染性的。因此，不用考慮生物防護并且這在生產(chǎn)中也是不需要的。植物制備的vlp提供的另外一個優(yōu)勢是允許在溫室或田間培養(yǎng)表達系統(tǒng)，從而顯著地更加經(jīng)濟并適于擴大規(guī)模。此外，植物不包含參與向蛋白質(zhì)合成或添加唾液酸殘基的酶。vlp可以在沒有神經(jīng)氨酸酶(na)的情況下產(chǎn)生，并且不需要共表達na或用唾液酸酶(神經(jīng)氨酸酶)處理生產(chǎn)細胞或提取以確保植物中的vlp生產(chǎn)。本發(fā)明的該概述并不必然描述本發(fā)明的所有特征。附圖說明本發(fā)明的這些和其他特征將從以下描述中顯而易見，其中參照了以下附圖：圖1顯示了表達h5a/印度尼西亞/5/05血凝素的基于cpmvht的表達盒(構(gòu)建體685)。圖2a顯示了表達h5/indo(構(gòu)建體編號685)的構(gòu)建體的部分(從paci(35s啟動子上游)到asci(緊鄰nos終止子的下游))核酸序列(seqidno.1)。來自a/印度尼西亞/5/2005的h5的編碼序列以下劃線表示。圖2b顯示了構(gòu)建體編號685編碼的h5a/印度尼西亞/5/05的氨基酸序列(seqidno.2)。圖3顯示了用體積排阻層析(sec)表征的包含血凝素(ha)的結(jié)構(gòu)。離心經(jīng)消化的植物提取物之后，重懸沉淀并通過sec分離。圖3a顯示了每個級分的總可溶性蛋白質(zhì)含量(實心三角形；左側(cè)y-軸，最大值％；用bradford法測定)。還顯示了所收集級分(實心柱；右側(cè)y-軸)的凝血活性。圖3b顯示了sec洗脫級分的sds-page分析結(jié)果。通過丙酮沉淀級分并在分析前用1/40體積的還原性樣品上樣緩沖液重懸。用0.1％的考馬斯r-250溶液對凝膠染色。純化的vlp用作跑膠對照。對應(yīng)于ha0單體的帶用箭頭表示。mw-分子量標(biāo)準(zhǔn)(kda)；c-純化的vlp(對照)；泳道7至10和14至16對應(yīng)于圖3a所示的sec分析洗脫的級分編號。圖4顯示了酶消化和通過comitroltm勻漿器機械勻漿所獲得的蛋白譜對比。用變性樣品上樣緩沖液處理樣品，通過洗脫級分的sds-page分析分離蛋白質(zhì)。用0.1％的考馬斯r-250溶液對凝膠染色。mw-分子量標(biāo)準(zhǔn)(kda)；泳道1-25μl酶混合物；泳道2-25μl植物組織酶消化物，泳道3-通過comitrol勻漿器獲得的5μl提取物。圖5顯示了ha表達盒的核酸序列(seqidno：9)，其包括苜蓿質(zhì)體藍素啟動子和5’utr、a/印度尼西亞/5/2005(構(gòu)建體號660)的h5的血凝素編碼序列、苜蓿質(zhì)體藍素3’utr和終止子序列。圖6顯示了陽離子交換樹脂捕獲的直接來自質(zhì)外體級分的ha-vlp分離物的ha-vlp。樣品用非還原變性樣品上樣緩沖液處理，通過sds-page分離蛋白質(zhì)。用0.1％考馬斯r-250溶液對凝膠染色。泳道1：離心后的質(zhì)外體級分；泳道2-3：連續(xù)微過濾后的質(zhì)外體級分；泳道4：陽離子交換的上樣物；泳道5：陽離子交換的流出級分。泳道6；陽離子交換的洗脫物，濃縮10倍；泳道7：分子量標(biāo)準(zhǔn)(kda)。圖7顯示了h5/indovlp(圖7a)、澄清之后沒有向消化緩沖液中添加nacl的h1/calvlp(圖7b)和進行了該添加的h1/calvlp(圖7c)的納米顆粒跟蹤分析(nanoparticletrackinganalysis，nta)譜。nta實驗是用nanosightlm20(nanosight，amesbury，uk)進行的。該裝置配備了藍激光(405nm)、樣品室和viton氟橡膠o型圈。室溫下記錄視頻并用nta2.0軟件分析。樣品記錄60秒。手動選擇快門和增益(gain)以獲得最優(yōu)粒子分辨率。圖8顯示了用不同緩沖液酶消化產(chǎn)生的h3/布里斯班vlp提取物的western印跡結(jié)果。泳道1)純重組ha標(biāo)準(zhǔn)(5μg，immunetechnologycorp.it-003-0042p)，泳道2-5包含7μl如下緩沖液中進行的離心酶提取物：泳道2)600mm甘露糖醇+125m檸檬酸鹽+75mmnapo4+25mmedta+0.04％亞硫酸氫鹽(ph6.2)，泳道3)600mm甘露糖醇+125mm檸檬酸鹽+75mmnapo4+50mmedta+0.04％亞硫酸氫鹽(ph6.2)，泳道4)200mm甘露糖醇+125mm檸檬酸鹽+75mmnapo4+25mmedta+0.03％亞硫酸氫鹽(ph6.2)，泳道5)200mm甘露糖醇+125mm檸檬酸鹽+75mmnapo4+50mmedta+0.03％亞硫酸氫鹽(ph6.2)。箭頭代表ha0的免疫檢測信號。圖9顯示了為組裝構(gòu)建體號590而合成的dna片段序列(lc片段；(seqidno.15)。圖10顯示了為組裝構(gòu)建體號592而合成的dna片段序列(hc片段)(seqidno.16)。圖11a和圖11b分別顯示了構(gòu)建體號595(圖11a)和構(gòu)建體號r472(圖11b)的示意圖。圖12從通過機械破碎(攪拌提取)和酶消化細胞壁產(chǎn)生的提取物中純化的抗體的sds-page對比。對于每種提取方法，分兩批獨立地處理和純化。圖13a顯示了通過機械破碎(攪拌提取)和酶消化細胞壁純化的c2b8上的寡聚甘露糖苷n-聚糖比例的對比。圖13b顯示了通過機械破碎(攪拌提取)和酶消化細胞壁純化的c2b8上復(fù)合n-聚糖比例的對比。具體實施方式本發(fā)明涉及制備植物來源的蛋白質(zhì)的方法。更具體地，本發(fā)明提供從植物和植物組織獲取蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的方法。以下描述是一個優(yōu)選的實施方案。本發(fā)明提供了獲取目的蛋白質(zhì)或蛋白超結(jié)構(gòu)的方法。目的蛋白質(zhì)可以存在于質(zhì)外體或細胞外部分(compartment)中(對應(yīng)于除原生質(zhì)體/原生質(zhì)球(spheroplast)部分之外的植物細胞部分)。該方法包括去除、消化或者消化并去除包圍植物細胞的纖維素植物細胞壁。通過消化細胞壁，細胞壁的聚合成分松動，目的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白可以更容易地釋放。通過使用該方法，目的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白被富集，這是由于包含的主要宿主細胞蛋白和成分的原生質(zhì)體/原生質(zhì)球部分與質(zhì)外體分離。如下所述，如果在過程中原生質(zhì)體/原生質(zhì)球部分失去完整性，如果原生質(zhì)體/原生質(zhì)球部分是不完整的，如果來自原生質(zhì)體/原生質(zhì)球部分的部分宿主細胞蛋白和成分存在于質(zhì)外體級分中，本文提供的方法在獲得目的蛋白質(zhì)或蛋白超結(jié)構(gòu)方面仍然有效。使用下述方法，如果原生質(zhì)體/原生質(zhì)球部分失去完整性，蛋白質(zhì)或蛋白超結(jié)構(gòu)仍然可以與完整細胞器(包括線粒體、葉綠體和其他細胞器)分離，并且仍可獲得有益的結(jié)果?！暗鞍踪|(zhì)”或“目的蛋白質(zhì)”(這些術(shù)語互換使用)是指由核苷酸序列或編碼區(qū)編碼的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)亞基，其表達于植物或植物部分中。蛋白質(zhì)的分子量可以為約1至約100kda或其間任意量，例如1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100kda或其間任意量。蛋白質(zhì)可以是單體、二聚體、三聚體或多聚體。蛋白超結(jié)構(gòu)(也稱為超結(jié)構(gòu)蛋白、蛋白超級結(jié)構(gòu)或超級結(jié)構(gòu)蛋白)是由2個或更多個多肽構(gòu)成的蛋白結(jié)構(gòu)。所述多肽可以是相同或不同的；如果是不同的，它們的存在比例可以為約1∶1至約10∶1或更高。超結(jié)構(gòu)蛋白可以包括但不限于蛋白花環(huán)、蛋白復(fù)合物、蛋白納米顆粒、糖蛋白、抗體、多克隆抗體、單克隆抗體、單鏈單克隆抗體或病毒樣顆粒、蛋白酶體、代謝區(qū)室、轉(zhuǎn)錄復(fù)合物、重組復(fù)合物、光合復(fù)合物、膜轉(zhuǎn)運復(fù)合物、核孔復(fù)合物、嵌合蛋白、嵌合蛋白復(fù)合物、嵌合蛋白納米顆粒、嵌合糖蛋白、嵌合抗體、嵌合單克隆抗體、嵌合單鏈單克隆抗體或嵌合血凝素(ha)。如果蛋白超結(jié)構(gòu)是vlp，vlp可以選自以下的組：病毒包膜蛋白、病毒結(jié)構(gòu)蛋白、病毒衣殼蛋白和病毒外殼蛋白。植物來源vlp可以包含流感(ha)。通常，經(jīng)組裝的蛋白超結(jié)構(gòu)(蛋白超級結(jié)構(gòu))是大的，例如分子量大于75kda，例如約75至約1500kda或其間任意分子量。例如，蛋白超結(jié)構(gòu)的分子量可以為約75、80、85、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、850、900、950、1000、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500kda或其間任意分子量。組合在一起形成蛋白超結(jié)構(gòu)的亞基可以具有較小的分子量，例如每個亞基的分子量為約1kda至約500kda或其間任意量。蛋白超結(jié)構(gòu)可以包括顯示二級結(jié)構(gòu)(具有一個或更多個氨基酸氫鍵，例如具有蛋白質(zhì)螺旋中的殘基)、三級結(jié)構(gòu)(具有三維構(gòu)型)或四級結(jié)構(gòu)(具有形成多亞基復(fù)合物的多個折疊蛋白或卷曲螺旋蛋白分子排布)的蛋白質(zhì)。多蛋白復(fù)合物(或蛋白復(fù)合物)可以包含一組兩個或更多個相關(guān)聯(lián)多肽鏈。如果不同的多肽鏈含有不同的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，那么所得多蛋白復(fù)合物可具有多種催化功能。蛋白復(fù)合物還可以是多酶多肽，其在單個多肽鏈中包含多個催化結(jié)構(gòu)域。蛋白復(fù)合物通常是四級結(jié)構(gòu)形式。用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分離方案通常不能完整獲得但可以用本文所述方法獲得的蛋白復(fù)合物實例包括蛋白酶體(用于降解肽和蛋白質(zhì))、代謝區(qū)室(用于氧化能量產(chǎn)生)、核糖體(用于蛋白質(zhì)合成；例如描述于pereira-leal，j.b.；等，2006年，philostransrsoclondbbiolsci.，361(1467)：507-517)、轉(zhuǎn)錄復(fù)合物、重組復(fù)合物、光合復(fù)合物、膜轉(zhuǎn)運復(fù)合物、核孔復(fù)合物。本方法可用于獲得以穩(wěn)定或較弱蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域-蛋白結(jié)構(gòu)域相互作用為特征的蛋白復(fù)合物。蛋白質(zhì)或蛋白超結(jié)構(gòu)的例子包括，例如但不限于工業(yè)酶(例如纖維素酶、木聚糖酶、蛋白酶、過氧化物酶、枯草溶菌素)，用于飼料、食品或飼料和食品用途的蛋白補充劑、營養(yǎng)食品、價值增值產(chǎn)品(value-addedproduct)或其片段，用于免疫或接種的藥物活性蛋白質(zhì)(例如但不限于生長因子、生長調(diào)節(jié)物、抗體、抗原及其片段或它們的衍生物)等。另一些目的蛋白質(zhì)可包括但不限于白介素(例如一種或多于一種的il-1至il-24、il-26和il-27)，細胞因子，促紅細胞生成素(epo)，胰島素，g-csf、gm-csf、hpg-csf、m-csf或其組合、干擾素(例如干擾素-α、干擾素-β、干擾素-γ)，凝血因子(例如因子viii、因子ix或tpahgh)，受體，受體拮抗劑，抗體，神經(jīng)多肽，胰島素，疫苗，生長因子(例如但不限于表皮生長因子、角化細胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、生長調(diào)節(jié)素)，抗原，自身抗原，其片段或其組合。蛋白超結(jié)構(gòu)的非限制性實例是抗體?？贵w是糖蛋白，其分子量為約100至約1000kda或其間任意量?？贵w包含4條多肽鏈，即通過二硫鍵相連的2條輕鏈和2條重鏈。例如(不被視為限制)，每條輕鏈分子量可以為約25kda，例如約20至約30kda或其間任意量，或更大，例如約20至約300kda或其間任意量，并且輕鏈由2個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，一個可變結(jié)構(gòu)域(vl)和一個恒定結(jié)構(gòu)域(cl)。每條重鏈的分子量可以為約50kda，例如約30至約75kda或其間任意量，或更大，例如約30至約500kda或其間任意量，并且重鏈包括恒定區(qū)和可變區(qū)。重鏈和輕鏈包含一些同源區(qū)段，其由相似但不相同的氨基酸序列組所組成。這些同源單元由約110個氨基酸組成并被稱為免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。重鏈包含一個可變結(jié)構(gòu)域(vh)以及3個或4個恒定結(jié)構(gòu)域(ch1、ch2、ch3和ch4，取決于抗體的類別或者亞型)。ch1和ch2結(jié)構(gòu)域之間的區(qū)域被稱為鉸鏈區(qū)，并且使y型抗體分子的2個fab臂之間有柔性，使得它們分開和靠近以適應(yīng)與2個抗原性決定簇(被固定距離分隔開)的結(jié)合。另一個蛋白超結(jié)構(gòu)的非限制性實例是vlp。vlp可以包括ha0前體形式，或通過二硫橋形式維持在一起的ha1或ha2結(jié)構(gòu)域。vlp的平均大小可以為約20nm至1μm或其間任意量，例如60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200nm或其間任意量，例如100nm，而且可以包含脂質(zhì)膜。蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白還可以包含一種或更多種脂質(zhì)、磷脂、核酸、膜等。2個或更多個多肽可以通過共價鍵、二硫鍵、電荷相互作用、疏水吸引力、范德華力、氫鍵等連接。蛋白超結(jié)構(gòu)的例子是單克隆抗體、嵌合單克隆抗體、單鏈單克隆抗體或病毒樣顆粒(vlp)，vlp可以是包膜或非包膜的，例如病毒包膜蛋白、病毒結(jié)構(gòu)蛋白、病毒衣殼蛋白或病毒外殼蛋白。蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白可在合適的宿主細胞(包括植物宿主細胞)中產(chǎn)生，如果期望可以進一步純化。盡管本文示例了嵌合單克隆抗體、流感vlp和嵌合流感vlp，本文所述方法可以用于任何植物來源的胞漿蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白，或任何定位于或分泌到質(zhì)外體的植物來源的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白。本發(fā)明還提供了制備植物來源的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的方法。該方法包括獲取包含定位于質(zhì)外體中的植物來源蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的植物或植物物質(zhì)；由植物物質(zhì)產(chǎn)生原生質(zhì)體/原生質(zhì)球級分和質(zhì)外體級分，質(zhì)外體級分包含植物來源的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白，以及回收質(zhì)外體級分。如期望的話，可從質(zhì)外體級分中純化植物來源的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白。本發(fā)明還提供了制備蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的方法，其中蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白包含植物來源的脂質(zhì)包膜，例如包含植物來源的脂質(zhì)包膜的vlp。該方法包括獲取包含目的超結(jié)構(gòu)蛋白(例如vlp)的植物或植物物質(zhì)，用酶組合物處理植物或植物物質(zhì)以產(chǎn)生一種或多于一種質(zhì)外體蛋白復(fù)合物和原生質(zhì)體/原生質(zhì)球級分，將一種或多于一種質(zhì)外體蛋白復(fù)合物與原生質(zhì)體級分分離。所述一種或多于一種質(zhì)外體蛋白復(fù)合物包含超結(jié)構(gòu)蛋白或含有植物來源的脂質(zhì)包膜的vlp。本發(fā)明還提供了制備植物來源的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的方法，其包括獲取包含植物來源的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的植物或植物物質(zhì)，用細胞壁降解酶組合物消化植物物質(zhì)以產(chǎn)生消化級分，過濾消化級分以產(chǎn)生過濾級分，和從過濾級分回收植物來源的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白。在這個方法中，原生質(zhì)體的完整性可以不是必需的。原生質(zhì)體是完全或部分去除細胞壁的植物細胞。原生質(zhì)球可以部分去除細胞壁。原生質(zhì)體、原生質(zhì)球或原生質(zhì)體和原生質(zhì)球(原生質(zhì)體/原生質(zhì)球)均如本文所述使用，并且本文使用的這些術(shù)語是可以互換的?？梢酝ㄟ^機械方式(例如通過勻漿、攪拌)破碎和去除細胞壁，可全部或部分地酶消化細胞壁，或可以通過機械和酶聯(lián)合的方法去除細胞壁，例如勻漿之后用酶處理以消化細胞壁。原生質(zhì)體也可以從培養(yǎng)的植物細胞獲取，例如從液體培養(yǎng)的植物細胞或固體培養(yǎng)的植物細胞。給出植物組織培養(yǎng)物、培養(yǎng)的植物細胞和原生質(zhì)體、原生質(zhì)球生產(chǎn)等的一般原則的標(biāo)準(zhǔn)參考文獻包括：introductiontoplanttissueculture，mkrazdan著，第二版(sciencepublishers，2003年；通過引用并入本文)，或例如參見下述url：molecular-plant-biotechnology.info/plant-tissue-culture/protoplast-isolation.htm。與原生質(zhì)體(或原生質(zhì)球)的生產(chǎn)和操作相關(guān)的方法和技術(shù)綜述于，例如，daveymr等，2005(biotechnologyadvances23：131-171；通過引用并入本文)。給出蛋白生物化學(xué)、分子生物學(xué)等的一般方法與原則的標(biāo)準(zhǔn)參考文獻包括，例如ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork(1998年和2001年的增刊；通過引用并入本文)；sambrook等，molecularcloning：alaboratorymanual，第二版，coldspringharborlaboratorypress，plainview，newyork，1989(通過引用并入本文)；kaufman等編.，handbookofmolecularandcellularmethodsinbiologyandmedicine，crcpress，bocaraton，1995(通過引用并入本文)；mcpherson編，directedmutagenesis：apracticalapproach，irlpress，oxford，1991(通過引用并入本文)。消化或降解細胞壁以釋放原生質(zhì)體或原生質(zhì)球的酶是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，可以包括纖維素酶(ec3.2.1.4)、果膠酶(ec3.2.1.15)、木聚糖酶(ec3.2.1.8)、幾丁質(zhì)酶(ec3.2.1.14)、半纖維素酶或其組合。合適的酶的非限制性實例包括多組分酶的混合物，其包含纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶，例如macerozymetm(約含：纖維素酶：0.1u/mg，半纖維素酶：0.25u/mg，和果膠酶：0.5u/mg)。另一些商業(yè)化酶、酶混合物的例子和供應(yīng)商列于表1(參見：introductiontoplanttissueculture，mkrazdan第二版，sciencepublishers，2003年)。替代性的纖維素酶的名稱和種類包括內(nèi)-1，4-β-d-葡聚糖酶；β-1，4-葡聚糖酶；β-1，4-葡聚糖內(nèi)切水解酶；纖維素酶a；cellulosinap；葡聚糖內(nèi)切酶d，堿性纖維素酶；纖維素酶a3；纖維素糊精酶(celludextrinase)；9.5纖維素酶；微晶纖維素酶；pancellasess和1，4-(1，3；1，4)-β-d-葡聚糖4-葡聚糖水解酶。替代性的果膠酶(多聚半乳糖醛酸酶)的名稱和種類包括果膠去聚合酶；果膠酶；多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶；果膠酶(pectolase)；果膠水解酶；果膠多聚半乳糖醛酸酶；多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶；多聚-α-1，4-半乳糖醛酸聚糖水解酶；半乳糖醛酸內(nèi)切酶；內(nèi)-d-半乳糖醛酸酶和多聚(1，4-α-d-半乳糖醛酸)聚糖水解酶。替代性的木聚糖酶的名稱和種類包括半纖維素酶，內(nèi)-(1→4)-β-木聚糖4-木聚糖水解酶；內(nèi)-1，4-木聚糖酶；木聚糖酶；β-1，4-木聚糖酶；內(nèi)-1，4-木聚糖酶；內(nèi)-β-1，4-木聚糖酶；內(nèi)-1，4-β-d-木聚糖酶；1，4-β-木聚糖木聚糖水解酶；β-木聚糖酶；β-1，4-木聚糖木聚糖水解酶；內(nèi)-1，4-β-木聚糖酶；β-d-木聚糖酶。替代性的幾丁質(zhì)酶的名稱和種類包括幾丁質(zhì)糊精酶；1，4-β-多聚-n-乙酰氨基葡糖苷酶；多聚-β-氨基葡糖苷酶；β-1，4-多聚-n-乙酰氨基葡糖苷酶；多聚[1，4-(n-乙酰-β-d-氨基葡糖苷酶)]聚糖水解酶。表1：用于原生質(zhì)體分離的市售酶的非限制性實例特定的酶或酶組合以及濃度和反應(yīng)條件的選擇可取決于用于獲取原生質(zhì)體和包含vlp的質(zhì)外體級分的植物組織的類型。使用纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶的混合物(例如，果膠酶macerozymetm或multifect)的濃度范圍可以是0.01％至2.5％(v/v)，例如0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5％(v/v)或其間任意值。macerozymetm或multifect可以單獨使用，或與其他酶(例如纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶或其組合)聯(lián)合使用。使用纖維素酶的濃度范圍可以是0.1％至5％，例如0.1、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25、2.5、2.75、3.0、3.25、3.5、3.75、4.0、4.25、4.5、4.75、5.0％(w/v)或其間任意值。酶溶液(或稱為細胞壁降解組合物，消化溶液)通常包含緩沖劑或緩沖體系、滲壓劑和一種或多于一種鹽、二價陽離子或其他添加劑。選擇緩沖劑或緩沖體系將ph維持在適于酶活性和蛋白或vlp穩(wěn)定性的范圍內(nèi)，以在例如在約ph5.0至約8.0或其間任意值的范圍內(nèi)純化。所選的ph可以根據(jù)待回收的vlp而異，例如ph可以是5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0或其間任意ph。緩沖劑或緩沖體系的例子包括但不限于mes、磷酸鹽、檸檬酸鹽等。一種或更多種緩沖劑或緩沖體系可以與酶溶液(消化溶液)組合；一種或更多種緩沖劑存在的濃度可以是0mm至約200mm或其間任意值，例如10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180或190mm或其間任意值。根據(jù)適用程度，如期望的話可以添加滲壓劑成分。選擇滲壓劑及其濃度以提高酶溶液的滲透強度。滲壓劑的例子包括甘露糖醇、山梨醇或其他糖醇，聚合物長度不同的聚乙二醇(peg)等。滲壓劑的濃度范圍根據(jù)植物物種、使用的滲壓劑類型和所選植物組織類型(來源的物種或組織，例如葉或莖)而異——通常范圍為0m至約0.8m，例如0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.5、0.6、0.7或0.75m或其間任意值，例如0、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600nm甘露糖醇或其間任意值。滲壓劑的濃度也可用百分比(w/v)表示。對于某些植物或組織類型，采用稍高滲的制劑可以是有利的，這可以促進植物細胞的質(zhì)膜與細胞壁分離。在消化過程中也可以省略滲壓劑。另一個為植物消化設(shè)置的參數(shù)是溫度。如期望的話，可以在消化過程中控制溫度。有用的溫度范圍應(yīng)在4℃至40℃之間或其間任意溫度，例如約4℃至約15℃或其間任意值，或約4℃至約22℃或其間任意溫度。根據(jù)選擇的溫度，可以調(diào)整其他消化實驗參數(shù)以保持最佳的提取條件。可以添加陽離子、鹽或二者以提高質(zhì)膜穩(wěn)定性，例如濃度為0.5-50mm或其間任意值的二價陽離子(如ca2+或mg2+)，約0至約750mm或其間任意值(例如10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700或750mm)的鹽(如cacl2、nacl、cuso4、kno3等)。可以添加的其他添加劑包括螯合劑(例如但不限于，約0至約200mm或其間任意值(例如5、10、15、20、25、50、75、100、125、150、175、200mm或其間任意值)的edta、egta)，防止氧化的還原劑(例如但不限于，0.005-0.4％或其間任意值(例如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.15、0.2、0，25、0.3、0.35、0.4％或其間任意值)的亞硫酸氫鈉或抗壞血酸)，特定的酶抑制劑(參見下文)以及(如期望的話)葉老化抑制劑，例如環(huán)己酰亞胺、激動素或一種或更多種聚胺。消化溶液還可以包含一種或更多種約0至約600mm的甘露糖醇、約0至約500mm的nacl、約0至約50mm的edta、約1％至約2％v/v的纖維素酶、約0至約1％v/v的果膠酶、約0.03至約0.04％的焦亞硫酸鈉、約0至約125mm的檸檬酸鹽或約0至75mm的napo4?？梢蕴幚碇参镂镔|(zhì)以提高酶或酶組合物對植物細胞壁的接近程度。例如，在用酶組合物處理之前可將葉的表皮去除或“剝離”?？梢詫⒅参镂镔|(zhì)切成小塊(手工地，或用粉碎或切削裝置如urschel切片機)；切碎的植物物質(zhì)可以在部分真空下進一步用酶組合物滲透(nishimura和beevers1978年，plantphysiol62：40-43；newell等，1998年，j.expbotany49：817-827)。在酶組合物處理之前或過程中可以對植物組織施加機械擾動(giridhar等，1989年.protoplasma151：151-157)。另外，可以使用培養(yǎng)的細胞(無論是液體培養(yǎng)物還是固體培養(yǎng)物)制備原生質(zhì)體或原生質(zhì)球。期望使用缺少脂肪酶或蛋白酶或者含有滅活的脂肪酶或蛋白酶的酶組合物。在一些實施方案中，酶組合物中可以包含一種或更多種蛋白酶或脂肪酶抑制劑。脂肪酶抑制劑的例子包括rhc80267(sigmaaldrich)；蛋白酶抑制劑的例子包括e-64、na2edta、胃酶抑素(pepstatin)，抑肽酶(aprotinin)、pmsf，pefabloc、亮抑蛋白酶肽(leupeptin)，bestatin等?？墒褂没旌匣驍嚢杳附M合物中植物物質(zhì)的任何適合方法。例如，植物物質(zhì)可以在碟或盤上或通過旋轉(zhuǎn)搖蕩器輕輕地轉(zhuǎn)動或搖動，在旋轉(zhuǎn)或擺動的圓桶中翻滾。在將原生質(zhì)體(和/或原生質(zhì)球)從消化液中移出之前應(yīng)小心處理，以將對它們的損傷降低到最低。應(yīng)相應(yīng)地選擇消化容器。作為一個非限制性的例子，可以使用在500mm甘露糖醇、10mcacl2和5mmmes(ph5.6)中包含1.5％纖維素酶(onozukar-10)和0.375％的macerozymetm的酶組合物來從一些煙草(nicotiana)組織制備原生質(zhì)體(或原生質(zhì)球)。如本文所述，甘露糖醇的濃度也可以為約0至約500mm或其間任意值不等。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在知曉本文公開的信息后，可以針對煙草或用于制備vlp的其他物種的年齡和株系決定合適的酶組合物。破碎細胞壁或部分消化細胞壁后，獲得原生質(zhì)體級分(包含原生質(zhì)體和/或原生質(zhì)球)和“質(zhì)外體級分”?；蛘?，可以獲得“消化級分”。如下所述，對于本文所述的蛋白質(zhì)高產(chǎn)量制備，原生質(zhì)體級分的完整性可以不是必需的，因此，可使用質(zhì)外體級分或消化級分提取蛋白質(zhì)，例如但不限于vlp、病毒包膜蛋白、病毒結(jié)構(gòu)蛋白、病毒衣殼蛋白、病毒外殼蛋白?！百|(zhì)外體級分”是指在滲壓劑和/或其他可用于協(xié)助保持原生質(zhì)體完整性的成分的存在下，使用細胞壁降解酶酶消化或部分酶消化植物物質(zhì)后獲得的級分。質(zhì)外體級分可以包含破碎的原生質(zhì)體(或原生質(zhì)球)產(chǎn)生的一些成分。例如，質(zhì)外體級分可以包含約0至約50％(v/v)或其間任意量的原生質(zhì)體級分的成分，或0、0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、或50％(v/v)或其間任意量的原生質(zhì)體級分的成分?！跋壏帧笔侵甘褂眉毎诮到饷该赶虿糠置赶参镂镔|(zhì)后剩余的級分，但是，原生質(zhì)體的完整性不是必需的，消化級分可以包含完整的、破碎的或者完整的和破碎的原生質(zhì)體。用于產(chǎn)生消化級分的包含細胞壁降解酶的組合物可以包含滲壓劑，或者滲壓劑存在的量可以比用于獲得原生質(zhì)體的標(biāo)準(zhǔn)方法中使用的量少，或組合物中不存在滲壓劑。消化級分包含質(zhì)外體級分和原生質(zhì)體/原生質(zhì)球級分，但原生質(zhì)體/原生質(zhì)球級分可以是或不是完整的。消化級分包含細胞內(nèi)成分和細胞外成分。如果使用滲壓劑來保持原生質(zhì)體/原生質(zhì)球的完整性，則可發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)成分為原生質(zhì)體/原生質(zhì)球形式。如果消化溶液中沒有滲壓劑，則原生質(zhì)體/原生質(zhì)球可能被破壞并且消化級分中細胞內(nèi)和細胞外成分可能合并在一起。如本文所述，可以通過任何合適的技術(shù)從消化級分的成分中分離目的蛋白質(zhì)或目的蛋白超結(jié)構(gòu)。不希望被理論所約束，細胞壁消化步驟可松動細胞壁的多聚成分并協(xié)助釋放蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白，使它們不會被約束在細胞壁內(nèi)。該方案也可以最大限度地減少細胞內(nèi)成分對蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的污染。可以在酶消化之后用低速離心然后過濾、深層過濾、沉降、沉淀(例如但不限于硫酸銨沉淀)或其組合來將目的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白與細胞碎片分離，以獲得包含目的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的分離級分。如果采用滲壓劑，則可以用任何合適的技術(shù)(例如但不限于離心、過濾、深層過濾、沉降、沉淀或其組合)將原生質(zhì)體/原生質(zhì)球級分或包含原生質(zhì)體的級分與質(zhì)外體級分分離，來獲得包含目的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白和/或包含含有目的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白之原生質(zhì)體/原生質(zhì)球的分離級分。分離級分可以是例如上清液(如果是離心、沉降或沉淀的話)或濾液(如果是過濾的話)，并且富含蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白。分離級分可被進一步處理，以通過例如另外的離心步驟、沉淀、層析步驟(例如體積排阻、離子交換、親和層析)、切向流過濾或其組合來分離、純化、濃縮(或其組合)蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白。純化的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的存在可通過例如非變性page或sds-page、使用合適的檢測抗體的western分析、毛細管電泳或本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的其他方法證實。質(zhì)外體是質(zhì)膜外的植物細胞部分，并且包含細胞壁和植物的細胞間隙。雖然優(yōu)選在消化和進一步處理過程中保持原生質(zhì)體(和/或原生質(zhì)球)的完整性，但對于富集蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白來說，保持原生質(zhì)體完整不是必需的。在合成過程中，蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白可被分泌到質(zhì)膜外。如果超結(jié)構(gòu)蛋白是vlp，它們的平均大小為約20nm至1μm或其間任意量。如果超結(jié)構(gòu)蛋白是抗體，它們的分子量為約100kda至約1000kda或其間任意量。由于它們的大小，一旦合成，蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白可能被困于質(zhì)膜和細胞壁之間，可能無法使用用于獲得植物蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)機械方法進行分離或進一步純化。為了將產(chǎn)量最大化，有利的可以是將細胞蛋白質(zhì)對超結(jié)構(gòu)蛋白級分的污染最小化，保持蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白和(如果需要的話)結(jié)合的脂質(zhì)包膜或膜的完整性，將對原生質(zhì)體和/或原生質(zhì)球的機械損傷最小化的破壞細胞壁釋放蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的方法，例如本文所述的酶法。但是，在處理過程中保持所有的原生質(zhì)體的完整性不是必需的。植物中產(chǎn)生的超結(jié)構(gòu)蛋白(例如vlp)可以與植物來源的脂質(zhì)復(fù)合。植物來源的脂質(zhì)可以是脂雙層的形式，并且還可以包含圍繞vlp的包膜。植物來源的脂質(zhì)可包括產(chǎn)生vlp之植物的質(zhì)膜脂質(zhì)成分，包括但不限于磷脂酰膽堿(pc)、磷脂酰乙醇胺(pe)、鞘糖脂、植物甾醇或其組合。植物來源的脂質(zhì)可互換地稱為‘植物脂質(zhì)’。植物甾醇的例子在本領(lǐng)域已知，包括例如豆甾醇、谷甾醇、24-甲基膽固醇和膽固醇(mongrand等，2004年，j.biolchem279：36277-86)。按照期望可以將多肽的表達靶向植物的任意細胞內(nèi)或細胞外空間、細胞器或組織。為了將表達的多肽定位到特定位置，編碼多肽的核酸可以與編碼信號肽或前導(dǎo)序列的核酸序列相連。信號肽也可稱為轉(zhuǎn)運肽、信號序列或前導(dǎo)序列。引導(dǎo)表達的多肽定位于質(zhì)外體的信號肽或肽序列包括但不限于天然(相對于蛋白來說)信號或前導(dǎo)序列或異源信號序列，例如但不限于大米淀粉酶信號肽(mccormick1999年，procnatlacadsciusa96：703-708)、氨基酸序列如下的蛋白二硫鍵異構(gòu)酶信號肽(pdi)：maknvaifgllfsllllvpsqifaee；seqidno.10，植物發(fā)病相關(guān)蛋白(plantpathogenesisrelatedprotein，prp；szyperski等pnas95：2262-2262)例如煙草植物發(fā)病相關(guān)蛋白2(prp)、人單克隆抗體信號肽(sp或前導(dǎo)序列)或相對于蛋白質(zhì)來說為天然的任意信號肽。在一些例子中，例如多肽在沒有信號肽或轉(zhuǎn)運肽的情況下表達并分泌時，表達的多肽可以在特定的細胞內(nèi)或細胞外空間(如質(zhì)外體)、細胞器或組織中累積。術(shù)語“病毒樣顆粒”或“vlp”(virus-likeparticle)是指自組裝并且包含病毒表面蛋白(例如流感ha蛋白或嵌合流感ha蛋白)的結(jié)構(gòu)。vlp和嵌合vlp通常在形態(tài)和抗原性上類似于感染中產(chǎn)生的病毒粒，但缺乏足以進行復(fù)制的遺傳信息，從而不具備感染性?！扒逗系鞍住被颉扒逗隙嚯摹笔侵赴瑑煞N或多于兩種來源(例如但不限于融合為單個多肽的兩種或更多種流感類型或亞型)的氨基酸序列的蛋白或多肽。嵌合蛋白或多肽可以包含與多肽或蛋白的其余部分相同來源(即天然)或異源的信號肽。嵌合蛋白或嵌合多肽可作為嵌合核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生并保持完整，或如果需要的話，嵌合蛋白或嵌合多肽可以在合成后被切割。完整的嵌合蛋白或嵌合蛋白之經(jīng)切割部分可以結(jié)合形成多聚體蛋白。嵌合蛋白或嵌合多肽還可以包括含有經(jīng)二硫橋連接之亞基的蛋白質(zhì)或多肽(即多聚蛋白)。例如，包含兩種或多于兩種來源的氨基酸序列的嵌合多肽可被加工成亞基，并且所述亞基通過二硫橋相連來形成嵌合蛋白或嵌合多肽。嵌合蛋白的一個非限制性實例是嵌合單克隆抗體例如c2b8，或嵌合vlp，例如但不限于描述于美國臨時申請us61/220,161和pct/ca2010/000983(通過引用并入本文)的構(gòu)建體編號690、691、696、734、737、745或747(表2)生成的蛋白和vlp。所述蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白可以是糖蛋白，本文所述的涉及通過細胞壁消化進行提取的方法可以用于這樣的植物，其如wo20008/151440(modifyingglycoproteinproductioninplants；通過引用并入本文)所述那樣共表達糖蛋白和用于修飾n-糖基化譜的一種或更多種酶，以利于回收具有經(jīng)修飾成熟n-聚糖的糖蛋白。例如，成熟的n-聚糖可以不具有木糖和巖藻糖殘基，或呈現(xiàn)減少的巖藻糖基化、木糖基化或巖藻糖基化和木糖糖基化二者都減少的n-聚糖?；蛘?，可獲得包含改變的糖基化模式的目的蛋白質(zhì)，其中蛋白質(zhì)缺少巖藻糖基化、木糖基化或二者都缺少，并且包含提高的半乳糖基化。改變的n-糖基化譜可通過在植物、植物部分或植物細胞中共表達編碼雜合蛋白(gnt1-galt)的第一核苷酸序列的核苷酸序列以及編碼目的超結(jié)構(gòu)蛋白的第二核苷酸序列來獲得，所述雜合蛋白包含與β-1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(galt)的催化結(jié)構(gòu)域融合的n-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶(gnt1)的cts結(jié)構(gòu)域(即胞質(zhì)尾，跨膜結(jié)構(gòu)域，莖區(qū))，所述第一核苷酸序列與在植物中有活性的第一調(diào)控區(qū)有效相連，所述第二核苷酸序列與在植物中有活性的第二調(diào)控區(qū)有效相連，如wo20008/151440中所述，共表達第一和第二核苷酸序列來合成具有n-糖基化譜被改變之聚糖的目的超結(jié)構(gòu)蛋白。超結(jié)構(gòu)蛋白可以是流感血凝素(ha)，并且構(gòu)成多肽的兩種或多于兩種氨基酸序列中的每個均可獲得自不同的ha，從而產(chǎn)生嵌合ha或嵌合流感ha。嵌合ha還可以包含含有異源信號肽(其在合成后被切割)的氨基酸序列(嵌合ha前體蛋白)。可用于本發(fā)明的ha蛋白的例子可參見wo2009/009876；wo2009/076778；wo2010/003225(通過引用并入本文)。編碼嵌合多肽的核酸可稱為“嵌合核酸”或“嵌合核苷酸序列”。由嵌合ha構(gòu)成的病毒樣顆粒可稱為“嵌合vlp”。嵌合vlp還在pct申請?zhí)杙ct/ca2010/000983(于2010年6月25日提交)和美國臨時申請?zhí)?1/220,161(于2009年6月24日提交；通過引用并入本文)中描述。vlp可從天然或嵌合ha的表達獲得。按照本發(fā)明提供方法制備的vlp的ha包括已被開發(fā)或鑒定的已知序列和變體ha序列。另外，如本文所述制備的vlp不包含神經(jīng)氨酸酶(na)或其他如m1(m蛋白)、m2、ns等的成分。但是，如果期望獲得包含ha和na的vlp，可以將na和m1與ha共表達。通常，術(shù)語“脂質(zhì)”指脂溶性(親脂)天然分子。按照本發(fā)明的某些方面在植物中產(chǎn)生的嵌合vlp可以與植物來源的脂質(zhì)復(fù)合。植物來源的脂質(zhì)可以是脂雙層的形式，并且還可以包含圍繞vlp的包膜。植物來源的脂質(zhì)可包括生成vlp的植物的質(zhì)膜脂質(zhì)成分，包括磷脂，三、二和單酸甘油酯以及脂溶性甾醇或包含甾醇的代謝物。例子包括磷脂酰膽堿(pc)、磷脂酰乙醇胺(pe)、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸、鞘糖脂、植物甾醇或其組合。或者植物來源的脂質(zhì)可稱為“植物脂質(zhì)”。植物甾醇的例子包括菜油甾醇、豆甾醇、麥角甾醇、菜子甾醇、δ-7-豆甾醇、δ-7-燕麥甾醇、daunosterol、谷甾醇、24-甲基膽固醇、膽固醇或β-谷甾醇(mongrand等，2004年，j.biolchem279：36277-86)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員易于理解的，細胞質(zhì)膜的脂質(zhì)構(gòu)成可隨獲得細胞的細胞或有機體或物種的培養(yǎng)或生長條件而異。細胞膜通常包含脂雙層以及多種功能的蛋白質(zhì)?？梢栽谥p層中發(fā)現(xiàn)特定脂質(zhì)的局部聚集，稱為‘脂質(zhì)筏‘。這些脂質(zhì)筏微結(jié)構(gòu)域可以富含鞘脂和甾醇。不希望被理論所約束，脂質(zhì)筏可以在胞吞和胞吐、病毒或其他感染物的進出、細胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、與細胞或有機體的其他結(jié)構(gòu)成分(如細胞內(nèi)和細胞外基質(zhì))的相互作用中起重要作用。之前wo2009/009876；wo2009/076778和wo2010/003225(通過引用并入本文)已描述了包含脂質(zhì)包膜的vlp。對于流感病毒，本文所用術(shù)語“血凝素”或“ha”指流感病毒顆粒的結(jié)構(gòu)糖蛋白。本發(fā)明的ha可從任何亞型獲得。例如，ha可以是亞型h1、h2、h3、h4、h5、h6、h7、h8、h9、h10、h11、h12、h13、h14、h15或h16，或乙型或丙型流感。本發(fā)明的重組ha還可以包含基于任何血凝素序列的氨基酸序列。已很好地研究了流感血凝素的結(jié)構(gòu)，并證明在二級、三級和四級結(jié)構(gòu)上高度保守。甚至可以在氨基酸序列改變的情況下發(fā)現(xiàn)這種結(jié)構(gòu)保守性(參見例如，skehel和wiley，2000年annrevbiochem69：531-69；vaccaro等2005年；通過引用并入本文)。編碼ha的核苷酸序列是公知的并且可獲得，例如從生物防御和公眾健康數(shù)據(jù)庫(biodefenseandpublichealthdatabase)(現(xiàn)為流感研究數(shù)據(jù)庫；squires等，2008年nucleicacidsresearch36：d497-d503)例如url為：biohealthbase.org/gsearch/home.do？decorator＝influenza)或由國家生物技術(shù)信息中心維護的數(shù)據(jù)庫(ncbi；例如url為：ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝nuccore&cmd＝search&term＝influenza)，兩者均通過引用并入本文。本發(fā)明還涉及制備、分離或者制備并分離vlp的方法，所述vlp包括感染人或宿主動物(例如靈長類動物、馬、豬、鳥、綿羊、鳥類水禽、候鳥、鵪鶉、鴨、鵝、家禽、雞、駱駝、犬科動物、狗、貓科動物、貓、虎、豹、麝貓、貂、石貂、雪貂、家養(yǎng)寵物、牲畜、小鼠、大鼠、海豹、鯨等)的病毒的流感vlp。一些流感病毒可以感染多于一種宿主動物。流感病毒血凝素可以耐受氨基酸變化。這種變化提供了不斷被鑒定出的新毒株。新毒株之間感染力可不同。然而，隨后形成vlp的血凝素三聚體的形成被保留。本發(fā)明還包括制備任何植物來源的vlp(無論ha亞型或序列或者形成vlp的嵌合ha或者物種來源為何)的方法。超結(jié)構(gòu)蛋白的正確折疊對于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、多聚體的形成、蛋白質(zhì)的形成和功能可以是重要的。蛋白質(zhì)的折疊可被一個或更多個因素影響，包括但不限于蛋白質(zhì)序列，蛋白質(zhì)的相對豐度，細胞內(nèi)擁擠的程度，可以結(jié)合折疊、部分折疊或未折疊蛋白質(zhì)或與其短暫相關(guān)聯(lián)的輔因子的可利用性，一種或更多種伴侶蛋白的存在等。熱休克蛋白(hsp)或應(yīng)激蛋白是伴侶蛋白的例子，它可參與多種細胞過程，包括蛋白質(zhì)合成、細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運、防止錯誤折疊、防止蛋白質(zhì)聚集、蛋白復(fù)合物的組裝和解組裝、蛋白質(zhì)折疊和蛋白質(zhì)解聚。這種伴侶蛋白的例子包括但不限于hsp60、hsp65、hsp70、hsp90、hsp100、hsp20-30、hsp10、hsp100-200、hsp100、hsp90、lon、tf55、fkbp、親環(huán)素、clpp、grpe、泛素、鈣聯(lián)蛋白和蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(參見例如，macario，a.j.l.，coldspringharborlaboratoryres.25：59-70.1995年；parsell，d.a.&lindquist，s.ann.rev.genet.27：437-496(1993)；美國專利號5,232,833)。伴侶蛋白(例如但不限于hsp40和hsp70)可用于保證嵌合ha的折疊(pct申請?zhí)杙ct/ca2010/000983，于2010年6月25日提交，美國臨時申請?zhí)?1/220,161，于2009年6月24日提交；wo2009/009876和wo2009/076778，以上均通過引用并入本文)。還可以使用蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(pdi；登錄號z11499)。回收后，可通過例如但不限于電子顯微鏡、光散射、體積排阻層析、hplc、western印跡分析、電泳、elisa、基于活性的測定(例如凝血測定)或任何其他合適的測定來評估蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的結(jié)構(gòu)、大小效力或活性。用于評價vlp的大小、濃度、活性和構(gòu)成的這些和其他評估方法是本領(lǐng)域公知的。對于制備型體積排阻層析，可通過本文所述方法獲得包含蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的制備物，并且通過離心去除不溶性物質(zhì)。用peg或硫酸銨沉淀也可以是有益的?；厥盏牡鞍踪|(zhì)可通過常規(guī)方法(例如，bradford測定、bca)定量，提取物流經(jīng)體積排阻柱(例如使用sephacryltm、sephadextm或類似基質(zhì))，使用離子交換柱層析或親和柱層析，并且收集活性級分。還可使用基于親和力的磁珠分離(例如用dynabeadstm(invitrogen))獲取并且從dynabeadstm洗脫蛋白復(fù)合物來獲得蛋白復(fù)合物。還可以使用層析和分離方案的組合。層析或分離后，可根據(jù)期望通過蛋白質(zhì)電泳、免疫印跡、elisa、基于活性的測定來進一步分析級分，以確認(rèn)超結(jié)構(gòu)蛋白的存在。如果超結(jié)構(gòu)蛋白是vlp，那么可通過本領(lǐng)域公知的方法，使用凝血測定評估包含vlp之級分的凝血活性。不希望被理論所約束，ha結(jié)合不同動物來源的rbc的能力被ha對唾液酸α2，3或α2，3的親和力和rbc表面上這些唾液酸的存在所驅(qū)動。馬類和禽類的流感病毒ha凝集所有幾種物種(包括火雞、雞、鴨、豚鼠、人、綿羊、馬和牛)的紅細胞，；而人ha結(jié)合火雞、雞、鴨、豚鼠、人和綿羊的紅細胞(itot.等，1997年，virology，227：493-499；medeirosr等，2001年.virology289：74-85)。凝血抑制(hi或hai)測定也可用于證實疫苗或疫苗組合物(包含嵌合ha或可通過重組ha抑制紅細胞(rbc)凝集的嵌合vlp)所誘導(dǎo)的抗體的效力?？赏ㄟ^微滴定hai(aymard等1973年)評價血清樣品的凝血抑制性抗體效價?？梢允褂脦追N物種(例如馬、火雞、雞等)中任意一種的紅細胞。該測定給出vlp表面ha三聚體組裝的間接信息，以確認(rèn)ha上抗原性位點的正確呈遞。也可使用交叉反應(yīng)性hai效價證明對與疫苗亞型相關(guān)的其他病毒株的免疫應(yīng)答效力。例如，用包含含有第一流感類型或亞型之hdc的嵌合血凝素的疫苗組合物免疫的對象的血清可用在用第二株完整病毒或病毒顆粒進行的hai測試中，并且測定hai效價。通過本發(fā)明方法制備的流感vlp可與現(xiàn)有流感疫苗聯(lián)合使用，以補充該疫苗使其更為有效或者降低所需的施用劑量。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，疫苗可針對一種或多于一種的流感病毒。合適疫苗的例子包括但不限于，從sanofi-pasteur、idbiomedical、merial、sinovac、chiron、roche、medimmune、glaxosmithkline、novartis、sanofi-aventis、serono、shirepharmaceuticals等購得的那些。如期望的話，本發(fā)明的vlp可以與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適佐劑相混合。另外，根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的vlp可與其他蛋白成分共表達或與其他vlp或流感蛋白質(zhì)成分(例如神經(jīng)氨酸酶(na)、m1和m2)重組。它也可以與其他疫苗蛋白(例如瘧疾抗原、hiv抗原、呼吸道合胞體病毒(rsv)抗原等)制得的vlp共表達或重組。包含蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的轉(zhuǎn)基因植物、植物細胞、植物物質(zhì)或種子的轉(zhuǎn)化和再生方法已在本領(lǐng)域中建立并為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。獲得轉(zhuǎn)化和再生植物的方法并非本發(fā)明的關(guān)鍵?！稗D(zhuǎn)化”是指表現(xiàn)為基因型、表型或兩者兼有的遺傳信息(核苷酸序列)在種間的轉(zhuǎn)移。遺傳信息從嵌合構(gòu)建體到宿主的種間轉(zhuǎn)移可以是可遺傳的(即整合到宿主的基因組中)，并且認(rèn)為遺傳信息的轉(zhuǎn)移是穩(wěn)定的，或者轉(zhuǎn)移可以是瞬時的而且該遺傳信息的轉(zhuǎn)移是不可遺傳的。術(shù)語“植物物質(zhì)”是指來源于植物的任何材料。植物物質(zhì)可以包括整個植物、組織、細胞或任何其部分。此外，植物物質(zhì)可以包括細胞內(nèi)植物成分、細胞外植物成分，植物的液體或固體提取物或其組合。另外，植物物質(zhì)可以包括來自植物的葉、莖、果實、根或其組合的植物、植物細胞、組織、液體提取物或其組合。植物物質(zhì)可以包括沒有經(jīng)受任何處理步驟的植物或其部分。植物部分可以包括植物物質(zhì)。植物或植物物質(zhì)可以通過任何方法收集或獲得，例如，可使用整個植株或者特別地移取以用于所述方法的葉或其他組織。表達和分泌vlp的轉(zhuǎn)基因植物也可以作為本文所述方法的原料使用。本發(fā)明的構(gòu)建體可通過ti質(zhì)粒、ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接dna轉(zhuǎn)化、顯微注射、電穿孔、滲入等引入植物細胞。此類技術(shù)的綜述參見例如weissbach和weissbach，methodsforplantmolecularbiology，academypress，newyorkviii，421-463頁(1988年)；geierson和corey，plantmolecularbiology，第二版(1988)；miki和iyer，fundamentalsofgenetransferinplants，plantmetabolism，第二版.dt.dennis，dhturpin，ddlefebrve，dblayzell編，addison-wesley，langmansltd.london，pp.561-579(1997)。其他方法包括直接dna攝取、使用脂質(zhì)體、電穿孔例如用原生質(zhì)體、顯微注射、微彈(microprojectile)或晶須(whisker)和真空滲入。參見例如，bilang等(gene100：247-250(1991年)，scheid等(mol.gen.genet.228：104-112，1991年)，guerche等(plantscience52：111-116，1987年)，neuhause等(theor.applgenet.75：30-36，1987年)，klein等，nature327：70-73(1987年)；howell等(science208：1265，1980年)，horsch等(science227：1229-1231，1985年)，deblock等，plantphysiology91：694-701，1989年)，methodsforplantmolecularbiology(weissbach和weissbach，eds.，academicpressinc.，1988)，methodsinplantmolecularbiology(schuler和zielinski編，academicpressinc.，1989年)，liu和lomonossoff(j.virolmeth，105：343-348，2002年)，美國專利號4,945,050；5,036,006；5,100,792；6,403,865；5,625,136，均通過引用并入本文?？梢允褂盟矔r表達法表達本發(fā)明的構(gòu)建體(參見liu和lomonossoff，2002，journalofvirologicalmethods，105：343-348；通過引用并入本文)。或者，可以使用基于真空的瞬時表達方法(描述于pct公開wo00/063400、wo00/037663(通過引用并入本文))。這些方法可以包括，例如但不限于農(nóng)桿菌接種或農(nóng)桿菌滲入法，但是，還可使用如上所述的其他瞬時方法。對于農(nóng)桿菌接種或農(nóng)桿菌滲入，包含期望核酸的農(nóng)桿菌(agrobacteria)混合物進入組織(例如葉、植物的地上部分(包括莖、葉和花)、植物的其他部分(莖、根、花))或整個植株的細胞間隙。穿過表皮后，農(nóng)桿菌侵染并將t-dna拷貝傳遞進細胞。t-dna被附加轉(zhuǎn)錄并且mrna被翻譯，使得所侵染細胞產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)，但t-dna在細胞核內(nèi)的傳代是瞬時的。本文所述的序列總結(jié)如下。本發(fā)明將在下面實施例中進一步說明。然而，應(yīng)理解這些實施例僅用于說明目的，不應(yīng)以任何方式用于限制本發(fā)明的范圍。表達盒的組裝可用于生成vlp的構(gòu)建體描述于美國臨時申請?zhí)杣s61/220,161和pct/ca2010/000983(通過引用并入本文)、wo2009/009876、wo2009/076778和wo2010/003225(均通過引用并入本文)。構(gòu)建體還可以包括表2所列的那些。這些構(gòu)建體的組裝描述于wo2009/009876、wo2009/076778、wo2010/003225和us61/220,161。但還可以將包含已知ha的其他構(gòu)建體(包括但不限于表2提供的那些)與相似或不同調(diào)控元件和啟動子相組合使用來生成本文所述的vlp。表2：可用于生成血凝素的構(gòu)建體的非限制性實例。cpmv-ht表達盒包含35s啟動子以控制包含目的編碼序列的mrna的表達，該編碼序列的5’端來自豇豆花葉病毒(cpmv)rna2的核苷酸1-512，其中在115和161位有突變的atg，3’端為來自cpmvrna2(對應(yīng)于3'utr)的核苷酸3330-3481，其后為nos終止子。用質(zhì)粒pbd-c5-1lc(sainsbury等2008年；plantbiotechnologyjournal6：82-92和pct公開wo2007/135480)組裝基于cpmv-ht的血凝素表達盒。用darveau等(methodsinneuroscience26：77-85(1995))提供的基于pcr的連接方法進行cpmvrna2的115和161位atg突變。用pbd-c5-1lc作為模板進行兩個獨立的pcr。第一擴增的引物是pbinplus.2613c(seqidno：3)和mut-atg115.r(seqidno：4)。第二擴增的引物是mut-atg161.c(seqidno：5)和lc-c5-1.110r(seqidno：6)。然后將兩個片段混合并作為第三擴增的模板，其使用pbinplus.2613c(seqidno：3)和lc-c5-1.110r(seqidno：6)作為引物。用paci和apai消化所得片段并克隆到用同樣的酶消化的pbd-c5-1lc。生成的表達盒命名為828。cpmv-ht表達盒中的h5a/印度尼西亞/5/2005(構(gòu)建體號685)的組裝該表達盒的組裝描述于wo2009/009876、wo2009/076778和wo2010/003325，其通過引用并入本文。簡言之，如下將來自a/印度尼西亞/5/2005的h5編碼序列克隆到cpmv-ht中：用構(gòu)建體號660(d'aoust等，plantbiotechnologyjournal6：930-940(2008))作為模板，以apai-h5(a-indo).1c(seqidno：7)和h5(a-indo)-stui.1707r(seqidno：8)為引物進行pcr擴增，以將限制性位點apai(緊鄰起始atg的上游)和stui(緊鄰終止密碼子的下游)添加到血凝素編碼序列。構(gòu)建體660包括苜蓿質(zhì)體藍素啟動子和5'utr、來自a/印度尼西亞/5/2005的h5血凝素編碼序列(構(gòu)建體號660)、苜蓿質(zhì)體藍素3'utr和終止子序列(seqidno：9；圖5)。用apai和stui限制性酶消化所得片段并克隆到預(yù)先用同樣的酶消化的構(gòu)建體號828中。所得表達盒命名為構(gòu)建體號685(圖1、2)。沉默抑制子。轉(zhuǎn)錄后基因沉默(ptgs)可參與限制植物中轉(zhuǎn)基因的表達，共表達馬鈴薯y病毒的沉默抑制子(hcpro)可用于對抗轉(zhuǎn)基因mrna的特異性降解(brigneti等，1998年)。替代的沉默抑制子是本領(lǐng)域公知的，并且可如本文所述使用(chiba等，2006年，virology346：7-14；通過引用并入本文)，它們例如但不限于tev-p1/hc-pro(煙草蝕紋病毒(tobaccoetchvirus)-p1/hc-pro)、byv-p21、番茄叢矮病毒(tomatobushystuntvirus)的p19(tbsvp19)、番茄皺縮病毒(tomatocrinklevirus)的衣殼蛋白(tcv-cp)、黃瓜花葉病毒(cucumbermosaicvirus)的2b；cmv-2b)、馬鈴薯x病毒(potatovirusx)的p25(pvx-p25)、馬鈴薯m病毒(potatovirusm)的p11(pvm-p11)、馬鈴薯s病毒(potatoviruss)的p11(pvs-p11)、藍莓焦枯病毒(blueberryscorchvirus)的p16(bscv-p16)、柑橘腐根病毒(citrustristezavirus)的p23(ctv-p23)、葡萄卷葉相關(guān)病毒2(grapevineleafroll-associatedvirus-2)的p24(glrav-2p24)、葡萄a病毒(grapevinevirusa)的p10(gva-p10)、葡萄b病毒(grapevinevirusb)的p14(gvb-p14)、獨活潛伏病毒(heracleumlatentvirus)的p10(hlv-p10)或大蒜普通潛伏病毒(garliccommonlatentvirus)的p16(gclv-p16)。因此，沉默抑制子(例如但不限于hcpro、tev-p1/hc-pro、byv-p21、tbsvp19、tcv-cp、cmv-2b、pvx-p25、pvm-p11、pvs-p11、bscv-p16、ctv-p23、glrav-2p24、gbv-p14、hlv-p10、gclv-p16或gva-p10)可與編碼目的蛋白質(zhì)的核酸序列一起共表達以進一步確保在植物中高水平地生產(chǎn)蛋白質(zhì)。p19的構(gòu)建描述于wo2010/0003225(通過引用并入本文)。簡言之，通過darveau等(methodsinneuroscience26：77-85(1995))提供的基于pcr的連接法將番茄叢矮病毒(tbsv)p19蛋白的編碼序列連到苜蓿質(zhì)體藍素表達盒。在第一輪pcr中，用構(gòu)建體660(描述于wo2010/0003225，通過引用并入本文)作為模板，用引物plasto-443c：gtattagtaattagaatttggtgtc(seqidno：11)和supp19-plasto.rccttgtatagctcgttccattttctctcaagatg(seqidno：12)擴增質(zhì)體藍素啟動子區(qū)段。平行地，用引物supp19-1catggaacgagctatacaagg(seqidno：13)和supp19-saci.ragtcgagctcttactcgctttctttttcgaag(seqidno：14)，使用voinnet等(theplantjournal33：949-956(2003年))描述的構(gòu)建體35s：p19作為模板擴增包含p19編碼序列的另一片段。然后混合擴增產(chǎn)物并作為第二輪擴增(組裝反應(yīng))的模板，其中使用引物plasto-443c和supp19-saci.r。用bamhi(在質(zhì)體藍素啟動子中)和saci(p19編碼序列末端)消化所得片段并克隆到預(yù)先用同樣的限制性酶消化的構(gòu)建體號660中，以得到構(gòu)建體號r472。通過電穿孔(mattanovich等，1989)用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌(agrobacteiumtumefaciens)(agl1；atcc，manassas，va20108，usa)。通過限制性圖譜確認(rèn)所有根癌農(nóng)桿菌菌株的完整性。包含r472(圖11b)的根癌農(nóng)桿菌菌株被命名為“agl1/r472”。按照hamilton等(2002)所述制備hcpro構(gòu)建體(35hcpro)。測序所有克隆以確認(rèn)構(gòu)建體的完整性。通過電穿孔(mattanovich等，1989)用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌(agl1；atcc，manassas，va20108，usa)。通過限制性圖譜確認(rèn)所有根癌農(nóng)桿菌株的完整性。植物生物質(zhì)的制備，接種，農(nóng)桿菌滲入和收集在填充有市售泥炭蘚培養(yǎng)基的平地(flat)中從種子培育本塞姆氏煙草(nicotianabenthamiana)植株。以16/8的光周期和白天25℃/夜晚20℃的溫度方案在溫室中培育植株。播種后三周，挑選出單個苗，移植到花盆里并在相同環(huán)境條件下的溫室中再培育三周。六周后，植株的平均重量為80g，平均高度為30cm。通過d'aoust等2008(plantbiotechnologyjournal6：930-940)描述的方法，用如下所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染(電穿孔)農(nóng)桿菌菌株agl1。在補充有10mm2-(n-嗎啉代)乙磺酸(mes)、20μm乙酰丁香酮、50μg/ml卡那霉素和25μg/ml羧芐青霉素的yeb培養(yǎng)基(ph5.6)中培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的農(nóng)桿菌，至od600為0.6至1.6。在使用前離心農(nóng)桿菌懸液并用滲入介質(zhì)(10mmmgcl2和10mmmesph5.6)重懸。通過d'aoust等(同上)描述的農(nóng)桿菌滲入法處理植株。簡言之，對于真空滲入，離心根癌農(nóng)桿菌懸液，在滲入介質(zhì)中重懸，在4℃儲存過夜。在滲入當(dāng)天，用2.5倍培養(yǎng)體積稀釋培養(yǎng)批次并在使用前溫?zé)帷⒄麄€本塞姆氏煙草植株倒置在20-40托真空下的氣密不銹鋼罐的細菌懸液中2分鐘。除另外指出，所有的滲入均為與r472轉(zhuǎn)化細菌(agl1/r472株)以1∶1的比例共同滲入。真空滲入后，將植株被送回溫室孵育4-6天直到收集。葉的取樣和總蛋白質(zhì)提取(機械勻漿)孵育4、5、6、7和8天后，收集植株的地上部分并立即使用。在3倍體積的含有1％tritonx-100和0.004％焦亞硫酸鈉的冷50mmtrisph8.0，0.15mnacl中通過勻漿植物組織提取總可溶性蛋白。用polytrontm通過杵臼研磨，或在1體積冷50mmtrisph8，0.15mnacl中用comitroltm對植物組織進行機械勻漿。comitroltm使用的緩沖液也包含0.04％焦亞硫酸鈉。勻漿后，在4℃下以5,000g離心地上植物材料的漿液5分鐘，保留粗提物(上清液)進行分析。用牛血清白蛋白作為參照標(biāo)準(zhǔn)，通過bradford測定(bio-rad，hercules，ca)檢測澄清粗提物的總蛋白質(zhì)含量。通過細胞壁消化提取vlp從本塞姆氏煙草植株收集葉組織并切成～1cm2的片。在室溫(rt)下將葉片浸沒于500mm甘露糖醇中30分鐘。然后去除甘露糖醇溶液并換成酶混合物(原生質(zhì)體化溶液(500mm甘露糖醇，10mmcacl2和5mmmes/koh(ph5.6)中的來自綠色木霉的纖維素酶混合物(onozukar-10；3％v/v)和來自根霉屬的果膠酶混合物(macerozymetm；0.75％v/v；均購自yakultpharmaceuticals))。使用的比例為每100ml溶液20g葉片。將該制備物均勻分散到淺容器(～11×18cm)中并用旋轉(zhuǎn)搖床以40rpm和26℃孵育16小時?；蛘?，vlp提取可按如下方法進行：用agl1/#685按照實施例1所述對植株進行農(nóng)桿菌滲入。在滲入后第6天從本塞姆氏煙草植株收集葉并切成～1cm2的片。以1∶2.5(w/v)的新鮮生物質(zhì)∶消化緩沖液的比例，將multifect果膠酶fe、multifectcxcg和multifectcxb(genencor)(每個1.0％(v/v))添加到600mm甘露糖醇，75mm檸檬酸鹽，0.04％亞硫酸氫鈉緩沖液(ph6.0)中。在室溫下用軌道搖床消化生物質(zhì)15小時。孵育后，通過過濾(250或400μm目的尼龍濾器)去除葉碎片。如下收集懸液中的原生質(zhì)體：以200×g(15分鐘)離心，然后以5000×g(15分鐘)離心上清液以進一步澄清上清液?；蛘撸蛇M行5000×g、15分鐘的單個離心步驟。然后以70,000×g離心70ml上清液30分鐘。所得沉淀用1.7mlpbs重懸并立即分析或凍存。蛋白質(zhì)分析h5的凝血測定基于nayak和reichl(2004)描述的方法。簡言之，在含有100μlpbs的v形底96孔微滴定板中對測試樣品(100μl)進行系列兩倍稀釋，每孔留下100μl稀釋的樣品。向每孔加入100μl0.25％火雞紅細胞懸液(biolinkinc.，syracuse，ny)，在室溫孵育板2小時。將顯示完全凝血的最高稀釋度的倒數(shù)記錄為凝血活性。平行地，用pbs稀釋重組ha5標(biāo)準(zhǔn)(a/越南/1203/2004h5n1)(proteinsciencecorporation，meriden，ct)，并在每個板中作為對照。elisa用破碎(用1％tritonx-100處理，隨后在tissuelysertm(qiagen)機械攪拌1分鐘)的純化病毒樣顆粒制備ha5標(biāo)準(zhǔn)。在4℃用50mm碳酸鹽-碳酸氫鹽包被緩沖液(ph9.6)中的10μg/ml捕獲抗體(immunetechnologycorporation，#it-003-005i)包被u形底96孔微滴定板16-18小時。用含有0.1％tween-20的0.01mpbs(磷酸鹽緩沖鹽水)(ph7.4)進行所有洗滌。孵育后，洗滌微滴定板三次并在37℃下用pbs中的1％酪蛋白封閉1小時。封閉步驟后，洗滌板三次。用模擬提取物(制備自用單獨的agl1/r472滲入的葉組織)稀釋ha5標(biāo)準(zhǔn)以獲得500至50ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在加入微孔板之前用1％tritonx-100處理待定量的樣品。在37℃下再孵育板1小時。洗滌后，加入1∶1000稀釋的針對ha5(cber/fda)的綿羊多克隆抗體，在37℃下孵育板1小時。洗滌后，加入1∶1000稀釋的辣根過氧化物酶綴合的兔抗綿羊抗體，在37℃下孵育板1小時。最后一次洗滌后，在室溫下用surebluetmb過氧化物酶底物(kpl)孵育板20分鐘。加入1nhcl終止反應(yīng)，用multiskanascent讀板器(thermoscientific)測量a450值。實施例1：酶法提取植物組織得到相對活性提高的高產(chǎn)量ha。將用本發(fā)明酶提取法獲得之ha的量和相對活性與普通機械提取法獲得之ha的數(shù)量和相對活性進行比較。用agl1/685滲入本塞姆氏煙草植株，5-6天的孵育期后收集葉。如下制備葉勻漿：用polytron勻漿器將2g葉勻漿；用杵臼研磨4g葉；以及用comitroltm處理機(urschellaboratories)在提取緩沖液(50mmtris，150mmnaclph8.0，比例1∶1w/v)中對25kg葉進行勻漿。酶提取如下進行：用上述macerozyme果膠酶和onozukar-10纖維素酶消化20g收集的葉。消化后，通過過濾(250μm目的尼龍濾器)去除葉碎片。通過以下去除懸液中的原生質(zhì)體：200×g(15分鐘)離心，然后通過5000×g(15分鐘)離心進一步澄清上清液。每個這些植物提取物中的ha的相對活性和量見表3。與用其他技術(shù)相比，酶消化細胞壁釋放的ha的量顯著較多。表3：通過不同的機械或酶法產(chǎn)生的植物提取物中回收的ha-vlp。對于基于活性的比較和elisa比較，根據(jù)新鮮生物質(zhì)液體提取物的相對體積對數(shù)據(jù)進行歸一化。通過comitrol提取獲得的蛋白質(zhì)設(shè)定為100％，其他方法與該值進行比較。提取方法相對活性量＊comitroltm提取物100％100％polytron提取物50％150％臼提取物100％220％消化提取物440％570％＊通過elisa分析對量進行評測實施例2：用酶消化植物組織所釋放的ha組成vlp用差速離心和體積排阻層析(sec)的組合證實通過本文所述的酶提取法獲得的ha組成vlp。如實施例1中所述用agl1/685對本塞姆氏煙草植株進行農(nóng)桿菌滲入。如實施例1中所述滲入6天后從植株收集葉并切成～1cm2的片，然后消化、粗濾并離心。然后以70,000×g離心澄清樣品以分離vlp。在上樣到sec柱之前，將包含vlp的離心沉淀小心重懸于1/50體積的磷酸鹽緩沖鹽水(pbs；0.1m磷酸鈉，0.15mnaclph7.2)中。用平衡/洗脫緩沖液(50mmtris，150mmnacl，ph8)準(zhǔn)備32mlsephacryltms-500高分辨率珠(s-500hr：gehealthcare，uppsala，sweden，cat.no.17-0613-10)的sec柱。將1.5mlvlp樣品上樣到平衡好的柱并用45ml平衡/洗脫緩沖液洗脫來進行sec層析。洗脫液收集于1.7ml的級分中，通過將10μl洗脫級分與200μl稀釋的bio-rad蛋白染色劑(bio-rad，hercules，ca)混合來評估每個級分的蛋白含量。每次分離之前均用bluedextran2000(gehealthcarebio-sciencecorp.，piscataway，nj，usa)進行校準(zhǔn)。對于每次分離都比較bluedextran2000和宿主蛋白質(zhì)兩者的洗脫譜，以確保分離的一致性。sec洗脫級分的蛋白質(zhì)分析以牛血清白蛋白作為參照標(biāo)準(zhǔn)，用bradford測定(bio-rad，hercules，ca)檢測澄清粗提物的總蛋白含量。用丙酮沉淀存在于sec洗脫級分中的蛋白質(zhì)(bollag等，1996)，用0.25體積或0.05體積的變性上樣緩沖液(0.1mtrisph6.8，0.05％溴酚藍，12.5％甘油，4％sds和5％β-巰基乙醇)重懸以分別進行sds-page分析或免疫印跡分析。在還原條件下通過sds-page進行分離，用考馬斯亮藍r-250對蛋白染色。h5的凝血測定基于nayak和reichl(2004)描述的方法。簡言之，在含有100μlpbs的v形底96孔微滴定板中對測試樣品(100μl)進行系列雙倍稀釋，每孔留下100μl稀釋的樣品。向每孔加入100μl0.25％火雞紅細胞懸液(biolinkinc.，syracuse，ny)，在室溫孵育板2小時。將顯示完全凝血的最高稀釋度的倒數(shù)記錄為凝血活性。平行地，用pbs稀釋重組h5標(biāo)準(zhǔn)(a/越南/1203/2004h5n1)(proteinsciencecorporation，meriden，ct)，并在每個板中作為對照。圖3a顯示凝血活性集中在對應(yīng)于柱空隙體積的級分，證明凝血活性來源于高分子量結(jié)構(gòu)組織。sds-page分析(圖3b)表明那些相同的空隙體積級分(級分7-10)也存在最高的ha含量，其中對應(yīng)于ha0單體的條帶在約75kda處可檢測到。實施例3：植物組織的酶消化釋放具有更少污染物的ha-vlp如實施例1中所述以agl1/685對本塞姆氏煙草植株進行農(nóng)桿菌滲入。如實施例1中所述在滲入后第6天收集葉并切成～1cm2的片，然后消化、粗濾并離心。葉的受控酶消化去除(至少部分地)細胞壁，從而允許存在于細胞壁和質(zhì)膜間的間隙中的蛋白質(zhì)和成分釋放入提取基質(zhì)。由于大多數(shù)細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和成分仍未被破壞并包含在幾乎完整的原生質(zhì)體中，初始的離心步驟可以去除它們，從而提供包含細胞壁降解酶以及細胞外植物蛋白質(zhì)和成分(質(zhì)外體級分)的圖4所示的所得溶液。圖4顯示了上述的葉組織受控酶消化后所獲得的溶液的sds-page分析，其中泳道1顯示所用的酶混合物，泳道2顯示酶消化后所得的溶液。泳道3提供從comitroltm得到的粗提物的蛋白質(zhì)含量以供比較。生物質(zhì)：緩沖液的比例對于泳道2的提取物是1∶5(w/v)，對于泳道3是1∶1(w/v)。因此泳道2和3各自包含源自等量起始原料的蛋白。對于大約相同的緩沖液∶植物比例，機械植物提取物包含濃度約3.5-4mg/ml的蛋白質(zhì)，而根據(jù)本發(fā)明方法獲得的酶植物提取物的蛋白質(zhì)濃度約為1mg/ml。發(fā)現(xiàn)泳道3中存在的主要污染物是rubisco(核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶加氧酶)，它由兩種蛋白亞基形成：大鏈(l，約55kda)和小鏈(s，約13kda)。通?？偣舶藯l大鏈二聚體和八條小鏈彼此之間組裝成較大復(fù)合物rubisco540kda。盡管在源自機械提取法的植物提取物中發(fā)現(xiàn)大量的該植物蛋白污染物(如圖4箭頭所示)，它幾乎在本文所述酶消化法所獲得的植物提取物中不存在。因此，本方法允許在處理的早期去除該主要的植物蛋白污染物以及其他污染物。實施例4：植物組織的酶消化在可以直接用陽離子交換樹脂捕獲ha-vlp的條件下釋放ha-vlp。按照實施例1中所述用agl1/685對本塞姆氏煙草植株進行農(nóng)桿菌滲入。在滲入后第6天收集葉，切成～1cm2的片，用軌道搖床室溫消化15小時。消化緩沖液包含1.0％(v/v)multifect果膠酶fe，1.0％(v/v)multifectcxcg或和1.0％(v/v)multifectcxb(均購自genencor)，每個均在600mm甘露糖醇，75mm檸檬酸鹽，0.04％亞硫酸氫鈉緩沖液(ph6.0)中，使用1∶2.5(w/v)的生物質(zhì)∶消化緩沖液比例。消化后，將質(zhì)外體級分用400μm尼龍濾器過濾，以去除粗的未消化的植物組織(＜5％的起始生物質(zhì))。然后在室溫下以5000×g離心經(jīng)過濾提取物15分鐘，以去除原生質(zhì)體和細胞內(nèi)污染物(蛋白質(zhì)、dna、膜、囊泡、色素等)。然后在進行層析之前，用0.65μm玻璃纖維濾器(sartopore2/sartoriusstedim)和0.45/0.2μm濾器深層過濾上清液(以澄清)。將澄清的質(zhì)外體級分上樣到用平衡/洗脫緩沖液(50mmnapo4，100mmnacl，0.005％tween80ph6.0)平衡好的陽離子交換柱(poroshsappliedbiosystems)。uv回歸到0后，用包含升高濃度的nacl(500mm)的平衡/洗脫緩沖液分步洗脫提取物。必要時，使用裝配有10kdamwco的amicontm裝置將層析級分濃縮10倍。蛋白分析按照之前實施例所述進行。在上述條件下，大多數(shù)酶和植物蛋白質(zhì)不與陽離子交換樹脂結(jié)合而ha-vlp結(jié)合，從而在洗脫級分中提供ha-vlp的可觀富集(圖6)。此外，如圖6所示，在ph在7以下時泳道4和5的纖維素酶和果膠酶不與陽離子交換柱結(jié)合。因此，根據(jù)ha凝血活性，ha-vlp的回收在上樣至陽離子交換柱前為92％，在洗脫級分中為66％。在陽離子交換樹脂的洗脫級分中檢測到純化因子為194。實施例5：向消化緩沖液中添加nacl按照實施例1所述用攜帶表達目的血凝素的構(gòu)建體(h1/calwt，b/flo，h5/indo或h1/calx179a)的農(nóng)桿菌株agl1對本塞姆氏煙草植株進行農(nóng)桿菌滲入。在滲入后第6天收集葉，切成～1cm2的片并按照實施例4所述消化(除非以下特別注明)。按照實施例4所述進行過濾、離心和澄清。向消化緩沖液中添加nacl以評估其對ha-vlp回收率的潛在作用。所猜測的優(yōu)點是可能能夠阻止ha非特異性地與澄清過程中去除的植物細胞或懸液顆粒相關(guān)聯(lián)，以及可對獲得和/或維持和/或提高ha-vlp的膠體穩(wěn)定性有潛在作用。向消化緩沖液中加入500mmnacl使得在通過離心去除原生質(zhì)體和細胞碎片之后，每克生物質(zhì)的ha-vlp回收得率提高。但是，該提高只見于h1/calwt和b/flo株，而通過這種方法h5的回收得率并沒有顯著提高(表4)。表4：在消化步驟中添加nacl對ha-vlp回收得率的作用(通過凝血活性單位測量，dil：稀釋度的倒數(shù))1有nacl時的得率(dil/g)除以無nacl時的得率(dil/g)對h1/calwt和h1/calx-179a兩毒株，在消化過程中添加500mmnacl進一步使消化過程中ha-vlp釋放增加，這繼而導(dǎo)致澄清后的回收得率提高(表5)，但對h5/indo株不是如此。表5：在澄清步驟之后向消化步驟添加nacl對ha-vlp回收得率的作用(通過凝血活性單位測量)1回收率表示為深層過濾后獲得的凝血活性占離心消化提取物的活性的百分比。在酶消化過程中添加和不添加nacl時，用納米顆粒追蹤分析法(nta)對h5/indo和h1/calwt的ha-vlp的結(jié)合狀態(tài)進行了分析(分別見圖7a和7b)。在無nacl時進行消化對于h5觀察到顆粒的單分散制備物，而h1/cal制備物顯示顆粒類型更大的陣列。如圖7c中良好的單分散顆粒分布所示，向消化緩沖液中添加nacl降低h1/calha-vlp的自結(jié)合。通過向消化緩沖液中添加500mmnacl，150nm的h1/calwt-vlp顆粒數(shù)增加(約5倍)。實施例6：色素的控制釋放按照實施例1所述用攜帶表達目的血凝素的構(gòu)建體(h5/indo)的農(nóng)桿菌株agl1對本塞姆氏煙草植株進行農(nóng)桿菌滲入。在滲入后第6天收集葉，切成～1cm2的片，并按照實施例4所述進行消化，其中向消化緩沖液中添加500mmnacl或500mmnacl和25mmedta。按照實施例4所述進行過濾、離心和澄清。酶消化步驟中釋放的綠色成分使純化的vlp制備物呈淺綠色。因此研究并調(diào)整細胞壁消化溶液的成分以獲得綠色減少的vlp純化制備物，從而獲得增加的純度。不希望被理論所約束，由于ca2+在將細胞壁的中間片層成分保持在一起中起關(guān)鍵作用，并且考慮到植物細胞壁通常具有高濃度的ca2+這一事實，添加ca2+-螯合劑edta可促進細胞壁的酶促解聚，從而保留完整的細胞內(nèi)細胞器(例如葉綠體)，并防止綠色素成分的釋放。見表6，如通過測量制備物吸光度(od672nm-od650nm)差異所評估的，向消化緩沖液中添加25mmedta使純化的h5-vlp制備物的綠色減少。當(dāng)綠色成分大量釋放或未被適當(dāng)去除時，vlp制備物表現(xiàn)出的δod＞0.040。表6：添加25mmedta至消化緩沖液對h5-vlp產(chǎn)物中的綠色的影響。實施例7：替代性的消化緩沖液成分按照實施例1所述用攜帶表達目的血凝素的構(gòu)建體(h5/indo)的農(nóng)桿菌株agl1對本塞姆氏煙草植株進行農(nóng)桿菌滲入。在滲入后第6天收集葉，切成～1cm2的片并按照實施例4所述進行消化，其中將消化緩沖液改變?yōu)榘?％、0.25％、0.5％、0.75％或1％v/vmultifect果膠酶fe、multifectcx-cg纖維素酶和multifectcxb纖維素酶(如表7-9所示)。按照實施例4所述進行過濾、離心和澄清。如下表7和8所示，證實果膠酶在消化緩沖液中不是必需的。在存在或不存在果膠酶的情況下，可以提取到相似水平的h5/indo或h1/calwtvlp。此外，發(fā)現(xiàn)與之前實施例相比，降低纖維素酶濃度與對提取質(zhì)量沒有顯著的影響(表9)。表7：消化本塞姆氏煙草葉后h5/indovlp的釋放。所有的條件均重復(fù)測試。(ha-vlp濃度通過凝血活性測量，dil：稀釋度的倒數(shù))＊multifectcxgc表8：消化本塞姆氏煙草葉后h1/calwtvlp的釋放。所有的條件均重復(fù)測試。(ha-vlp濃度通過凝血活性測量，dil：稀釋度的倒數(shù))＊multifectcxgc和multifectcxb每個1％表9：消化本塞姆氏煙草葉后h1/calwtvlp的釋放。所有的條件均進行重復(fù)測試。(ha-vlp濃度通過凝血活性檢測，dil：稀釋度的倒數(shù))*multifectcxgc實施例8：接近中性ph條件下的酶消化控制消化過程中的ph對于某些vlp的提取可以是關(guān)鍵的?？紤]到消化步驟中發(fā)生的細胞壁的解聚可以釋放酸性糖，這在適當(dāng)緩沖液溶液的存在下會使溶液酸化(即ph6至5)，并且已證實某些vlp(如包含h3/bris和b/floha的那些)對輕度酸性環(huán)境有很強的敏感性，所以研究了這種可能的酸化對vlp產(chǎn)率的影響。按照實施例1所述用攜帶表達目的血凝素的構(gòu)建體(b/flo、h5/indo、h3/bris)的農(nóng)桿菌株agl1對本塞姆氏煙草植株進行農(nóng)桿菌滲入。在滲入后第6天收集葉，切成～1cm2的片并按照實施例4所述進行消化，其中將消化條件改變?yōu)榘?00mmnacl；25或50mmedta；0.03或0.04％硫酸氫鈉；0、100、200或600mm甘露糖醇，75、125或150mm檸檬酸鹽；和/或75mmnapo4；消化緩沖液ph的調(diào)整如表10-14所示。按照實施例4所述進行過濾、離心和澄清。測試不同的消化緩沖液成分是否在酶消化結(jié)束時達到約5.5的ph，包括增加的檸檬酸鹽濃度(緩沖能力在ph3.0至5.4之間)和添加磷酸鈉(緩沖能力在ph6.0以上)。表10顯示在消化后ph接近ph6.0時，來自b株的vlp能夠被更有效地提取。表10：消化緩沖液成分對b/flovlp提取率的影響。1所有緩沖液包含600mm甘露糖醇，焦亞硫酸鈉0.04％然后，檢測了為使最終ph值接近ph6.0而在更高ph起始消化的影響。如表11所示，在這種近中性條件下消化植物細胞壁是可以的，并未減少h5/indovlp的提取率。表11：消化緩沖液起始ph對h5/indovlp提取率的影響。1所有消化緩沖液包含600mm甘露糖醇，焦亞硫酸鈉0.04％，125mm檸檬酸鹽+75mmnapo4+500mmnacl+25mmedta還表明調(diào)整消化溶液的其他成分對vlp的提取率沒有不利影響。表12顯示了可以對消化溶液進行調(diào)整以提高b/flovlp的提取率同時獲得5.4-5.7的消化后ph。這種調(diào)整包括提高檸檬酸鹽的濃度和添加po4緩沖液。發(fā)現(xiàn)提高edta濃度通常導(dǎo)致更加酸化的提取物和更低的vlp提取率。表12：不同消化緩沖液成分對b/flovlp提取率的影響。1所有緩沖液包含500mmnacl，焦亞硫酸鈉0.04％。進一步調(diào)整緩沖液成分以提高h3/布里斯班vlp的提取率(表13)表13：消化溶液中甘露糖醇和亞硫酸鈉濃度對h3/brisvlp提取率的影響。1所有緩沖液包含125mm檸檬酸鹽，75mmnapo4，500mmnacl，如表12和13所示，甘露糖醇濃度可降至200mm而不顯著影響vlp提取率。進一步降低甘露糖醇濃度到100mm甚至完全不將甘露糖醇添加至消化溶液不會顯著影響獲得的ha-vlp水平(表14)。表14：甘露糖醇濃度不同的緩沖液消化生物質(zhì)所釋放的h5/indovlp1所有緩沖液包含75mm檸檬酸鹽ph6.0+焦亞硫酸鈉0.04％。2在不含甘露糖醇(實驗1)和含100mm甘露糖醇(實驗2)的情況下進行2個相比于600mm甘露糖醇的實驗以比較vlp的提取率。實施例9：酶消化對多種ha-vlp的適用性本文所述的植物生物質(zhì)酶消化法有可能被應(yīng)用到多種ha-vlp的提取中。除了提取之前實施例所示的包含h5/indo、h1/calwtvlp、h3/bris和b/flo的ha-vlp之外，本文所述方法還適用于季節(jié)性的h1/bris和h1/nc的ha-vlp的提取，如表15所示。表15：消化農(nóng)桿菌滲入的本塞姆氏煙草葉所釋放的季節(jié)性h1/bris和h1/ncvlp。(ha濃度通過凝血活性測量，dil：稀釋度的倒數(shù))實施例10：抗體制備，表達和分析c2b8表達盒的組裝(構(gòu)建體號595)c2b8是嵌合(小鼠/人)單克隆抗體，其針對表達于非霍奇金淋巴瘤(nhl)上的b細胞特異性抗原cd20。c2b8介導(dǎo)補體和抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒性，并且在體外對惡性b細胞系有直接抗增殖作用(nselenko等，leukemia，october2001年，15(10)；1619-1626)。合成包含84bp苜蓿質(zhì)體藍素啟動子、完整c2b8輕鏈編碼序列和完整苜蓿質(zhì)體藍素終止子的dna片段(lc片段)。lc片段的側(cè)翼為draiii限制性位點(位于質(zhì)體藍素啟動子)和質(zhì)體藍素終止子下游的ecori位點。lc片段的序列示于圖9(seqidno：15)。用draiii和ecori消化包含lc片段的質(zhì)粒并克隆到預(yù)先用相同酶消化的構(gòu)建體號660(d’aoust等，plantbiotechnol.j.2008年，6：930-940)。所得質(zhì)粒命名為構(gòu)建體號590。合成包含84bp苜蓿質(zhì)體藍素啟動子，完整c2b8重鏈編碼序列和完整苜蓿質(zhì)體藍素終止子的第二dna片段(hc片段)。hc片段的側(cè)翼為draiii限制性位點(位于質(zhì)體藍素啟動子)和質(zhì)體藍素終止子下游的ecori位點。hc片段的序列示于圖10中(seqidno：16)。用draiii和ecori消化包含hc片段的質(zhì)粒并克隆到預(yù)先用相同酶消化的構(gòu)建體號660(d’aoust等，plantbiotechnol.j.2008年，6：930-940)。所得質(zhì)粒命名為構(gòu)建體號592。包含592的根瘤農(nóng)桿菌株被稱為“agl1/592”。包含表達c2b8的雙表達盒的質(zhì)粒(構(gòu)建體號595)按照如下所述組裝。用ecori消化構(gòu)建體號592，用klenow片段處理以產(chǎn)生平末端并用sbfi消化。將所得片段(包含側(cè)翼為sbfi位點和平末端的用于表達c2b8重鏈的完整表達盒)插入預(yù)先用sbfi和smai消化的構(gòu)建體號590。圖11a顯示用于在植物中表達c2b8的構(gòu)建體號595的示意圖。p19表達盒的組裝(構(gòu)建體號r472)編碼p19蛋白的構(gòu)建體r472如上所述(“沉默抑制子”；參見圖11b)植物生物質(zhì)，細菌接種，農(nóng)桿菌滲入和收集如上所述(“植物生物質(zhì)，細菌接種，農(nóng)桿菌滲入和收集”)于溫室中在16/8的光周期和白天25℃/夜晚20℃的溫度方案下培育本塞姆氏煙草植株。播種后第三周，挑選出單個苗，移植到花盆里并在相同環(huán)境條件下的溫室中再培育三周。在補充有10mm2-[n-嗎啉代]乙磺酸(mes)、50μg/ml卡那霉素和25μg/ml羧芐青霉素(ph5.6)的bblselectapslb培養(yǎng)液中培養(yǎng)攜帶構(gòu)建體號595或r472的農(nóng)桿菌，直到達到od600＞2.0。在使用前離心農(nóng)桿菌懸液并用滲入基質(zhì)(10mmmgcl2和10mmmesph5.6)重懸，于4℃過夜儲存。在滲入的當(dāng)天，用6.7倍培養(yǎng)體積稀釋培養(yǎng)批次并在使用前溫?zé)?。將整個本塞姆氏煙草植株倒置在20-40托真空下的氣密不銹鋼罐中的細菌懸液中1分鐘。滲入后，植株被送回溫室孵育5天直到收集。以1∶1的比例共同滲入agl1/595和agl1/r472株來進行滲入。葉的取樣和總蛋白質(zhì)提取(機械提取)孵育后，收集植株的地上部分并立即使用。在國產(chǎn)攪拌器中用1.5體積的冷20mmnapo4ph6.0，0.15mnacl和2mm焦亞硫酸鈉勻漿植物組織3分鐘來提取總可溶性蛋白。勻漿后，用miracloth過濾地面植物材料的漿液以去除大的不溶性碎片。通過添加1mhcl將提取物的ph調(diào)整為4.8，不溶性物質(zhì)通過以18000g離心15分鐘(4℃)去除。收集上清液并用tris堿2m調(diào)整為ph8.0。通過4℃下以18000g離心15分鐘去除不溶性物質(zhì)，并收集粗取物(上清液)。用牛血清白蛋白作為參照標(biāo)準(zhǔn)，通過bradford測定(bio-rad，hercules，ca)測量澄清粗提物的總蛋白質(zhì)含量。通過細胞壁消化提取蛋白質(zhì)收集本塞姆氏煙草植株的葉組織好并切成～1cm2的片。將葉片置于2.425體積的消化溶液(75mm檸檬酸鹽ph6.9，600mm甘露糖醇，1％multifect果膠酶fe，1％multifectcxg，1％multifectb)中。在淺容器中均勻分散該制備物，用軌道搖床以120rpm，18℃孵育16小時。孵育后，通過尼龍濾器(250μm目)過濾去除葉碎片。5000g離心提取物15分鐘(22℃)，收集上清液并用0.65μm的玻璃纖維過濾。用0.5mtris堿將提取物ph調(diào)節(jié)至6.0，用pes膜0.45/0.22μm過濾。硫酸銨沉淀和抗體純化向蛋白質(zhì)提取物緩慢加入硫酸銨以達到45％飽和。將提取物冰上放置60分鐘，18000g離心20分鐘(4℃)。棄去上清液，凍存(-80℃)沉淀以備使用。融化冰凍的蛋白質(zhì)沉淀并重懸于1/10體積(與沉淀前的體積相比)的蛋白重懸溶液(50mmtrisph7.4，150mmnacl)中。以12000g離心蛋白質(zhì)溶液20分鐘(4℃)以去除不溶性物質(zhì)。將蛋白質(zhì)溶液上樣到mabselectsure樹脂(gehealthcare，baied'urfé，canada)。用10cv的50mmtrisph7.4，150mmnacl洗滌柱，用6cv的100mm檸檬酸鈉ph3.0洗脫抗體。洗脫體積收集于1cv級分的管(含有1/10cv的2mtrisph7.4，nacl150mm)中。根據(jù)蛋白質(zhì)含量(通過bradford測量)選擇洗脫級分，合并所選級分并在分析之前凍存(-80℃)。蛋白質(zhì)定量和sds-page分析以牛血清白蛋白(對粗蛋白提取物)或市售rituximab(hoffmann-laroche，mississauga，canada)(對純化的抗體)作為參照標(biāo)準(zhǔn)，用bradford測定(bio-rad，hercules，ca)測量總蛋白質(zhì)含量。按照laemmli(nature1970年，227：680-685)描述的方法進行考馬斯染色的sds-page。通過elisa定量c2b8在4℃用50mm碳酸鹽緩沖液(ph9.6)中的2.0μg/ml小鼠抗人單克隆igg抗體(abeam，ab9243)包被多孔板(immulon2hb，thermolabsystem，franklin，ma)16-18小時。然后在37℃用含1％酪蛋白的磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)(piercebiotechnology，rockford，il)孵育多孔板1小時以封閉。用稀釋的rituximab(hoffmann-laroche，mississauga，canada)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。進行免疫印跡時，在由用模擬接種物(僅agl1/r472)滲入并孵育的植物組織獲得的植物提取物中進行所有的稀釋物(對照和樣品)，以消除基質(zhì)作用。在37℃用蛋白質(zhì)樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線稀釋物孵育板1小時。用pbs中的1％tween-20(pbs-t)洗滌三次后，于37℃用過氧化物酶綴合的dunkey抗人igg抗體(用封閉溶液1/4000稀釋)(jacksonimmunoresearch709-035-149)孵育板1小時。重復(fù)用pbs-t洗滌，用3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(tmb)sureblue過氧化物酶底物(kpl，gaithersburg，md)孵育板。通過添加1nhcl停止反應(yīng)，在450nm測量吸光度。每個樣品一式三份測定，濃度加入標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性部分。n-聚糖分析用15％sds-page分離包含c2b8(rituxantm；50μg)的樣品。用考馬斯藍顯示重鏈和輕鏈，切取相應(yīng)于重鏈的蛋白條帶并切成小片段。用600μl0.1mnh4hco3/ch3cn(1/1)溶液洗滌片段3次，每次15分鐘并干燥。于56℃通過將膠片段在600μl0.1mdtt的0.1mnh4hco3溶液中孵育45分鐘來還原二硫鍵。通過在室溫下添加600μl碘乙酰胺55mm的0.1mnh4hco3溶液進行烷基化30分鐘。棄去上清液，再用nh4hco30.1m/ch3cn(1/1)洗滌聚丙烯酰胺片段一次。然后于37℃用600μl0.05mnh4hco3中的7.5μg胰蛋白酶(promega)消化蛋白16小時。加入200μlch3cn并且收集上清液。然后用200μl0.1mnh4hco3洗滌膠片段，然后再用200μlch3cn洗滌，最終用200μl甲酸5％洗滌。合并所有上清液并凍干。用sep-packc18cartridge層析從肽中分離糖肽。用水中的10％ch3cn特異性洗脫糖肽，然后用配備有337nm氮激光的voyagerde-promaldi-tof裝置(appliedbiosystems，usa)進行maldi-tof-ms分析。用二氫苯甲酸(sigma-aldrich)作為基質(zhì)，以反射器延遲提取模式(reflectordelayedextractionmode)進行質(zhì)譜。實施例11：c2b8抗體提取產(chǎn)出的比較對c2b8抗體的酶消化提取和機械提取進行了比較。用agl1/595和agl1/r472對本塞姆氏煙草植株進行農(nóng)桿菌滲入。孵育6天后，收集葉并通過酶消化或機械提取提取蛋白質(zhì)。提取兩次，比較所得提取物的體積、蛋白質(zhì)濃度和抗體(c2b8)含量。結(jié)果示于表16。表16：機械破碎(攪拌器提取)和酶消化細胞壁的提取產(chǎn)出的比較。從700g生物質(zhì)中，機械提取產(chǎn)生平均1440ml的蛋白質(zhì)提取物而消化產(chǎn)生2285ml的蛋白質(zhì)提取物。消化提取物的c2b8抗體百分比(平均值為所提取蛋白質(zhì)的479％)比攪拌產(chǎn)生的提取物(平均值為所提取蛋白的3.49％)高。總之，提取物的更高的提取體積和更高的抗體濃度使得消化的提取產(chǎn)出(240.75mgc2b8/kg鮮重)比機械提取(175.95mgc2b8/kg鮮重)高37％。實施例13：純化c2b8抗體的比較(蛋白質(zhì)含量)按照實施例10所述用蛋白a的親和層析來純化來自提取物的c2b8抗體。根據(jù)蛋白質(zhì)含量比較了機械提取或消化所獲得的提取物中純化的產(chǎn)物。從每個提取批次(lot)純化的抗體的電泳譜顯示于圖12。結(jié)果顯示攪拌提取和細胞壁消化的純化產(chǎn)物的圖譜類似。實施例14：純化c2b8抗體的比較(n-糖基化)蛋白的n-糖基化包括在帶有n-x-s/t序列的分泌蛋白的天冬酰胺上添加復(fù)合聚糖結(jié)構(gòu)，其中n是天冬酰胺，x是除脯氨酸之外的任意氨基酸，s/t是絲氨酸或蘇氨酸。在蛋白質(zhì)翻譯早期在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中添加聚糖前體，在它們通過分泌途徑轉(zhuǎn)運期間，n-聚糖經(jīng)歷成熟過程。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(er)中的高甘露糖型n-聚糖開始，n-聚糖在植物中成熟包括添加和去除葡萄糖殘基、去除遠端位置的甘露糖并添加n-乙酰葡萄糖胺、木糖、巖藻糖和半乳糖殘基。n-聚糖在植物中成熟由gomord等描述于post-translationalmodificationoftherapeuticproteinsinplants(curr.opin.plantbiol.2004年，7：171-181)。n-糖基化途徑中的酶位于分泌途徑的每個部分(即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、順式高爾基體、中間高爾基體和反式高爾基體)的確切位置。因此，蛋白的n-糖基化模式根據(jù)提取時其所處位置而異。我們先前觀察到用農(nóng)桿菌滲入的本塞姆氏煙草所生產(chǎn)的一部分抗體盡管被靶向質(zhì)外體，但仍攜帶未成熟的高甘露糖型n-聚糖(vézina等，plantbiotechnol.j.20097：442-455)。其他人也報道了類似的發(fā)現(xiàn)(sriraman等，plantbiotechnol.j.2004，2，279-287)。在這兩個情況中，將一部分抗體上存在的未成熟的n-聚糖被解釋為由提取時抗體位于分泌途徑早期部分引起。隨后研究了通過細胞壁消化提取分泌的糖蛋白是否優(yōu)先提取攜帶復(fù)合n-聚糖的重組蛋白質(zhì)。預(yù)期分泌到質(zhì)外體的抗體和其他糖蛋白攜帶完成其成熟的n-聚糖。成熟n-聚糖最常攜帶末端n-乙酰葡糖胺或半乳糖殘基，也被稱為復(fù)合n-聚糖。相反，大部分發(fā)現(xiàn)于蛋白分泌通路當(dāng)中(enroute)的未成熟的n-聚糖包含末端甘露糖殘基。已將c2b8(rituxantm)上的高甘露糖含量n-聚糖與血流中半衰期縮短相關(guān)聯(lián)(kanda等，glycobiology2006年，17：104-118)。在這種情況下，期望有能優(yōu)先從植物中提取攜帶復(fù)合n-聚糖的質(zhì)外體糖蛋白的提取方法。按照實施例10所述進行純化的c2b8抗體n-糖基化的比較性分析。結(jié)果顯示消化的生物質(zhì)純化的抗體攜帶顯著更低比例的寡聚甘露糖苷n-聚糖(圖13a)，由此推出其具有顯著更高比例的復(fù)合n-聚糖(圖13b)。細胞壁消化提取還可應(yīng)用于共表達糖蛋白和一種或更多種改變n-糖基化譜的酶的植物(描述于wo20008/151440(modifyingglycoproteinproductioninplants；通過引用并入本文)，以有利于回收攜帶改變的成熟n-聚糖的糖蛋白。例如，成熟n-聚糖可含有減少的木糖和巖藻糖殘基，或不含有上述殘基。改變n-糖基化的方法可以涉及將目的蛋白質(zhì)與編碼β-1.4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(galt；wo20008/151440的seqidno：14)(例如但不限于哺乳動物galt，或人galt，但也可使用其他來源的galt)的核苷酸序列共表達。galt的催化結(jié)構(gòu)域(例如wo20008/151440所述的seqidno：14的370-1194位核苷酸)還可以與n-乙酰葡萄糖胺基轉(zhuǎn)移酶的cts結(jié)構(gòu)域(gnt1；例如包含wo20008/151440所述的seqidno：17的34-87位核苷酸)融合，以產(chǎn)生gnt1-galt雜合酶。該雜合酶可與目的超結(jié)構(gòu)蛋白的編碼序列共表達。此外，目的超結(jié)構(gòu)的編碼序列可與編碼n-乙酰葡萄糖胺基轉(zhuǎn)移酶iii(gnt-iii；wo20008/151440所述的seqidno：16)的核苷酸序列共表達。也可使用哺乳動物gnt-iii或人gnt-iii、其他來源的gnt-iii。另外，也可使用gnt1-gnt-iii雜合酶(seqidno：26；如wo20008/151440所述)，其包含與gnt-iii融合的gnt1的cts。所有引用文獻通過引用并入本文，就像指名每個獨立出版物專門并單獨地通過引用并入本文并在本文中給出全文那樣。本文引用的參考文獻不應(yīng)理解為或視為承認(rèn)這些參考文獻是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。已通過示例方式描述了一個或多個目前優(yōu)選的本發(fā)明實施方案。本發(fā)明包括基本如上所述并且參照實施例和附圖的所有實施方案、改變和變化。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，大量的變化和改變可在不偏離本發(fā)明權(quán)利要求所限定范圍的情況下獲得。這些修改的例子包括用已知的等同方案替換本發(fā)明的任何方面以實質(zhì)相同的方式獲得同樣的結(jié)果。以下內(nèi)容對應(yīng)于母案申請中的原始權(quán)利要求書，現(xiàn)作為說明書的一部分并入此處：1.制備植物來源的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的方法，其包括：a.獲取包含定位于質(zhì)外體之蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的植物或植物物質(zhì)，b.產(chǎn)生原生質(zhì)體/原生質(zhì)球級分和質(zhì)外體級分；和，c.回收所述質(zhì)外體級分，所述質(zhì)外體級分包含所述植物來源的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白。2.項1的方法，其中在所述產(chǎn)生步驟(步驟b)中，通過用細胞壁降解酶組合物處理所述植物或植物物質(zhì)來產(chǎn)生所述質(zhì)外體級分和原生質(zhì)體級分。3.項2的方法，其中所述細胞壁降解酶組合物包含一種或多于一種果膠酶、一種或多于一種纖維素酶，或者一種或多于一種果膠酶和一種或多于一種纖維素酶。4.項3的方法，其中所述細胞壁降解酶組合物不包含脂肪酶、蛋白酶或果膠酶的一種或更多種。5.項1的方法，其中在所述獲取步驟(步驟a)中，用編碼選自以下組的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的核酸序列轉(zhuǎn)化所述植物：肽、蛋白質(zhì)、蛋白花環(huán)、蛋白復(fù)合物、蛋白酶體、代謝區(qū)室、轉(zhuǎn)錄復(fù)合物、重組復(fù)合物、光合復(fù)合物、膜轉(zhuǎn)運復(fù)合物、核孔復(fù)合物、蛋白納米顆粒、糖蛋白、抗體、多克隆抗體、單克隆抗體、單鏈單克隆抗體、病毒樣顆粒、病毒包膜蛋白、病毒結(jié)構(gòu)蛋白、病毒衣殼蛋白和病毒外殼蛋白、嵌合蛋白、嵌合蛋白復(fù)合物、嵌合蛋白納米顆粒、嵌合糖蛋白、嵌合抗體、嵌合單克隆抗體、嵌合單鏈單克隆抗體、嵌合血凝素、病毒包膜蛋白、病毒結(jié)構(gòu)蛋白、病毒衣殼蛋白和病毒外殼蛋白，以及收集所述植物或植物物質(zhì)。6.項5的方法，其中所述核酸以瞬時方式引入所述植物中。7.項5的方法，其中所述核酸穩(wěn)定整合進所述植物的基因組。8.項1的方法，其中在所述獲取步驟(步驟a)中，培養(yǎng)所述植物并收集所述植物或植物物質(zhì)。9.項5的方法，其中所述核酸編碼單克隆抗體或流感血凝素。10.項1的方法，其中所述植物來源的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白不包含神經(jīng)氨酸酶或m蛋白。11.項1的方法，其中所述植物物質(zhì)選自葉和培養(yǎng)的植物細胞的組。12.項1的方法，其還包括步驟d)從所述質(zhì)外體級分中純化所述植物來源的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白。13.項12的方法，其中所述純化步驟包括利用深層過濾來過濾所述質(zhì)外體級分以產(chǎn)生澄清的提取物，然后用體積排阻層析、陽離子交換樹脂或親和層析或者其組合來層析所述澄清的提取物。14.制備植物來源的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的方法，其包括：a.獲取包含植物來源的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的植物或植物物質(zhì)，b.用細胞壁降解酶組合物消化所述植物物質(zhì)以產(chǎn)生消化級分；c.過濾所述消化級分以產(chǎn)生過濾級分，從所述過濾級分中回收所述植物來源的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白。15.項14的方法，其中所述細胞壁降解酶組合物包含一種或多于一種果膠酶、一種或多于一種纖維素酶，或者一種或多于一種果膠酶和一種或多于一種纖維素酶。16.項15的方法，其中所述細胞壁降解酶組合物包含一種或多于一種果膠酶、一種或多于一種纖維素酶，或者一種或多于一種果膠酶和一種或多于一種纖維素酶。17.項15的方法，其中在所述獲取步驟(步驟a)中，用編碼選自以下組的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的核酸序列轉(zhuǎn)化所述植物：肽、蛋白質(zhì)、蛋白花環(huán)、蛋白復(fù)合物、蛋白酶體、代謝區(qū)室、轉(zhuǎn)錄復(fù)合物、重組復(fù)合物、光合復(fù)合物、膜轉(zhuǎn)運復(fù)合物、核孔復(fù)合物、蛋白納米顆粒、糖蛋白、抗體、多克隆抗體、單克隆抗體、單鏈單克隆抗體、病毒樣顆粒、病毒包膜蛋白、病毒結(jié)構(gòu)蛋白、病毒衣殼蛋白和病毒外殼蛋白、嵌合蛋白、嵌合蛋白復(fù)合物、嵌合蛋白納米顆粒、嵌合糖蛋白、嵌合抗體、嵌合單克隆抗體、嵌合單鏈單克隆抗體、嵌合血凝素、病毒包膜蛋白、病毒結(jié)構(gòu)蛋白、病毒衣殼蛋白和病毒外殼蛋白，以及收集所述植物或植物物質(zhì)。18.項17的方法，其中所述核酸以瞬時方式引入所述植物中。19.項17的方法，其中所述核酸穩(wěn)定整合進所述植物的基因組。20.項17的方法，其中所述植物來源的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白包含單克隆抗體或流感血凝素。21.項15的方法，其中所述植物物質(zhì)選自葉和培養(yǎng)的植物細胞的組。22.項14的方法，其還包括步驟d)將所述過濾級分中的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白與細胞碎片和不溶物質(zhì)分離開。23.項22的方法，其中所述分離步驟通過離心進行。24.項22的方法，其中所述分離步驟通過深層過濾進行。25.項15的方法，其還包括步驟d)從所述過濾級分中純化所述植物來源的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白。26.項25的方法，其中所述純化步驟包括深層過濾所述過濾級分以產(chǎn)生澄清的提取物，然后用陽離子交換樹脂、體積排阻樹脂、親和樹脂或者其組合來層析所述澄清的提取物。序列表<110>medicagoinc.vezina,louis-philippedargis,michelecouture,manonpaquet,danyd'aoust,marc-andre<120>制備植物來源的蛋白質(zhì)的方法<130>v82625wo<150>61/244,786<151>2009-09-22<160>16<170>patentinversion3.5<210>1<211>3067<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的構(gòu)建體685<400>1ttaattaagaattcgagctccaccgcggaaacctcctcggattccattgcccagctatct60gtcactttattgagaagatagtggaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcg120ataaaggaaaggccatcgttgaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccc180cacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtgg240attgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaag300acccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggtattaaaatcttaataggt360tttgataaaagcgaacgtggggaaacccgaaccaaaccttcttctaaactctctctcatc420tctcttaaagcaaacttctctcttgtctttcttgcgtgagcgatcttcaacgttgtcaga480tcgtgcttcggcaccagtacaacgttttctttcactgaagcgaaatcaaagatctctttg540tggacacgtagtgcggcgccattaaataacgtgtacttgtcctattcttgtcggtgtggt600cttgggaaaagaaagcttgctggaggctgctgttcagccccatacattacttgttacgat660tctgctgactttcggcgggtgcaatatctctacttctgcttgacgaggtattgttgcctg720tacttctttcttcttcttcttgctgattggttctataagaaatctagtattttctttgaa780acagagttttcccgtggttttcgaacttggagaaagattgttaagcttctgtatattctg840cccaaatttgtcgggcccatggagaaaatagtgcttcttcttgcaatagtcagtcttgtt900aaaagtgatcagatttgcattggttaccatgcaaacaattcaacagagcaggttgacaca960atcatggaaaagaacgttactgttacacatgcccaagacatactggaaaagacacacaac1020gggaagctctgcgatctagatggagtgaagcctctaattttaagagattgtagtgtagct1080ggatggctcctcgggaacccaatgtgtgacgaattcatcaatgtaccggaatggtcttac1140atagtggagaaggccaatccaaccaatgacctctgttacccagggagtttcaacgactat1200gaagaactgaaacacctattgagcagaataaaccattttgagaaaattcaaatcatcccc1260aaaagttcttggtccgatcatgaagcctcatcaggagttagctcagcatgtccatacctg1320ggaagtccctccttttttagaaatgtggtatggcttatcaaaaagaacagtacataccca1380acaataaagaaaagctacaataataccaaccaagaggatcttttggtactgtggggaatt1440caccatcctaatgatgcggcagagcagacaaggctatatcaaaacccaaccacctatatt1500tccattgggacatcaacactaaaccagagattggtaccaaaaatagctactagatccaaa1560gtaaacgggcaaagtggaaggatggagttcttctggacaattttaaaacctaatgatgca1620atcaacttcgagagtaatggaaatttcattgctccagaatatgcatacaaaattgtcaag1680aaaggggactcagcaattatgaaaagtgaattggaatatggtaactgcaacaccaagtgt1740caaactccaatgggggcgataaactctagtatgccattccacaacatacaccctctcacc1800atcggggaatgccccaaatatgtgaaatcaaacagattagtccttgcaacagggctcaga1860aatagccctcaaagagagagcagaagaaaaaagagaggactatttggagctatagcaggt1920tttatagagggaggatggcagggaatggtagatggttggtatgggtaccaccatagcaat1980gagcaggggagtgggtacgctgcagacaaagaatccactcaaaaggcaatagatggagtc2040accaataaggtcaactcaatcattgacaaaatgaacactcagtttgaggccgttggaagg2100gaatttaataacttagaaaggagaatagagaatttaaacaagaagatggaagacgggttt2160ctagatgtctggacttataatgccgaacttctggttctcatggaaaatgagagaactcta2220gactttcatgactcaaatgttaagaacctctacgacaaggtccgactacagcttagggat2280aatgcaaaggagctgggtaacggttgtttcgagttctatcacaaatgtgataatgaatgt2340atggaaagtataagaaacggaacgtacaactatccgcagtattcagaagaagcaagatta2400aaaagagaggaaataagtggggtaaaattggaatcaataggaacttaccaaatactgtca2460atttattcaacagtggcgagttccctagcactggcaatcatgatggctggtctatcttta2520tggatgtgctccaatggatcgttacaatgcagaatttgcatttaaaggcctattttcttt2580agtttgaatttactgttattcggtgtgcatttctatgtttggtgagcggttttctgtgct2640cagagtgtgtttattttatgtaatttaatttctttgtgagctcctgtttagcaggtcgtc2700ccttcagcaaggacacaaaaagattttaattttattaaaaaaaaaaaaaaaaaagaccgg2760gaattcgatatcaagcttatcgacctgcagatcgttcaaacatttggcaataaagtttct2820taagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacg2880ttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatga2940ttagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaact3000aggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagattctagagtctcaagcttcg3060gcgcgcc3067<210>2<211>568<212>prt<213>人工序列<220><223>seqidno:1編碼的合成的氨基酸<400>2metglulysilevalleuleuleualailevalserleuvallysser151015aspglnilecysileglytyrhisalaasnasnserthrgluglnval202530aspthrilemetglulysasnvalthrvalthrhisalaglnaspile354045leuglulysthrhisasnglylysleucysaspleuaspglyvallys505560proleuileleuargaspcysservalalaglytrpleuleuglyasn65707580prometcysaspglupheileasnvalproglutrpsertyrileval859095glulysalaasnprothrasnaspleucystyrproglyserpheasn100105110asptyrglugluleulyshisleuleuserargileasnhispheglu115120125lysileglnileileprolyssersertrpserasphisglualaser130135140serglyvalserseralacysprotyrleuglyserproserphephe145150155160argasnvalvaltrpleuilelyslysasnserthrtyrprothrile165170175lyslyssertyrasnasnthrasnglngluaspleuleuvalleutrp180185190glyilehishisproasnaspalaalagluglnthrargleutyrgln195200205asnprothrthrtyrileserileglythrserthrleuasnglnarg210215220leuvalprolysilealathrargserlysvalasnglyglnsergly225230235240argmetgluphephetrpthrileleulysproasnaspalaileasn245250255phegluserasnglyasnpheilealaproglutyralatyrlysile260265270vallyslysglyaspseralailemetlyssergluleuglutyrgly275280285asncysasnthrlyscysglnthrprometglyalaileasnserser290295300metprophehisasnilehisproleuthrileglyglucysprolys305310315320tyrvallysserasnargleuvalleualathrglyleuargasnser325330335proglnarggluserargarglyslysargglyleupheglyalaile340345350alaglypheilegluglyglytrpglnglymetvalaspglytrptyr355360365glytyrhishisserasngluglnglyserglytyralaalaasplys370375380gluserthrglnlysalaileaspglyvalthrasnlysvalasnser385390395400ileileasplysmetasnthrglnpheglualavalglyarggluphe405410415asnasnleugluargargilegluasnleuasnlyslysmetgluasp420425430glypheleuaspvaltrpthrtyrasnalagluleuleuvalleumet435440445gluasngluargthrleuaspphehisaspserasnvallysasnleu450455460tyrasplysvalargleuglnleuargaspasnalalysgluleugly465470475480asnglycysphegluphetyrhislyscysaspasnglucysmetglu485490495serileargasnglythrtyrasntyrproglntyrserglugluala500505510argleulysargglugluileserglyvallysleugluserilegly515520525thrtyrglnileleuseriletyrserthrvalalaserserleuala530535540leualailemetmetalaglyleuserleutrpmetcysserasngly545550555560serleuglncysargilecysile565<210>3<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸pbinplus.2613c<400>3aggaagggaagaaagcgaaaggag24<210>4<211>56<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸mut-atg115.r<400>4gtgccgaagcacgatctgacaacgttgaagatcgctcacgcaagaaagacaagaga56<210>5<211>52<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸mut-atg161.c<400>5gttgtcagatcgtgcttcggcaccagtacaacgttttctttcactgaagcga52<210>6<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸lc-c5-1.110r<400>6tctcctggagtcacagacagggtgg25<210>7<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸apai-h5(a-indo).1c<400>7tgtcgggcccatggagaaaatagtgcttcttcttgcaat39<210>8<211>37<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸h5(a-indo)-stui.1707r<400>8aaataggcctttaaatgcaaattctgcattgtaacga37<210>9<211>3111<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸構(gòu)建體660<400>9agaggtaccccgggctggtatatttatatgttgtcaaataactcaaaaaccataaaagtt60taagttagcaagtgtgtacatttttacttgaacaaaaatattcacctactactgttataa120atcattattaaacattagagtaaagaaatatggatgataagaacaagagtagtgatattt180tgacaacaattttgttgcaacatttgagaaaattttgttgttctctcttttcattggtca240aaaacaatagagagagaaaaaggaagagggagaataaaaacataatgtgagtatgagaga300gaaagttgtacaaaagttgtaccaaaatagttgtacaaatatcattgaggaatttgacaa360aagctacacaaataagggttaattgctgtaaataaataaggatgacgcattagagagatg420taccattagagaatttttggcaagtcattaaaaagaaagaataaattatttttaaaatta480aaagttgagtcatttgattaaacatgtgattatttaatgaattgatgaaagagttggatt540aaagttgtattagtaattagaatttggtgtcaaatttaatttgacatttgatcttttcct600atatattgccccatagagtcagttaactcatttttatatttcatagatcaaataagagaa660ataacggtatattaatccctccaaaaaaaaaaaacggtatatttactaaaaaatctaagc720cacgtaggaggataacaggatccccgtaggaggataacatccaatccaaccaatcacaac780aatcctgatgagataacccactttaagcccacgcatctgtggcacatctacattatctaa840atcacacattcttccacacatctgagccacacaaaaaccaatccacatctttatcaccca900ttctataaaaaatcacactttgtgagtctacactttgattcccttcaaacacatacaaag960agaagagactaattaattaattaatcatcttgagagaaaatggagaaaatagtgcttctt1020cttgcaatagtcagtcttgttaaaagtgatcagatttgcattggttaccatgcaaacaat1080tcaacagagcaggttgacacaatcatggaaaagaacgttactgttacacatgcccaagac1140atactggaaaagacacacaacgggaagctctgcgatctagatggagtgaagcctctaatt1200ttaagagattgtagtgtagctggatggctcctcgggaacccaatgtgtgacgaattcatc1260aatgtaccggaatggtcttacatagtggagaaggccaatccaaccaatgacctctgttac1320ccagggagtttcaacgactatgaagaactgaaacacctattgagcagaataaaccatttt1380gagaaaattcaaatcatccccaaaagttcttggtccgatcatgaagcctcatcaggagtt1440agctcagcatgtccatacctgggaagtccctccttttttagaaatgtggtatggcttatc1500aaaaagaacagtacatacccaacaataaagaaaagctacaataataccaaccaagaggat1560cttttggtactgtggggaattcaccatcctaatgatgcggcagagcagacaaggctatat1620caaaacccaaccacctatatttccattgggacatcaacactaaaccagagattggtacca1680aaaatagctactagatccaaagtaaacgggcaaagtggaaggatggagttcttctggaca1740attttaaaacctaatgatgcaatcaacttcgagagtaatggaaatttcattgctccagaa1800tatgcatacaaaattgtcaagaaaggggactcagcaattatgaaaagtgaattggaatat1860ggtaactgcaacaccaagtgtcaaactccaatgggggcgataaactctagtatgccattc1920cacaacatacaccctctcaccatcggggaatgccccaaatatgtgaaatcaaacagatta1980gtccttgcaacagggctcaga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