本發(fā)明涉及多肽純化技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種批量化產(chǎn)業(yè)化純化含有24個(gè)氨基酸殘基的多肽的方法。

背景技術(shù)：

艾滋病又稱獲得性免疫缺陷綜合癥（acquiredimmunodeficiency

syndrome，aids），是一種由人免疫缺陷病毒引起的，是一種全身免疫系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p害的傳染性疾病。感染者終生攜帶病毒，且缺乏治愈該病的有效方法。艾滋病病毒進(jìn)入人人的身體后，首先進(jìn)入血液，在血液里專門攻擊一種重要的血液細(xì)胞－淋巴細(xì)胞。淋巴細(xì)胞是人體的一種免疫細(xì)跑。這種細(xì)胞是人體與外來(lái)病菌作戰(zhàn)的斗士。由于艾滋病病毒可以在淋巴細(xì)胞中生存并進(jìn)行繁殖，然后又從細(xì)胞中跑出來(lái)侵犯新的細(xì)胞，所以血液是艾滋病病毒的重要藏身之地，使用被艾滋病污染了的血染也是傳播艾滋病病毒的重要途徑。艾滋病病毒還存在于人體的精液、陰道的分泌液中，所以性活動(dòng)也是艾滋病病毒傳播的重要途徑之一。不過，人體的其他排泄物如汗液、唾液、尿液、淚液和糞便等都不含有或只含有極少的艾滋病病毒，因此不會(huì)造成傳播。另外，艾滋病病毒還可以侵犯人的腦部和身體其他一些部位，但是由于這些部位的病毒不太容易排出體外，所以與艾滋病病毒的傳播關(guān)系不大。艾滋病病毒在一些會(huì)叮咬人的昆蟲（如蚊子）體內(nèi)都不能生存，所以我們不必?fù)?dān)心這些昆蟲會(huì)艾滋病病毒傳給我們。

自其被發(fā)現(xiàn)以來(lái),已嚴(yán)重威脅人類的生存,對(duì)全球人口健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展產(chǎn)生巨大的影響。伴隨著多年來(lái)的研究,艾滋病在治療上取得了很大的進(jìn)展,譬如高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(highlyactiveantiretroviraltherapy,haart,又稱為“雞尾酒”療法)的應(yīng)用。雞尾酒療法是通過多種的抗病毒藥物聯(lián)合使用來(lái)治療艾滋病，根據(jù)此方法的基本原理，針對(duì)hiv1的膜融合抑制劑采用分子生物學(xué)手段重組和表達(dá)并設(shè)計(jì)出組合多肽即py-24和fy-24，該兩條多肽針對(duì)hiv的gp41,和gp120的靶點(diǎn)，在前期的實(shí)驗(yàn)中證明了它們可對(duì)hiv1具有非常好的抑制活性。

py-24是一種含有24個(gè)氨基酸殘基的線性直鏈肽，它的分子式是c110h170n36o28，分子量：2444.81，多肽序列為h-pro-his-ser-gly-ala-his-gly-ile-pro-lys-ile-phe-gly-ala-arg-ala-gln-pro-ala-ala-ala-arg-ala-tyr-oh。

fy-24是一種含有24個(gè)氨基酸殘基的線性直鏈肽，它的分子式是c115h176n42o29，分子量：2610.95，多肽序列為h-phe-thr-ala-his-leu-his-thr-his-his-arg-ile-gly-gly-ala-arg-ala-gln-pro-ala-ala-ala-arg-ala-tyr-oh。

直連多肽常用方法為三氟乙酸緩沖液或者磷酸鹽體系，cn101981048a涉及一種通過色譜程序包括所述肽和至少一種相關(guān)雜質(zhì)的組合物中純化環(huán)肽ide簡(jiǎn)化且優(yōu)化的純化方法。其使用緩沖鹽包括檸檬酸、乙酸、高氯酸，不適合工業(yè)化制備，不利于后續(xù)處理。另外，體積排阻色譜使用局限性比較大。

cn1699407a涉及一種化學(xué)合成多肽的分離純化方法，以凝膠離子色譜完成離子交換分離，然后以低壓有機(jī)填料分離，獲得高純度的多肽產(chǎn)品。其弊端是分離效率差，操作復(fù)雜，不利用工業(yè)化生產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一條適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)含有24個(gè)氨基酸殘基的多肽的純化方法，主要解決現(xiàn)有純化方法不適合工業(yè)化，操作復(fù)雜、后續(xù)處理困難及分離效率較差的技術(shù)問題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種含有24個(gè)氨基酸殘基的多肽的純化方法，包括如下步驟：

1）將含有24個(gè)氨基酸殘基的多肽粗品溶液用濾膜過濾后待用，所述含有24個(gè)氨基酸殘基的多肽為py-24或fy-24，流動(dòng)相a相為甲酸水溶液，b相為100%乙腈，以c18反相硅膠柱進(jìn)行梯度洗脫收集目標(biāo)峰；

2)收集合格的目標(biāo)峰利用預(yù)先處理好的陰離子樹脂轉(zhuǎn)醋酸鹽；

3）將所得溶液減壓旋蒸濃縮后冷凍干燥得到粉末狀成品肽。

更為優(yōu)選的方案是：所述的濾膜為孔徑0.45μm濾膜。

更為優(yōu)選的方案是：所述梯度洗脫：流動(dòng)相b色譜乙腈溶液的體積百分濃度py-24為15-55%，fy-24為10-50%，檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm。

更為優(yōu)選的方案是：所述的流動(dòng)相a中甲酸的體積百分比為0.1-0.3%。

更為優(yōu)選的方案是：所述的陰離子樹脂為d301、d201、d351或者d370中的一種。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提出的一條適于產(chǎn)業(yè)化含有24個(gè)氨基酸殘基的多肽的純化方法，使用反相高效液相色譜法純化含有24個(gè)氨基酸殘基的多肽，并用陰離子樹脂轉(zhuǎn)鹽，工藝簡(jiǎn)單，能得到hplc純度大于98%的精品肽且便于工業(yè)化實(shí)施，從而達(dá)到大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的目的。

附圖說明

圖1py-24高效液相色譜檢測(cè)圖。

圖2fy-24高效液相色譜檢測(cè)圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

1.準(zhǔn)備樣品

溶解py-24粗品，使用超聲波助溶。完全溶解后用0.45um濾膜過濾；

2.純化過程

純化條件：c18反相硅膠柱

規(guī)格為：10cm×25cm

流動(dòng)相：a相：體積百分比0.1%甲酸水溶液；b相：100%乙腈溶液

流速：180-200ml/min

檢測(cè)波長(zhǎng)：215nm

梯度洗脫：b%：15-55%，60-100min

進(jìn)樣量為12.5-15g；

3．轉(zhuǎn)鹽

將上述目標(biāo)峰溶液ph值調(diào)節(jié)為中性，利用預(yù)先處理好的陰離子樹脂d301轉(zhuǎn)鹽，收集過柱后的溶液；

4．將收集的溶液進(jìn)行減壓濃縮,然后冷凍干燥得到含有24個(gè)氨基酸殘基的多肽樣品，收率19.8%。見圖1。

實(shí)施例2

1.準(zhǔn)備樣品

溶解py-24粗品，使用超聲波助溶。完全溶解后用0.45um濾膜過濾；

2.純化過程

純化條件：c18反相硅膠柱

規(guī)格為：15cm×25cm

流動(dòng)相：a相：體積百分比0.2%甲酸水溶液；b相：100%乙腈溶液

流速：250-300ml/min

檢測(cè)波長(zhǎng)：215nm

梯度洗脫：b%：15-55%，60-100min

進(jìn)樣量為18-25g；

3．轉(zhuǎn)鹽

將上述目標(biāo)峰溶液ph值調(diào)節(jié)為中性，利用預(yù)先處理好的陰離子樹脂d351轉(zhuǎn)鹽，收集過柱后的溶液；

4．將收集的溶液進(jìn)行減壓濃縮,然后冷凍干燥得到含有24個(gè)氨基酸殘基的多肽樣品，收率20.6%。見圖1。

實(shí)施例3

1.準(zhǔn)備樣品

溶解py-24粗品，使用超聲波助溶。完全溶解后用0.45um濾膜過濾；

2.純化過程

純化條件：c18反相硅膠柱

規(guī)格為：20cm×25cm

流動(dòng)相：a相：體積百分比0.3%甲酸水溶液；b相：100%乙腈溶液

流速：800-1000ml/min

檢測(cè)波長(zhǎng)：215nm

梯度洗脫：b%：15-55%，60-100min

進(jìn)樣量為30-35g；

3．轉(zhuǎn)鹽

將上述目標(biāo)峰溶液ph值調(diào)節(jié)為中性，利用預(yù)先處理好的陰離子樹脂d201轉(zhuǎn)鹽，收集過柱后的溶液；

4．將收集的溶液進(jìn)行減壓濃縮,然后冷凍干燥得到含有24個(gè)氨基酸殘基的多肽樣品，收率22.7%。見圖1。

實(shí)施例4

1.準(zhǔn)備樣品

溶解fy-24粗品，使用超聲波助溶。完全溶解后用0.45um濾膜過濾；

2.純化過程

純化條件：c18反相硅膠柱

規(guī)格為：10cm×25cm

流動(dòng)相：a相：體積百分比0.1%甲酸水溶液；b相：100%乙腈溶液

流速：180-200ml/min

檢測(cè)波長(zhǎng)：215nm

梯度洗脫：b%：10-50%，60-100min

進(jìn)樣量為13-15g；

3．轉(zhuǎn)鹽

將上述目標(biāo)峰溶液ph值調(diào)節(jié)為中性，利用預(yù)先處理好的陰離子樹脂d201轉(zhuǎn)鹽，收集過柱后的溶液；

4．將收集的溶液進(jìn)行減壓濃縮,然后冷凍干燥得到含有24個(gè)氨基酸殘基的多肽樣品，收率16.4%。見圖2。

實(shí)施例5

1.準(zhǔn)備樣品

溶解fy-24粗品，使用超聲波助溶。完全溶解后用0.45um濾膜過濾；

2.純化過程

純化條件：c18反相硅膠柱

規(guī)格為：15cm×25cm

流動(dòng)相：a相：體積百分比0.2%甲酸水溶液；b相：100%乙腈溶液

流速：250-300ml/min

檢測(cè)波長(zhǎng)：215nm

梯度洗脫：b%：10-50%，60-100min

進(jìn)樣量為18-22g；

3．轉(zhuǎn)鹽

將上述目標(biāo)峰溶液ph值調(diào)節(jié)為中性，利用預(yù)先處理好的陰離子樹脂d301轉(zhuǎn)鹽，收集過柱后的溶液；

4．將收集的溶液進(jìn)行減壓濃縮,然后冷凍干燥得到含有24個(gè)氨基酸殘基的多肽樣品，收率17.3%。見圖2。

實(shí)施例6

1.準(zhǔn)備樣品

溶解py-24粗品，使用超聲波助溶。完全溶解后用0.45um濾膜過濾；

2.純化過程

純化條件：c18反相硅膠柱

規(guī)格為：20cm×25cm

流動(dòng)相：a相：體積百分比0.3%甲酸水溶液；b相：100%乙腈溶液

流速：800-1000ml/min

檢測(cè)波長(zhǎng)：215nm

梯度洗脫：b%：10-50%，60-100min

進(jìn)樣量為30-35g；

3．轉(zhuǎn)鹽

將上述目標(biāo)峰溶液ph值調(diào)節(jié)為中性，利用預(yù)先處理好的陰離子樹脂d351轉(zhuǎn)鹽，收集過柱后的溶液；

4．將收集的溶液進(jìn)行減壓濃縮,然后冷凍干燥得到含有24個(gè)氨基酸殘基的多肽樣品，收率18.1%。見圖2。