任意三個(gè)或以上氨基酸殘基構(gòu)成的多肽表位及其相關(guān)抗體的誘導(dǎo)的制作方法
【專利摘要】一種含有不同多肽混合物的疫苗，其中各多肽在一些位置有固定的相同氨基酸殘基而在另一些位置則是隨機(jī)數(shù)的氨基酸殘基，其隨機(jī)化的程度可以根據(jù)需要進(jìn)行設(shè)計(jì)。對(duì)于一些用現(xiàn)有技術(shù)難以誘發(fā)抗體的原決定簇，本發(fā)明的肽疫苗已顯示能夠誘導(dǎo)針對(duì)這些抗原決定簇的具有高度特異性的抗體，例如針對(duì)HIV-1中g(shù)p120的V3GPG三肽。
【專利說(shuō)明】任意三個(gè)或以上氨基酸殘基構(gòu)成的多肽表位及其相關(guān)抗體的誘導(dǎo)
[0001]與申請(qǐng)相關(guān)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，該美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)的申請(qǐng)?zhí)枮?1/535，988，于2011年9月17日遞交。通過(guò)引用，其全部?jī)?nèi)容都包含于此。
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0003]本發(fā)明與免疫【技術(shù)領(lǐng)域】相關(guān)。該發(fā)明致力于通過(guò)多肽疫苗設(shè)計(jì)和免疫原設(shè)計(jì)誘導(dǎo)針對(duì)任何氨基酸殘基構(gòu)成的表位抗體，而且該方法能誘導(dǎo)出在體外很難以被誘導(dǎo)的抗體。
【背景技術(shù)】:
[0004]多肽治療的進(jìn)步引起了人們對(duì)多肽疫苗的新的興趣。合成多肽疫苗與以往傳統(tǒng)的滅活或減毒疫苗相比有以下優(yōu)勢(shì):容易制備，高安全性，很少甚至沒有類似于滅活或減毒微生物疫苗對(duì)免疫系統(tǒng)帶來(lái)的危害。多肽免疫原已被廣泛的應(yīng)用于針對(duì)已知特異性表位的抗體誘導(dǎo)。免疫優(yōu)勢(shì)表位的氨基酸殘基和側(cè)翼氨基酸殘基決定特異性表位抗體的誘導(dǎo)。這些優(yōu)勢(shì)表位存在于高度突變的病毒如:艾滋病病毒(human immunodeficiency virus, HIV),丙型肝炎病毒(h印atitis C virus，HCV)，由于它們通常都是高度突變位點(diǎn)，所以針對(duì)這些優(yōu)勢(shì)表位的抗體通常很少具有治療價(jià)值。
[0005]在HIV-1的感染過(guò)程中，gpl20可變區(qū)通常作為一個(gè)誘餌去誘導(dǎo)主要的抗體反應(yīng)，但病毒通過(guò)突變能夠有效地逃逸抗體的中和作用。但這些區(qū)域即使突變后，HIV-1仍然具有復(fù)制能力，感 染新的細(xì)胞。Gpl20的保守區(qū)域通常不是優(yōu)勢(shì)表位，因此也很難誘導(dǎo)出很強(qiáng)的抗體反應(yīng)。然而有研究表明針對(duì)保守表位的抗體能很好的抑制病毒的感染。之前的研究顯示在實(shí)驗(yàn)室T細(xì)胞適應(yīng)(T-cell-line-adapted，TCLA)的HIV_lgpl20中的第三個(gè)可變區(qū)(the third variable, V3)是主要的抗體中和區(qū)域(principal neutralizingdeterminant, PND);然而該區(qū)域的氨基酸序列高度可變,使得誘導(dǎo)的抗體僅具有識(shí)別相同序列的特異性，難以獲得廣譜中和抗體，病毒亦能夠輕易逃逸V3特異性中和抗體的抑制；PND區(qū)域的這些性質(zhì)極大地限制了其作為疫苗靶標(biāo)的可能性，因此在疫苗的研究策略里，PND只能成為有限的潛在靶標(biāo)。在PND頂端的四個(gè)氨基酸殘基中，只有三個(gè)氨基酸殘基是高度保守的，第四個(gè)氨基酸是可突變的。前三個(gè)氨基酸殘基分別是甘氨酸，脯氨酸和甘氨酸(glycine, proline and glycine, GPG)。通過(guò)比較 2000 多份 HIV-1 膜蛋白序列發(fā)現(xiàn)，95% 以上的V3區(qū)的PND頂端含有GPG，然而第四個(gè)氨基酸殘基在不同病毒中由不同的氨基酸殘基構(gòu)成。其中精氨酸(arginine, R)出現(xiàn)的頻率為34%,谷氨酰胺(Glutamine, Q)出現(xiàn)的頻率為54%，賴氨酸(lysine，K)出現(xiàn)的頻率為4%。GPG均為非極性、疏水氨基酸殘基，而第四位氨基酸均為極性或堿性親水氨基酸殘基。功能研究顯示PND為HIV-1噬性的主要決定區(qū)，而且該區(qū)域的單個(gè)氨基酸殘基的突變都能終止HIV-1感染Suptl和CEM細(xì)胞的活性；這些研究顯示特定序列的保守氨基酸殘基在病毒的功能中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。多年的抗HIV-1疫苗研究一直致力于誘導(dǎo)識(shí)別保守區(qū)的廣譜中和抗體，但目前只篩選到特異性結(jié)合V3區(qū)頂端的至少四個(gè)氨基酸殘基的抗體，沒篩選到只特異性結(jié)合頂端高度保守的三個(gè)氨基酸殘基(GPG)的抗體。用于誘導(dǎo)該區(qū)域抗體的免疫原多種多樣，有病毒樣顆粒(virus likeparticle, VLP),重組gpl20，多肽或混合多肽庫(kù)；免疫的策略也有很多種，像雞尾酒多肽法，構(gòu)建人鼻病毒的(human rhinovirus, HRV)嵌合病毒庫(kù)免疫法,連續(xù)的V3多肽免疫法等等；但是這些免疫原和免疫策略都未能成功的誘導(dǎo)出特異性廣譜中和抗體，或針對(duì)GPG的抗體。雖然像HIV的GPG這種重要的保守表位在抑制病毒感染過(guò)程中可能發(fā)揮很重要的作用，但是至今為止未能有很好的免疫原和免疫策略能誘導(dǎo)出針對(duì)類似GPG這種高度保守但弱免疫原性的表位抗體。綜上所述我們急需一種全新的免疫原或免疫策略去誘導(dǎo)針對(duì)像GPG這種高度保守但弱免疫原性的功能表位抗體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明第一個(gè)目標(biāo)是通過(guò)新型理念設(shè)計(jì)的多肽免疫原所誘導(dǎo)的具有治療意義的保護(hù)性抗體，這些抗體能夠抑制像HIV類型的高度突變病毒的感染。
[0007]本發(fā)明的第二個(gè)目標(biāo)是通過(guò)新型的多肽疫苗誘導(dǎo)出治療性抗體應(yīng)用于感染者體內(nèi)治療。
[0008]本發(fā)明的第三個(gè)目標(biāo)是誘導(dǎo)出能特異性結(jié)合三個(gè)氨基酸殘基的抗體；這三個(gè)氨基酸殘基所構(gòu)成的表位可以是由連續(xù)的三個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，也可以是被其它氨基酸間隔開來(lái)的三個(gè)不連續(xù)的氨基酸構(gòu)成。本發(fā)明中一個(gè)特殊的代表事例是誘導(dǎo)特異性結(jié)合gpl20的V3區(qū)GPG殘基的HIV-1廣譜中和抗體。
[0009]本發(fā)明中所有目標(biāo)將通過(guò)應(yīng)用基序免疫原來(lái)實(shí)現(xiàn)?；蛎庖咴且粋€(gè)混合的多肽文庫(kù)，由固定的氨基酸殘基和隨機(jī)的氨基酸殘基構(gòu)成。固定的氨基酸殘基存在于多肽庫(kù)中任意一條多肽中的固 定位置；隨機(jī)的氨基酸殘基隨機(jī)的出現(xiàn)在多肽鏈中任意位置。固定的氨基酸殘基可以是連續(xù)的或者是間斷的出現(xiàn)在多肽鏈中。固定的氨基酸殘基通常是依據(jù)目標(biāo)表位的氨基酸殘基來(lái)設(shè)計(jì)。取決于所要誘導(dǎo)的抗體及其應(yīng)用目的，所選的固定氨基酸殘基也可以是人為構(gòu)建的序列。基序免疫原中固定的氨基酸殘基通常位于多肽鏈中間，側(cè)翼由隨機(jī)氨基酸構(gòu)成。基序免疫原多肽的最合適的長(zhǎng)度為15個(gè)氨基酸殘基；10-50個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的基序免疫原多肽也能誘導(dǎo)出特異性的抗體。實(shí)際上該發(fā)明適用于任何長(zhǎng)度的基序免疫原的抗體誘導(dǎo)?；蛎庖咴梢酝ㄟ^(guò)常規(guī)的方法合成，也可以讓廠家商業(yè)合成；因此基序免疫原的合成方法不是該發(fā)明的保護(hù)目標(biāo)。
[0010]本發(fā)明不依賴于以往的特定的理論，而是建立在自身的科學(xué)假設(shè)上。該發(fā)明的科學(xué)假設(shè)是(I)氨基酸殘基的隨機(jī)化能夠屏蔽免疫優(yōu)勢(shì)表位(2)氨基酸殘基的隨機(jī)化能夠幫助固定氨基酸殘基成為免疫優(yōu)勢(shì)表位；固定氨基殘基所構(gòu)成的表位存在于所有的基序免疫原多肽文庫(kù)中的所有多肽鏈中，但是由隨機(jī)氨基酸殘基所構(gòu)成表位只能隨機(jī)的存在于極少量的多肽鏈中；從統(tǒng)計(jì)學(xué)上分析在基序免疫原的多肽文庫(kù)里，由固定氨基酸所構(gòu)成表位的數(shù)量將顯著性的大于由隨機(jī)氨基酸殘基所構(gòu)成表位的數(shù)量。通過(guò)基序免疫原文庫(kù)策略，文庫(kù)中沒有任何表位的數(shù)量能夠與固定氨基酸殘基構(gòu)成的目標(biāo)表位的數(shù)量形成競(jìng)爭(zhēng)，因此即使目標(biāo)表位的免疫原性非常弱，但因?yàn)槟繕?biāo)表位的數(shù)量在基序免疫原的文庫(kù)中遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它表位的數(shù)量，目標(biāo)表位在基序免疫原中也將能成為優(yōu)勢(shì)表位。綜上所述因?yàn)榛蛎庖咴茏屆庖呦到y(tǒng)集中在特定的目標(biāo)優(yōu)勢(shì)表位，所以基序免疫原能夠誘導(dǎo)出特異性抗體結(jié)合由任意氨基酸殘基構(gòu)成的表位，還能誘導(dǎo)出在人體內(nèi)或正常的動(dòng)物體內(nèi)的血液中不存在的特異性抗體。這里必須強(qiáng)調(diào)的是側(cè)翼氨基酸的隨機(jī)化程度將依據(jù)使用者的不同目的做出相應(yīng)調(diào)整，從而影響隨機(jī)化氨基酸序列的組成。隨機(jī)的氨基酸殘基可以是天然的，也可以是非天然的或經(jīng)人工修飾的；在一些特定的位置減少隨機(jī)化程度或改變隨機(jī)化序列中某些特定氨基酸的組成，也能影響固定序列的遞呈，從而誘導(dǎo)出所需的抗體。在本發(fā)明的代表事例中，由20種天然的氨基酸構(gòu)成隨機(jī)氨基酸。其實(shí)通過(guò)使用少于20種的隨機(jī)天然氨基酸或者添加一些其它的人造氨基酸也能達(dá)到增強(qiáng)目標(biāo)表位的抗原性同時(shí)減弱隨機(jī)氨基酸構(gòu)成的競(jìng)爭(zhēng)表位的抗原性，最終達(dá)到讓目標(biāo)表位成為優(yōu)勢(shì)表位的效果。如果多肽鏈中的I個(gè)位置上的殘基是由20種隨機(jī)氨基酸構(gòu)成的，那么這個(gè)多肽文庫(kù)將含有201=20種多肽鏈；如果多肽鏈中的2個(gè)位置上的殘基是由20種隨機(jī)氨基酸構(gòu)成的，這個(gè)多肽文庫(kù)將含有202=400種多肽鏈；如果多肽鏈中的3個(gè)位置上的殘基是由20種隨機(jī)氨基酸構(gòu)成的，那么這個(gè)多肽文庫(kù)將含有203=8000種多肽鏈；依次類推，如果多肽鏈中的10個(gè)位置上的殘基是由20種隨機(jī)氨基酸構(gòu)成的，那么這個(gè)多肽文庫(kù)將含有2010=1.024x1013種多肽鏈。在特定的條件下，使用常規(guī)的技術(shù)去改變特定氨基酸殘基在多肽合成原料中的比例從而改變隨機(jī)多肽庫(kù)的組成和免疫原性進(jìn)而去誘導(dǎo)不同的免疫反應(yīng)和特異性的抗體。通過(guò)常規(guī)技術(shù)可以偶聯(lián)糖基到一個(gè)或多個(gè)固定的氨基酸殘基上，從而合成糖肽再去誘導(dǎo)特異性針對(duì)糖肽的線性抗體或構(gòu)象抗體；也可以通過(guò)磺基化等手段去修飾特定的氨基酸殘基去誘導(dǎo)相應(yīng)的特異性抗體。引入非常規(guī)的氨基酸到多肽鏈中的隨機(jī)氨基酸區(qū)域，能夠顯著的增加多肽的穩(wěn)定性，進(jìn)而提高抗體的誘導(dǎo)和治療效果。出于同樣的原因，這個(gè)固定的氨基酸殘基也不是絕對(duì)的。因?yàn)樵诙嚯奈膸?kù)中特定的位置出現(xiàn)一定比例的氨基酸殘基會(huì)讓這些氨基酸殘基足夠的優(yōu)勢(shì)去達(dá)到優(yōu)勢(shì)表位；所以在整個(gè)多肽文庫(kù)中固定的位置，出現(xiàn)100%的氨基酸殘基就將會(huì)達(dá)到更好的免疫效果。綜上所述，該發(fā)明的應(yīng)用不受限于隨機(jī)氨基酸殘基的隨機(jī)化程度和固定的氨基酸殘基的固定化程度以及氨基酸殘基的類型。本發(fā)明的理論依據(jù)是通過(guò)隨機(jī)化氨基酸殘基去凸顯固定的氨基酸殘基的免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)或抗原性去誘導(dǎo)抗體；本發(fā)明可以依據(jù)實(shí)際需去調(diào)整固定氨基酸殘基和隨機(jī)化氨基酸的隨機(jī)程度。
[0011]作為本發(fā)明的一個(gè)代表，GPG基序多肽疫苗被應(yīng)用在哺乳動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)特異性針對(duì)GPG表位的抗體，這類抗體在以前的研究中從未被報(bào)道過(guò)。這個(gè)多肽文庫(kù)中的多肽鏈由15個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，序列為:XXXXX XGPGX XXXXC(圖9)。該多肽疫苗在本發(fā)明中被命名為V3M01。我們通過(guò)常規(guī)的技術(shù)免疫多肽疫苗，在Balb/c小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)了高滴度的針對(duì)GPG基序的抗血清。通過(guò)單克隆雜交瘤技術(shù)，獲得了多株雜交瘤單克隆細(xì)胞，該細(xì)胞能分泌特異性針對(duì)GPG表位的單克隆抗體。在HIV假病毒中和試驗(yàn)中，該GPG表位依賴的單克隆抗體能中和任何在HIV V3區(qū)的頂端含有GPG表位的HIV假病毒。除此之外，還可以通過(guò)類似的方法，運(yùn)用基序多肽疫苗去誘導(dǎo)針對(duì)弱抗原性表位的特定治療性相關(guān)抗體。
[0012]本發(fā)明也提供一些在病毒感染者體內(nèi)，該多肽疫苗治療的方法和治療的效果。
[0013]本發(fā)明提供特異性結(jié)合三個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的表位的抗體，并且該抗體的結(jié)合特異性不受這三個(gè)氨基 酸殘基的側(cè)翼氨基酸殘基的影響。例如特異性針對(duì)GPG表位的抗體，在阻止HIV感染中起到很重要的作用。在權(quán)利訴求中，闡述了本發(fā)明的各種不同的創(chuàng)新性。為了更好的理解本發(fā)明和發(fā)明的操作優(yōu)勢(shì)以及發(fā)明的特定目標(biāo)，圖表和相關(guān)的描述將會(huì)在后面繼續(xù)列出，圖表和文字將會(huì)繼續(xù)解釋該發(fā)明的代表實(shí)例?！緦＠綀D】

【附圖說(shuō)明】:
[0014]圖1，依據(jù)本發(fā)明，鑒定基序免疫原V3M01免疫小鼠所獲得5免后抗血清。AiElisa檢測(cè)抗血清的滴度，M01-M06對(duì)應(yīng)的為免疫小鼠的編號(hào)，blank-serum指未接受免疫的小鼠的空白血清。X軸顯示的數(shù)值乘以1000倍為小鼠血清梯度稀釋的倍數(shù)；B:小鼠抗血清結(jié)合不同HIV亞型的gpl20 (#，指血清和gpl20結(jié)合值與血清和陰性對(duì)照的牛血清白蛋白的結(jié)合值相比有顯著性，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異)。
[0015]圖2，圖中的標(biāo)示與圖1類似，該圖顯示通過(guò)免疫原V3M01免疫新西蘭大白兔免疫所獲得的抗血清的滴度，RO1-03中的R為兔子的英文簡(jiǎn)寫，01-03為兔子的編號(hào)。(將免疫原作為抗原)。
[0016]圖3，第五次免疫后兔抗血清結(jié)合基序多肽(A，B和C分別是3只兔子抗血清的結(jié)合反應(yīng));第五次免疫后兔抗血清結(jié)合gpl20 (D, E和F分別指3只兔子抗血清的結(jié)合反應(yīng))。
[0017]圖4，鑒定NJU009結(jié)合基序多肽(A)，HIV多肽(B)，HIV蛋白(C，D)。D為NJU009在濃度為100ug/ml時(shí)結(jié)合蛋白的柱狀圖。
[0018]圖5，NJU009單克隆抗體中和各種不同亞型的假病毒。
[0019]圖6，鑒定依據(jù)本發(fā)明免疫含有V2序列中部分氨基酸殘基的V2M01免疫原所誘導(dǎo)的兔抗血清(A)和Protein G親和純化的多克隆抗體(B)。
[0020]圖7，V2M01誘導(dǎo)的多克隆抗體R182，R183, R184(分別為A, B, C)與gpl20的結(jié)合 反應(yīng)。
[0021]圖8，鑒定依據(jù)本發(fā)明免疫原設(shè)計(jì)的針對(duì)gp41序列中部分氨基酸殘基所設(shè)計(jì)的gp41M01免疫原所誘導(dǎo)的第五次免疫后兔抗血清(A) ,Protein G親和純化的多克隆抗體(B)和多克隆抗體與gp41中的T20反應(yīng)。
[0022]圖9，顯示本發(fā)明中特殊代表實(shí)例中所設(shè)計(jì)多肽疫苗的氨基酸序列。X:代表隨機(jī)的任意氨基酸殘基，其它的字母代表氨基酸殘基的英文單字母簡(jiǎn)寫。
[0023]圖10，來(lái)自不同克隆的膜蛋白相關(guān)信息，以及在假病毒實(shí)驗(yàn)中，廣譜中和抗體對(duì)假病毒的中和敏感性?？贵w的濃度為通過(guò)Protein G親和純化抗血清或腹水所獲得的總抗體濃度。Nab concentrat1n or titer是指在病毒感染細(xì)胞達(dá)到50%抑制率時(shí)的抗體濃度或血清的稀釋度。陰性對(duì)照是指抑制MuLv假病毒的感染。ND:是指由于血清不夠沒做相關(guān)檢測(cè)。
[0024]圖11，依據(jù)本發(fā)明，針對(duì)流感病毒，丙型肝炎病毒和雞卵清白蛋白分別設(shè)計(jì)HAMOI, EMOl和0VAM01，圖中顯示這些免疫原所誘導(dǎo)的相應(yīng)抗血清的滴度鑒定。
[0025]圖12，V2M01是依據(jù)FYXXD基序設(shè)計(jì)的，固定的氨基酸殘基FY與D間隔2個(gè)隨機(jī)氨基酸殘基，以X表示；本圖中顯示抗體與V2M01疫苗多肽的結(jié)合反應(yīng)。
[0026]圖13，Gp41M01是依據(jù)LDXW基序設(shè)計(jì)的，固定的氨基酸殘基LD與W間隔I個(gè)隨機(jī)氨基酸殘基，以X表示；本圖中顯示抗體與gp41M01疫苗多肽的結(jié)合反應(yīng)。
【具體實(shí)施方式】
[0027]免瘡原構(gòu)律
[0028]免疫原基序多肽文庫(kù)(新型多肽疫苗)的序列是依據(jù)本發(fā)明以圖一的特殊代表實(shí)例來(lái)設(shè)計(jì)和說(shuō)明的；x代表除半胱氨酸以外的任意隨機(jī)氨基酸殘基。基序多肽文庫(kù)由上海吉爾生化有限公司合成。在多肽的羧基端，用下劃線標(biāo)示的半胱氨酸(cysteine，C)是為了方便偶聯(lián)載體蛋白。每條多肽免疫原被偶聯(lián)至匙孔血藍(lán)蛋白，為了方便酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunesorbent assay, ELISA)檢測(cè)，V3M01 被偶聯(lián)至牛血清白蛋白。
[0029]免疫小鼠和新西蘭大白兔
[0030]免疫原溶于磷酸鹽緩沖液(PBS, pH7.4)，濃度為lmg/ml。在第O周進(jìn)行初免，每只小鼠取100ullmg/ml的免疫原溶液與10ul弗氏完全佐劑進(jìn)行充分乳化，形成油包水的乳濁液，進(jìn)行多點(diǎn)腹部皮下注射免疫，免疫6只小鼠。分別在第2周、5周、8周、11周加強(qiáng)免疫4次，每次每只小鼠免疫50ullmg/ml的多肽溶液與50ul弗氏不完全佐劑的乳濁液；第6周、9周、12周采血。
[0031]免疫新西蘭大白兔，在第O周進(jìn)行初免，每只取500ullmg/ml的多肽溶液與500ul弗氏完全佐劑進(jìn)行充分乳化，形成油包水的乳濁液，進(jìn)行多點(diǎn)背部皮下注射免疫，免疫3只新西蘭大白兔。分別在第2周、5周、8周、11周加強(qiáng)免疫4次，每次每只免疫500ullmg/ml的多肽溶液與500ul弗氏不完全佐劑的乳濁液；第6周、9周、12周采血。小鼠和兔的抗血清通過(guò)Protein G/A親和純化獲得抗體。
[0032]單克隆抗體的制備
[0033]最后一次免疫后I周內(nèi)，將小鼠骨髓瘤細(xì)胞(Sp2/0)和免疫小鼠的脾細(xì)胞按常規(guī)PEG方法融合，有限稀釋法克隆細(xì)胞，間接ELISA篩選特異性抗體，陽(yáng)性細(xì)胞連續(xù)亞克隆2次，克隆化后的細(xì)胞株經(jīng)傳代確定為穩(wěn)定的細(xì)胞株后，液氮保存。將獲得的單克隆細(xì)胞株注射至腹腔，制備腹水，親和純化獲得單克隆抗體，單克隆抗體檢測(cè)試劑盒鑒定所獲得單克隆抗體的亞型。
[0034]酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗血 清效價(jià)
[0035]酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linkedimmunoassay, ELISA)檢測(cè)板以 10ug/ml 的濃度包被，每孔100ul，4°C孵育過(guò)夜后，用4%BSA封閉，每孔200ul，37°C孵育lh，洗滌4次，每孔加入梯度稀釋的抗血清10u (I對(duì)照為正常小鼠血清)，37°C孵育lh，洗滌4次，每孔加入1:1000稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗100ul，37°C孵育lh，洗滌5次后，加10ulP-NPP底物，37°C孵育15min，50ul2M的NaOH中止反應(yīng)，測(cè)定樣品在405nm波長(zhǎng)下的光密度值(optical density405nm, 0D405nm)。Elisa檢測(cè)血清的效價(jià)規(guī)定為在405nm的光密度值為空白對(duì)照(即不包被檢測(cè)原，圖中標(biāo)記為Neg) 2倍以上的最高稀釋倍數(shù)。
[0036]克隆全長(zhǎng)膜蛋白基因和包裝假病毒
[0037]從感染者體內(nèi)未培養(yǎng)的外周血單核細(xì)胞的前病毒DNA中PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)的膜蛋白基因。PCR設(shè)定的條件是預(yù)變性94oC2分鐘，運(yùn)行35個(gè)循環(huán)參數(shù)設(shè)置如下:94°C 15秒，55°C 30秒，68°C 4分鐘；最后延伸68°C 10分鐘。不同亞型的引物序列依據(jù)已公開的保守亞型序列來(lái)設(shè)計(jì)。PCR擴(kuò)增的片段被克隆至英俊公司的pcDNA3.1表達(dá)的質(zhì)粒載體，通過(guò)直接測(cè)序鑒定。通過(guò)共同轉(zhuǎn)染表達(dá)膜蛋白質(zhì)粒和表達(dá)骨架的pNL43R-E-Luc if erase質(zhì)粒至293細(xì)胞產(chǎn)生膜蛋白依賴的假病毒。對(duì)照的假病毒為表達(dá)HIV-1HXB2，SF162或JRFL的表面膜蛋白的假病毒以及兼噬性鼠源白血病假病毒。48小時(shí)后收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞上清，測(cè)定熒光值，標(biāo)準(zhǔn)化假病毒在后續(xù)功能分析中的用量。
[0038]抗血.清和單克隆抗體的假病毒中和試驗(yàn)[0039]收集的血清，純化的抗體以及購(gòu)買的廣譜中和抗體4E10，447_52D，bl2同時(shí)被用來(lái)做假病毒中和實(shí)驗(yàn)分析。所有的血清樣品在檢測(cè)前都經(jīng)過(guò)56°C I小時(shí)的熱滅活。200TCID50的假病毒與血清或抗體在96孔板內(nèi)，重復(fù)3個(gè)孔，37 °C孵育一個(gè)小時(shí)；加入IX 14個(gè)GH0ST(3)X4/R5細(xì)胞懸液于每個(gè)孔中，37°C 5%C02培養(yǎng)48hr。通過(guò)檢測(cè)熒光素酶的活性來(lái)判定中和活性。計(jì)算中和抑制率與中和滴度，抑制率=[1-(樣品組的RLU均值一細(xì)胞對(duì)照組CC的RLU均值)/ (病毒對(duì)照組VC的RLU均值一細(xì)胞對(duì)照組CC的RLU均值)]X100%。中和滴度(ID5tl)表述為50%抑制率時(shí)的稀釋度的倒數(shù)。
[0040]V3M01杭血清滴度測(cè)定
[0041]2免以后，6只小鼠(M01-06)均被成功誘導(dǎo)出特異性針對(duì)免疫原的抗血清(M01-06srm);在五次免疫以后，6只小鼠的抗血清ELISA滴度都大于10，000，空白血清不與免疫原反應(yīng)(blankSM)，且各小鼠的抗血清效價(jià)無(wú)顯著差異(圖.LA)。ELISA血清學(xué)分析顯示，該抗血清能識(shí)別HIV-1囊膜蛋白(gpl20ADA和gpl20IIIB)，但不與陰性對(duì)照蛋白BSA (不含GPG表位)結(jié)合(圖.1.B)。綜上所述6只小鼠都能被誘導(dǎo)出高滴度的針對(duì)免疫原的抗血清，并能與含有該表位的來(lái)源于不同毒株的膜蛋白有很強(qiáng)的結(jié)合反應(yīng)。
[0042]N.TU009單克隆抗體中和活性的鑒定
[0043]NJU009為根據(jù)單克隆雜交瘤技術(shù)篩選出的單克隆抗體中的中和活性較強(qiáng)的廣譜中和抗體。
[0044]假病毒中和體系檢驗(yàn)NJU009的中和活性；假病毒由11個(gè)初級(jí)分離株和2個(gè)實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)株構(gòu)成。其病毒亞型有B、B'、C、B'C、CRF07_BC> CRF08_BC、CRF01_AE等不同亞型的假病毒。13株 中的11株假病毒能被NJU009很好的中和，其50%的中和濃度(50%Neutralizat1n Dose, ND50)的范圍為抑制 B' C 亞型 CNE16 的 3.7ug/ml 到抑制 C 亞型CNE58的20.5ug/ml;與此同時(shí)NJU009不能中和假病毒CNE6和CNElI。JR-FL假病毒為CCR5依賴的毒株，結(jié)合V3的抗體向來(lái)對(duì)該毒株沒有很強(qiáng)的中和活性。NJU009中和JR-FL假病毒毒株的ND5tl為27.8ug/ml,針對(duì)CXCR4依賴的HXB2假病毒毒株的ND50為34ug/ml.[0045]NJU009能中和幾乎所有不同亞型的HIV-1毒株，中和曲線緊密的聚攏在一起說(shuō)明NJU009的中和活性不受GPG側(cè)翼氨基酸殘基變化的影響。其中CNE6和CNEll (均為B’亞型)對(duì)NJU009的中和作用完全不敏感，序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)在V3PND區(qū)，2個(gè)病毒的V3PND區(qū)均為極其罕見的序列，CNE6為GLG，而CNEll為GQG，二者均不是常見的GPG序列。該結(jié)果說(shuō)明，NJU009的中和活性是由GPG序列特異性介導(dǎo)的。
[0046]假病毒中和實(shí)驗(yàn)中，我們以不依賴CD4受體和輔助受體的MuLv假病毒為陰性對(duì)照，我們以鑒定出免疫學(xué)性質(zhì)的廣譜中和抗體作為陽(yáng)性對(duì)照抗體，選取的廣譜中和抗體有447-52D，bl2和4E10 ;這些陽(yáng)性抗體的中和活性在本實(shí)驗(yàn)中的中和效果與其它文獻(xiàn)檢測(cè)效果基本一致，證明本發(fā)明的假病毒中和實(shí)驗(yàn)重復(fù)性很好。447-52D是迄今為止在針對(duì)V3的中和表位(GPGR)中，中和廣譜性最廣的單克隆抗體；針對(duì)HXB2和JR-FL兩個(gè)毒株的ND5tl分別為0.737ug/ml和19ug/ml。447-52D能很好的中和CFR07_BC亞型的CNE40假病毒毒株，該毒株是我們這個(gè)假病毒中和系統(tǒng)里是最容易被中和的毒株。447-52D抑制CNE40的ND5tl為0.14ug/ml。然而447-52D不能中和其它的毒株。bl2為針對(duì)⑶4結(jié)合表位的特異性抗體，能中和13株假病毒毒株中的7株，ND50的范圍為抑制HXB2的0.119ug/ml到抑制CNE5的23.07ug/ml。4E10是針對(duì)gp41近膜區(qū)表位的廣譜中和抗體，能中和所有的13株假病毒。[0047]表位鑒定
[0048]為確定NJU009的廣譜中和活性完全是由GPG所介導(dǎo)而不是由周邊的氨基酸殘基所參與的，我們對(duì)NJU009與抗原反應(yīng)的特異性進(jìn)行了分析。當(dāng)將GPG3個(gè)氨基酸殘基突變?yōu)?個(gè)丙氨酸(Alanine，A)時(shí)，NJU009完全不與突變的多肽結(jié)合(圖2)說(shuō)明NJU009對(duì)V3的識(shí)別是高度GPG特異性，這與假病毒中和活性的觀察一致。該結(jié)果同時(shí)也說(shuō)明GPG三個(gè)殘基可能均是NJU009靶位的直接組成部分。NJU009能結(jié)合來(lái)自不同亞型的V3多肽和含有GPG的不同亞型gpl20，像gpU0.(B亞型)、gpl20BC (BC亞型)和gpl20IIIB (B亞型)。這些結(jié)果都說(shuō)明NJU009是GPG表位依賴的不受側(cè)翼氨基酸殘基影響的單克隆抗體。通過(guò)RT-PCR我們測(cè)得了 6個(gè)單克隆抗體的Fv區(qū)的氨基酸序列。其中NJU001，NJU003, NJU005三個(gè)單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列完全一致，NJU007，NJU008和NJU009的輕鏈可變區(qū)序列也是一致。這些結(jié)果顯示NJU001，NJU003, NJU005很可能來(lái)源于同一個(gè)前體雜交瘤細(xì)胞；NJU007，NJU008和NJU009將是來(lái)源于另一個(gè)前體雜交瘤細(xì)胞。這些克隆之間的主要差異序列是位于互補(bǔ)決定區(qū)和輕鏈可變區(qū)羧基端序列。
[0049]NJU009和447-52D均能識(shí)別V3區(qū)的頂端的氨基酸序列。447-52D競(jìng)爭(zhēng)NJU009結(jié)合V3多肽的競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)果顯示競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合曲線呈二相曲線(b1-phasic)，在447-52D濃度小于6.25ug/ml時(shí)，隨著447-52D濃度的提高，NJU009結(jié)合gpl20的量依次減弱，最高減少85%的結(jié)合。然而結(jié)合在gpl20上剩下15%的NJU009需要被多達(dá)15倍濃度的447-52D去競(jìng)爭(zhēng)掉(圖2)。這些結(jié)果說(shuō)明NJU009與447-52D的抗體表位有交叉。有大約10%NJU009的結(jié)合活性不易受高濃度447-52D影響。
[0050]基序免疫原的可誘導(dǎo)性和動(dòng)物特異性
[0051]為了鑒定V 3M01的免疫效果是否具有種屬特異性，3只新西蘭大白兔(R01-03)通過(guò)類似小鼠的免疫策略接種V3M01免疫原。結(jié)果誘導(dǎo)出了具有相似特異性的血清抗體，5免效價(jià)為42，000 (圖2)。所有血清抗體均能識(shí)別gpl20IIIB和gpl20ADA，和gpl20B’c。這些血清同樣具有類似的中和活性和GPG表位依賴性。這些結(jié)果說(shuō)明該免疫原誘導(dǎo)抗體不受動(dòng)物種屬的限制，能在任何種屬的動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)出類似的廣譜中和抗體。
[0052]基序免疫方法的廣泛應(yīng)用
[0053]為了說(shuō)明本發(fā)明中的基序免疫靶向誘導(dǎo)抗體不僅適用于誘導(dǎo)針對(duì)GPG表位的多肽，還能被應(yīng)用于其它表位的靶向抗體誘導(dǎo)，我們選擇了 gpl20上一些其它序列作為靶向誘導(dǎo)的表位；這些表位是已知有免疫原性的表位，但通過(guò)常規(guī)的免疫方法很難誘導(dǎo)出針對(duì)該表位的抗體。HIV膜蛋白表面的第一個(gè)可變區(qū)(Variable Reg1nl，Vl)和第二個(gè)可變區(qū)(Variable Reg1n2, V2)介導(dǎo)廣譜交叉中和活性,但很少有針對(duì)這些結(jié)構(gòu)域的抗體被誘導(dǎo)出來(lái)。我們?cè)赩2的頂端選擇了 FYXXD作為靶向表位，原因如下:(1)最近從感染者體內(nèi)分離了兩個(gè)廣譜的中和抗體，PG9和PG16，這兩個(gè)抗體表位在V2和V3區(qū)；氨基酸點(diǎn)突變發(fā)現(xiàn)，將第176位苯丙氨酸(Phenylalanine，F(xiàn))殘基突變?yōu)锳時(shí)，兩個(gè)抗體的抑制病毒感染的IC5tl分別增加了 5000倍和7000倍；(2)第180位的天冬氨酸(Aspartic acid, D)是整合素α4β7結(jié)合序列LDL中的氨基酸殘基，而整合素α 4β 7是結(jié)合外周T細(xì)胞的腸粘膜看家受體；(3)第178位的賴氨酸(Lysine，K)和第179為的亮氨酸(Leucine，L)在HIV毒株中不是高度保守，在V2頂端只有F176，Y177和D180是高度保守的，其保守率分別是93%，91%和96%。因此這三個(gè)氨基酸殘基被構(gòu)建在針對(duì)V2的基序免疫原中。通過(guò)化學(xué)合成15個(gè)氨基酸殘基的多肽文庫(kù)，在多肽文庫(kù)中Y177和D180被間隔兩個(gè)氨基酸殘基，多肽文庫(kù)被命名為V2M01。在新西蘭大白兔皮下免疫V2M01，5次免疫后，抗血清的ELISA滴度大于80000 (圖9和圖12)。該抗血清與不同亞型的gpl20蛋白(分別是8?120湯4?12(^和gpl20IIIB)有很強(qiáng)的結(jié)合反應(yīng)，還能結(jié)合重組的V2糖蛋白；然而這些抗體沒有顯示很強(qiáng)的中和活性。Gp41近膜區(qū)(Membrane Proximal External Reg1n, MPER)是一個(gè)廣譜中和表位，針對(duì)該表位的廣譜中和抗體有4E10和2F5。這兩個(gè)抗體都是從感染者體內(nèi)篩選得到，有大量的試驗(yàn)去試圖誘導(dǎo)針對(duì)該表位的類似于4E10和2F5抗體，但都未能成功。2F5的抗體表位是ELDKWA，這個(gè)表位中高度保守的氨基酸殘基是L663，D664, W666 ;其保守率分別為98%，97%和99%。因此我們?cè)O(shè)計(jì)了含有這些氨基酸殘基，LDXff,的15個(gè)氨基酸的多肽文庫(kù)去誘導(dǎo)抗體，所誘導(dǎo)的抗體能很好的結(jié)合T20 (圖9和圖13)。
[0054]基于以上結(jié)果，通過(guò)本發(fā)明中的靶向抗體誘導(dǎo)技術(shù)能夠誘導(dǎo)出未知表位和任意氨基酸所構(gòu)成的表位抗體。我們?cè)O(shè)計(jì)了三個(gè)多肽文庫(kù)，分別為HAM01，OVAMOI, EMOl ;它們分別來(lái)源于流感病毒，丙型肝炎病毒和雞卵清白蛋白。HAMOl中三個(gè)固定的連續(xù)氨基酸為HHP，這三個(gè)氨基酸位于流感病毒HAl蛋白的第199位到201位，是三個(gè)高度保守的氨基酸，存在于流感病毒的不同亞型毒株中；目前僅有一個(gè)流感病毒的廣譜中和抗體S139/1的表位含有HHP。EMOI含有的三個(gè)連續(xù)的固定氨基酸殘基為HRM，這三個(gè)氨基酸殘基位于丙型肝炎病毒El蛋白的第316位至318位，它們也是高度保守的氨基酸。0VAM01含有的固定氨基酸是位于雞卵清白蛋白第276位至278位的ERK。這三條多肽文庫(kù)均誘導(dǎo)出了高滴度的抗體(圖 11)。
[0055]不作為本發(fā)明的一部分，只是作為本發(fā)明的假設(shè)；我們的假設(shè)認(rèn)為，本發(fā)明的策略是通過(guò)最小化側(cè)翼氨基酸序列對(duì)選定表位的影響來(lái)讓選定的表位凸顯出來(lái)，易于讓免疫系統(tǒng)識(shí)別。目前我們所獲的針對(duì)GPG表位的抗體是唯一的；至今為止，從感染者體內(nèi)沒有篩選到任何針對(duì)GPG表位的 抗體，只有部分針對(duì)GPGR和GPGQ表位的抗體。這些結(jié)果說(shuō)明GPG表位在天然的病毒感染過(guò)程中，很難被免疫系統(tǒng)識(shí)別或者說(shuō)只有少量的B細(xì)胞克隆能夠識(shí)別GPG表位，但是在克隆擴(kuò)增時(shí)，該類B細(xì)胞克隆可能被丟失。機(jī)制研究表明與GPG表位相t匕，GPGR，GPGQ或者GPGK在克隆擴(kuò)增時(shí)都是優(yōu)勢(shì)表位，因此在天然感染過(guò)程中，針對(duì)GPG表位的克隆最終會(huì)被丟失。核磁共振通常被用來(lái)研究V3多肽和一序列相關(guān)抗體的相互作用。
0.5 β是個(gè)典型的特異性針對(duì)V3的抗體，能夠結(jié)合到V3多肽的16個(gè)氨基酸殘基。447-52D是針對(duì)V3表位最為廣譜的中和抗體，能夠通過(guò)結(jié)合GPGR位點(diǎn)的氨基酸殘基與V3多肽發(fā)生相互作用；而與0.5β直接結(jié)合的氨基酸殘基更多，最終在與V3多肽結(jié)合時(shí)也顯示了的更高的親和力和結(jié)合剛性度。因?yàn)镹JU009只結(jié)合V3頂端的三個(gè)氨基酸殘基，且結(jié)合活性不受這三個(gè)氨基酸殘基周邊的氨基酸的影響，所以NJU009在與V3多肽的結(jié)合過(guò)程中，具有更好的柔性。這或許也是NJU009中和活性最為廣譜的原因之一。
[0056]綜上所述，本發(fā)明將在多肽疫苗應(yīng)用于臨床治療的過(guò)程中具有重要意義。除此之外，根據(jù)本發(fā)明我們還可以將任意的序列嵌合至多肽或蛋白中作為檢測(cè)或純化的標(biāo)簽。
[0057]V2M01 和 gp41M01 的杭血清
[0058]圖6A和8A顯示V2M01和gp41M01免疫新西蘭大白兔后的抗血清能特異性的結(jié)合基序免疫原。而且V2M01的抗血清能與不同亞型的gpl20反應(yīng)。gp41的多肽T20含有基序中的固定氨基酸LDXW ；Gp41M01誘導(dǎo)的抗血清也能很好的結(jié)合T20。[0059]本發(fā)明的基本創(chuàng)新點(diǎn)已按照應(yīng)用的代表實(shí)例被描述出來(lái)。在代表實(shí)例中各種不同的省略，替換和改變都是依據(jù)本發(fā)明的思想來(lái)執(zhí)行的。本發(fā)明不只限制于以上所提到代表實(shí)例的應(yīng)用；以上提到的代表實(shí)例僅僅是一個(gè)為了方便說(shuō)明的例子而已。實(shí)際上該發(fā)明還能像附頁(yè)里專利權(quán)利訴求里提到的那樣，可以運(yùn)用各種不同方式的修飾；雖然沒有提及具體的例子，但本 發(fā)明是有很強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。因?yàn)楸景l(fā)明中所使用的都是常規(guī)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，但發(fā)明中的思想，思路和觀點(diǎn)是創(chuàng)新的。一旦本發(fā)明的思想，思路和觀點(diǎn)被闡述出來(lái)，該發(fā)明就能很簡(jiǎn)單的應(yīng)用在常規(guī)的【技術(shù)領(lǐng)域】去起得創(chuàng)新的成果。
【權(quán)利要求】
1.一種多肽疫苗包含一個(gè)多肽庫(kù)其多肽在一些位置會(huì)有相同固定的氨基酸殘基,而在另一些位置則為隨機(jī)的氨基酸殘基。
2.權(quán)利要求1中的多肽疫苗其中固定氨基酸殘基的個(gè)數(shù)為3個(gè)。
3.權(quán)利要求2中的多肽疫苗其中固定氨基酸殘基是在連續(xù)的位置上。
4.權(quán)利要求2中的多肽疫苗其中固定氨基酸殘基可以不在連續(xù)位置上，而是被一個(gè)或者多個(gè)隨機(jī)氨基酸殘基隔開。
5.權(quán)利要求1中的多肽疫苗其中固定氨基酸殘基的側(cè)翼由隨機(jī)氨基酸殘基構(gòu)成。
6.權(quán)利要求1中的多肽疫苗，其中隨機(jī)氨基酸的個(gè)數(shù)可以是5個(gè)到50個(gè)之間。
7.權(quán)利要求6中的多肽疫苗，其中隨機(jī)氨基酸殘基的個(gè)數(shù)為11個(gè)。
8.一種治療病毒感染的方法，其中使用多條疫苗是一個(gè)多肽混合物，這個(gè)多肽混合物是一個(gè)多肽文庫(kù)；該多肽文庫(kù)含有多個(gè)固定的氨基酸殘基和多個(gè)隨機(jī)的氨基酸殘基。
9.權(quán)利要求8方法中所提到的病毒感染是指被HIV引起的。
10.權(quán)利要求9方法中所提到的病毒感染是指在人體內(nèi)。
11.權(quán)利要求10方法中含有上述多肽疫苗的制作方法和上述多肽疫苗對(duì)人體治療效 果。
12.權(quán)利要求8方法中所說(shuō)的混合物多肽中至少含有400種類別。
13.權(quán)利要求12方法中所說(shuō)的混合物多肽中至少含有8000種類別。
14.一個(gè)抗體能特異性識(shí)別僅由三個(gè)氨基酸構(gòu)成的表位，并且不會(huì)受表位氨基酸的側(cè)翼氨基酸殘基影響；上文中所提到的3個(gè)氨基酸殘基在被誘導(dǎo)的抗體識(shí)別時(shí)也不會(huì)受側(cè)翼氨基酸的影響。
15.權(quán)利要求14中的抗體，所提到的3個(gè)氨基酸殘基是指GPG.
16.權(quán)利要求14中的抗體，所提到的抗體是抗血清。
17.權(quán)利要求14中的抗體，所提到的抗體是多克隆抗體和單克隆抗體。
18.權(quán)利要求1中的多肽疫苗，多肽文庫(kù)含有至少400種不同類別的多肽。
19.權(quán)利要求18中的多肽疫苗，多肽文庫(kù)含有至少800種不同類別的多肽。
【文檔編號(hào)】A61K38/17GK104039350SQ201280045106
【公開日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2012年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月17日
【發(fā)明者】吳稚偉, 吳喜林 申請(qǐng)人:蘇州納奧新材料科技有限公司