本發(fā)明涉及生物技術(shù)和醫(yī)學領(lǐng)域，特別涉及人類免疫缺陷病毒(hiv)重組蛋白的生產(chǎn)和應(yīng)用的生物技術(shù)和醫(yī)學免疫診斷領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，hiv)引起的艾滋病在20世紀80年代發(fā)現(xiàn)以來，已傳遍全球。據(jù)聯(lián)合國艾滋病總署報告，截止2010年底，全球感染艾滋病人數(shù)達3700萬。我國目前大約有hiv感染者70余萬。hiv會破壞人體的免疫能力，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)市區(qū)抵抗力，從而導(dǎo)致各種疾病和癌癥在人體內(nèi)生存，發(fā)展到最后導(dǎo)致艾滋病。迄今為止尚無有效藥物及疫苗來治療和預(yù)防艾滋病，因而hiv感染已成為當今全球威脅最嚴重的傳染病及公共衛(wèi)生問題。
hiv病毒是帶有包膜的rna逆轉(zhuǎn)錄病毒，其單拷貝基因rna全長約9.2-9.7kb。hiv有三個主要結(jié)構(gòu)基因：env、gag、pol，它們分別編碼產(chǎn)生不同功能的蛋白質(zhì)即抗原。hiv侵入機體后，一般在6周左右產(chǎn)生抗體。血清中首先出現(xiàn)的是hiv前體p55抗體和核心蛋白p24抗體；然后出現(xiàn)外包膜蛋白gp120抗體和跨膜糖蛋白gp41抗體。目前發(fā)現(xiàn)hiv有hiv-1、hiv-2、o型等，這幾種類型在生物學特性上很相似，它們基因組有40％-50％的同源性。目前，我國流行的主要是hiv-1型。
由于hiv抗原和核酸檢測所使用的儀器、試劑、人力成本過高，占據(jù)hiv檢測市場主流的還是hiv抗體檢測。目前，hiv抗體檢測原料一方面朝著提高靈敏度和特異性，縮短窗口期的方向發(fā)展，另一方面朝著簡便快速的方向發(fā)展。為了順應(yīng)以上發(fā)展趨勢，本發(fā)明公開了一種可以應(yīng)用于hiv-1抗體檢測的hiv-1重組蛋白。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
在一些實施方案中，本文提供一種人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)，其包含與seqidno：1所示的氨基酸序列具有至少94％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，84％，83％，82％，81％，80％，75％，70％，65％，60％，55％，或50％的序列同一性的多肽，
seqidno：1：
其中所述多肽與seqidno：1所示的氨基酸序列第53、85、98、105、109、111、132和133的八個位點的氨基酸k，k，r，n，s，q，e和s相對應(yīng)的氨基酸分別置換為下述氨基酸：
酸性脂肪族氨基酸e或q，
酸性脂肪族氨基酸e或d或q，
k，
芳香族氨基酸f或y，
r或t，
中性氨基酸l或i，
堿性帶正電荷的r基氨基酸k或r或h，和
非羥基氨基酸v或n。
在一些實施方案中，所述人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)能夠特異性結(jié)合hiv的抗體(例如hiv感染者如hiv-1感染者產(chǎn)生的hiv抗體)。在一些實施方案中，所述人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)能夠用于診斷受試者是否感染hiv如hiv-1。
在一些實施方案中，所述多肽進一步包含seqidno：1所示的氨基酸序列第106、120和139位點中的一個或多個氨基酸置換，其中所述置換選自t106e、r120k和n139d，其中中間的數(shù)字106、120、139表示位置，數(shù)字前面的氨基酸表示原seqidno：1中的氨基酸，數(shù)字后的氨基酸表示置換后的氨基酸(本說明書其它部分進行此類描述表示同樣的含義)。在一些實施方案中，所述多肽在上述第53、85、98、105、109、111、132和133的八個位點的氨基酸置換之外，進一步包含t106e。在一些實施方案中，所述多肽在上述第53、85、98、105、109、111、132和133的八個位點的氨基酸置換之外，進一步包含r120k。在一些實施方案中，所述多肽在上述第53、85、98、105、109、111、132和133的八個位點的氨基酸置換之外，進一步包含n139d。在一些實施方案中，所述多肽在上述第53、85、98、105、109、111、132和133的八個位點的氨基酸置換之外，進一步包含t106e和r120k。在一些實施方案中，所述多肽在上述第53、85、98、105、109、111、132和133的八個位點的氨基酸置換之外，進一步包含t106e和n139d。在一些實施方案中，所述多肽在上述第53、85、98、105、109、111、132和133的八個位點的氨基酸置換之外，進一步包含r120k和n139d。在一些實施方案中，所述多肽在上述第53、85、98、105、109、111、132和133的八個位點的氨基酸置換之外，進一步包含t106e、r120k和n139d。
在一些實施方案中，進一步包含上述置換的所述人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)能夠特異性結(jié)合hiv的抗體(例如hiv感染者如hiv-1感染者產(chǎn)生的hiv抗體)。在一些實施方案中，所述人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)能夠優(yōu)選的以更高的靈敏度用于診斷受試者是否感染hiv如hiv-1。
在一些實施方案中，所述的人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)與seqidno：1所示的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％或至少94％的序列同一性，例如其與seqidno：1所示的氨基酸序列的區(qū)別僅在于所述八個位點的氨基酸不同，例如其與seqidno：1所示的氨基酸序列的區(qū)別僅在于第53、85、98、105、109、111、132、133位點和選自第106、120和139位點三個位點中的任意一個或多個位點的氨基酸不同(即僅存在九、十或十一個位點的不同)。
在一些實施方案中，本文提供一種核酸，其編碼本文描述的人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)。
在一些實施方案中，本文提供一種載體，其包含本文描述的核酸。
在一些實施方案中，本文提供一種宿主細胞，其包含本文描述的核酸或的載體。
在一些實施方案中，本文提供一種試劑盒，其包含本文描述的人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)，本文描述的核酸或本文描述的載體。
在一些實施方案中，所述試劑盒還包括用于標記所述人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)的標記，如酶標記、膠體金標記等。
在一些實施方案中，本文提供一種生產(chǎn)本文描述的人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)的方法，其包括制備本文描述的核酸或本文描述的載體的步驟。
在一些實施方案中，本文提供一種組合物，其包含本文描述的人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)。
在一些實施方案中，本文提供本文描述的人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)在制備用于檢測人類免疫缺陷病毒感染的檢測劑或試劑盒中的用途。
在一些實施方案中，本文提供包含來自如下序列的部分或全部的至少30個連續(xù)氨基酸的多肽：
seqidno：2：
其中第n位的xaa以xn表示，其中
x53是k，e或q，優(yōu)選是e或q，
x85是k，e或d或q，優(yōu)選是e或d或q，
x98是r，k，優(yōu)選是k，
x105是n，f或y，優(yōu)選是f或y，
x106是t，e，優(yōu)選是e，
x109是s，r或t，優(yōu)選是r或t，
x111是q，l或i，優(yōu)選是l或i，
x120是r，k，優(yōu)選是k，
x132是e，k或r或h，優(yōu)選是k或r或h，
x133是s，v或n，優(yōu)選是v或n，
x139是n，d，優(yōu)選是d。
在一些實施方案中，本文提供的所述多肽的序列包括seqidno：2所示的序列，同時所述多肽相對于seqidno：1所示序列存在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11個氨基酸置換。
在一些實施方案中，在seqidno：2所示序列中：
x53是e或q，
x85是e或d或q，
x98是r，
x105是f或y，
x106是t，
x109是r，
x111是l或i，
x120是r，
x132是k或r或h，
x133是v或n，
x139是n，
其余位置的氨基酸如上文所述。
在一些實施方案中，在seqidno：2所示序列中：
x53是e或q，
x85是e或d或q，
x98是r或k，
x105是f或y，
x106是t或e，
x109是r或t，
x111是l或i，
x120是r或k，
x132是k或r或h，
x133是v或n，
x139是n或d，
其余位置的氨基酸如上文所述。
在一些實施方案中，所述多肽或人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)能夠特異性結(jié)合hiv的抗體(例如hiv感染者如hiv-1感染者產(chǎn)生的hiv抗體)。在一些實施方案中，所述人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)能夠用于診斷受試者是否感染hiv如hiv-1。
在一些實施方案中，在seqidno：2所示序列中：
x53是e或q，
x85是e或d或q，
x98是k，
x105是f或y，
x106是e，
x109是t，
x111是l或i，
x120是k，
x132是k或r或h，
x133是v或n，
x139是d，
其余位置的氨基酸如上文所述。
在一些實施方案中，人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)包含上述seqidno：2部分或全部的至少30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130個連續(xù)氨基酸的多肽。在一些實施方案中，人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)包含上述seqidno：2全長的多肽。在一些實施方案中，人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)由上述seqidno：2全長的多肽組成。
在一些實施方案中，上述人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)能夠特異性結(jié)合hiv的抗體(例如hiv感染者如hiv-1感染者產(chǎn)生的hiv抗體)。在一些實施方案中，上述人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)能夠優(yōu)選的以更高的靈敏度用于診斷受試者是否感染hiv如hiv-1。
在一些實施方案中，本文提供一種人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)，其特征在于該重組蛋白質(zhì)含有下述的一種序列x1-x2-x3……x139-x140-x141(seqidno：1)，其中：
k，x53是e或q；
k，x85是e或d或q；
r，x98是k；
n，x105是f或y；
t，x106是t或e；
s，x109是r或t；
q，x111是l或i；
r，x120是k；
e，x132是k或r或h；
s，x133是v或n；和/或
n，x139是d；
在一些實施方案中，本文提供一種載體如質(zhì)粒載體，該質(zhì)粒載體含有能夠編碼與本文描述的序列具有90％同源性的重組蛋白的多核苷酸序列。
在一些實施方案中，本文提供一種載體如質(zhì)粒載體，該質(zhì)粒載體含有能夠編碼本文描述的重組蛋白質(zhì)的多核苷酸序列。
在一些實施方案中，本文提供一種采用本文描述的載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
在一些實施方案中，本文提供一種本文描述的重組蛋白質(zhì)的方法，包括：
(a)將編碼具有所述重組蛋白質(zhì)的多核苷酸序列連于載體如質(zhì)粒載體，形成重組質(zhì)粒；
(b)將步驟(a)中的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主細胞，形成轉(zhuǎn)化子細胞；
(c)在適合的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的轉(zhuǎn)化子細胞，表達該重組蛋白質(zhì)；
(d)分離純化出該重組蛋白質(zhì)。
在一些實施方案中，本文提供包括所述人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)的制品，如微量滴定板(其上可以包被有所述人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì))。
在一些實施方案中，本文提供含有本文描述的重組蛋白質(zhì)的hiv抗體檢測試劑盒。
在一些實施方案中，所述檢測試劑盒可以包括例如上述微量滴定板。在一些實施方案中，所述試劑盒中還可以包括容器，其中包含例如對hiv抗體具有親和力的第二抗體。
在一些實施方案中，本文提供的人類免疫缺陷病毒重組蛋白，能夠特異性結(jié)合早期hiv抗體。在一些實施方案中，本文提供的人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)能夠用于檢測hiv-1的抗體。在一些實施方案中，本文提供的人類免疫缺陷病毒重組蛋白用于檢測hiv-1的抗體具有活性高，特異性好等特點。
在一些實施方案中，本文提供檢測如早期檢測hiv感染的方法，所述方法包括將來自受試者的樣品如血液樣品與本文提供的人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)接觸，由此確定是否感染hiv。
在一些實施方案中，本文提供人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)，其用于檢測如早期檢測hiv感染，或用于篩選hiv感染的患者。
發(fā)明人已經(jīng)令人吃驚的發(fā)現(xiàn)本文提供的序列與不具有所述一個或多個突變(例如不具有第53、85、98、105、109、111、132、133、106、120和139位點中的一個或多個位點的突變)的對照序列相比具有更好的效果，例如提高的靈敏度和/或特異性。在一些實施方案中，本文提供的重組蛋白、檢測試劑盒或檢測方法在檢測如早期檢測hiv感染或篩選hiv感染的患者時具有提高的靈敏度和/或特異性。在一些實施方案中，本文提供的重組蛋白、檢測試劑盒或檢測方法具有大于99％、大于99.1％、大于99.2％、大于99.3％、大于99.4％、大于99.5％、大于99.6％、大于99.7％、大于99.8％、大于99.9％的靈敏度。在一些實施方案中，本文提供的重組蛋白、檢測試劑盒或檢測方法具有99.5％以上、99.6％以上、大于99.7以上、大于99.8以上、大于99.9以上或具有100％的靈敏度。在一些實施方案中，本文提供的重組蛋白、檢測試劑盒或檢測方法具有大于99.4％(如99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上或更高)的特異性。
在一些實施方案中，本文提供獲得或設(shè)計用于檢測hiv的重組蛋白的方法，所述方法可以包括以下步驟中的一個或多個：
選取人類免疫缺陷病毒包膜蛋白，選取蛋白的部分區(qū)段，并對其中部分位點做突變設(shè)計，通過表達純化制備相應(yīng)的重組蛋白，通過活性及特異性篩選，獲得活性高，特異性好的重組蛋白；
合成序列片段，并連接到載體如pmd18-t載體上，構(gòu)建含有目的片段的t載體；
通過定點突變設(shè)計，構(gòu)建含有特定突變目的片段的載體如pmd18-t載體；
重組蛋白的制備方法：設(shè)計上游引物(例如帶ecori酶切位點)和下游引物(例如帶bamhi酶切位點)，以含有目的片段的載體如t載體為模板，擴增目的基因，雙酶切并純化后連接到載體如pet-28a上，轉(zhuǎn)化細胞如大腸桿菌bl21；篩選得到陽性克隆后，挑取單菌落接種到培養(yǎng)基如含50ul/mlkan的lb培養(yǎng)基中，在適當溫度如37度震蕩培養(yǎng)；待od600達到0.6-0.8后，加入1.0mmiptg，37度誘導(dǎo)培養(yǎng)2-4h，提取總蛋白，sds-page鑒定重組蛋白表達情況；用ni離子螯合柱對目的蛋白進行第一次純化，用sp柱對目的蛋白進行第二次純化，sds-page鑒定重組蛋白的純度。
通過本文描述的方法可以獲得高純度的重組蛋白，其能夠用于hiv-1的抗體檢測。
具體實施方式
以下對本發(fā)明的具體實施方式進行詳細說明，所描述的各個具體實施方式不是限制性的，并且可以相互組合。
氨基酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)
術(shù)語“氨基酸”表示天然存在或非天然存在的羧基α-氨基酸。術(shù)語“氨基酸”用在本申請中可以包括天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸。天然存在的氨基酸包括丙氨酸(三字母密碼：ala，單字母密碼：a)，精氨酸(arg，r)，天冬酰胺(asn，n)，天冬氨酸(asp，d)，半胱氨酸(cys，c)，谷氨酰胺(gln，q)，谷氨酸(glu，e)，甘氨酸(gly，g)，組氨酸(his，h)，異亮氨酸(ile，i)，亮氨酸(leu，l)，賴氨酸(lys，k)，甲硫氨酸(met，m)，苯丙氨酸(phe，f)，脯氨酸(pro，p)，絲氨酸(ser，s)，蘇氨酸(thr，t)，色氨酸(trp，w)，酪氨酸(tyr，y)，和纈氨酸(val，v)。非天然存在的氨基酸包括但不限于α-氨基己二酸，氨基丁酸，瓜氨酸，高瓜氨酸，高亮氨酸，高精氨酸，羥基脯氨酸，正亮氨酸，吡啶基丙氨酸，肌氨酸等等。
在本文中，肽、多肽、蛋白質(zhì)不作嚴格區(qū)分，在一些情形中可以相互替代使用，一般指通過肽鍵連接的氨基酸組成的聚合物，不管是天然產(chǎn)生的還是合成的。多肽也可以包含非氨基酸成分，如碳水化合物基團、金屬離子或羧酸酯。非氨基酸成分可以是由表達所述多肽的細胞所加入的，并且可以隨細胞類型而不同。多肽在本文中關(guān)于其氨基酸骨架結(jié)構(gòu)或編碼其的核酸而限定。如碳水化合物基團的添加通常沒有規(guī)定，但是，是可以存在的。所有的多肽序列按照通常接受的慣例書寫，其中α-n-端氨基酸殘基在左側(cè)，且α-c-端氨基酸殘基在右側(cè)。當用于本文時，術(shù)語“n-端”是指多肽中氨基酸的游離的α-氨基基團，術(shù)語“c-端”是指多肽中氨基酸的游離的a-羧酸端。在n-端以某基團結(jié)束的多肽是指在n-端氨基酸殘基的α-氨基氮上攜帶基團的多肽。在n-端以某基團結(jié)束的氨基酸是指在α-氨基氮上攜帶基團的氨基酸。
“保守”氨基酸置換是其中氨基酸殘基被帶有具有相似理化性質(zhì)的側(cè)鏈的氨基酸殘基置換的那些置換。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族在本領(lǐng)域中是已知的，并且包括帶有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，帶有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，帶有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，帶有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，帶有β分支側(cè)鏈的氨基酸(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和帶有芳香族側(cè)鏈的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。保守氨基酸置換的特殊形式包括用不在由遺傳密碼編碼的正常的20個氨基酸中的氨基酸置換的那些。本發(fā)明的實施方案可以使用合成肽，因此在本文公開的肽中可以使用這種“非天然存在的”氨基酸殘基，并且可以將氨基酸殘基側(cè)鏈中的天然飽和碳鏈交換為更短或更長的飽和碳鏈。
在一些實施方案中，尤其優(yōu)選的相似性質(zhì)的氨基酸置換包括例如將x53位的氨基酸由堿性脂肪族氨基酸k突變?yōu)樗嵝灾咀灏被醗或q，將x85位的氨基酸由堿性脂肪族氨基酸k突變?yōu)橹咀灏被醗或d或q，將x105位的氨基酸由酸性脂肪族氨基酸n突變?yōu)榉枷阕灏被醘或y，將x109位氨基酸由s突變?yōu)閞，將x111位氨基酸由酸性脂肪族氨基酸q突變?yōu)橹行园被醠或i，將x132位氨基酸由酸性脂肪族氨基酸e突變?yōu)閴A性帶正電荷的r基氨基酸k或r或h，將x133位氨基酸由帶羥基氨基酸s突變?yōu)榉橇u基氨基酸v或n。
在兩個氨基酸序列的情形中，在最優(yōu)化比對時，如通過程序gap或bestfit使用默認缺口權(quán)重比對時，本發(fā)明的序列與seqidno：1所示的序列享有至少約94％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，84％，83％，82％，81％，80％，75％，70％，65％，60％，55％，或50％的序列同一性。在一些實施方案中，本發(fā)明的序列與seqidno：2所示的任一序列享有至少99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，84％，83％，82％，81％，80％，75％，70％，65％，60％，55％，或50％的序列同一性。在一些實施方案中，本發(fā)明的人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)包括seqidno：2所示的任一多肽或由其組成。在一些實施方案中，不相同的殘基位置差別在于保守氨基酸置換。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，可以用序列分析軟件測量序列同一性。例如，公共可用的gcg軟件包含程序如“gap”和“bestfit”，可以以默認參數(shù)使用所述軟件來確定緊密相關(guān)的多肽之間或野生型蛋白質(zhì)與其突變蛋白質(zhì)之間的序列同源性或序列同一性。也可以使用fasta或clustalw，使用默認或推薦參數(shù)比較多肽序列。gcg版本6.1.中的程序，fasta(例如，fasta2和fasta3)給出查詢和檢索序列之間的最佳重疊區(qū)域的比對和百分比序列同一性。另一種算法是使用默認參數(shù)的計算機程序blast，尤其是blastp。
本發(fā)明提供了人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)、生產(chǎn)人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)、片段和衍生物的方法。所述人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)如本文其它部分所詳細描述。在一些實施方案中，本發(fā)明包含一種具有序列seqidno：1或seqidno：2的人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)。本發(fā)明也包括人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)的“功能性衍生物”?！肮δ苄匝苌铩笔侵赴被崽鎿Q的變體，一個功能性衍生物保留有可檢測的人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)活性，優(yōu)選為能結(jié)合hiv的抗體的活性。“功能性衍生物”可以包含“變體”和“片段”。因此，在一些實施方案中，本申請?zhí)峁┤祟惷庖呷毕莶《局亟M蛋白質(zhì)，其包括的多肽與seqidno：1或2的任一氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高的同一性的氨基酸序列或者由其組成。
在一些實施方案中，本文提供生產(chǎn)人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)、片段和衍生物的方法。所述方法可以是例如，用編碼至少一部分人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)的核酸載體轉(zhuǎn)染宿主細胞，在合適的條件下培養(yǎng)該宿主細胞使其表達人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)。宿主細胞也可以用一個或多個表達載體轉(zhuǎn)染，該表達載體可以單獨或結(jié)合地包含編碼至少一部分人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)的dna。利用常規(guī)的純化蛋白質(zhì)和肽的技術(shù)可從培養(yǎng)基或細胞裂解物中分離人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)，所述技術(shù)包括硫酸銨沉淀，層析(如離子交換，凝膠過濾，親合層析等)和/或電泳。
構(gòu)建合適的含有目的編碼和調(diào)控序列的載體可以使用本領(lǐng)域公知的標準連接和限制技術(shù)進行。將分離的質(zhì)粒、dna序列或合成的寡核苷酸按需要的形式切割、加尾和再連接?？梢杂萌魏畏椒ㄏ蚓幋a序列中引入突變以產(chǎn)生本發(fā)明的變體，這些突變可以包含缺失或插入或置換等。
本發(fā)明也提供抗體，包含單克隆的和多克隆的抗體，該抗體能與hiv的的表位發(fā)生反應(yīng)，所述抗體可以使用本發(fā)明的人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)制備。免疫原可以含有完整的人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)，或其片段或衍生物。優(yōu)選的免疫原含有全部或部分的人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)?？梢杂贸Ｒ?guī)的雜交瘤技術(shù)用上述免疫原免疫動物如鼠，以在被免疫的動物中產(chǎn)生所需的抗體。
本文中的術(shù)語“抗體”在最廣義上使用并且特定地包括全長單克隆抗體，多克隆抗體，多特異性抗體，以及抗體片段，只要他們展示所需的生物學活性?？贵w可以是完全的人抗體、人源化抗體或嵌合抗體，或其衍生物。“抗體片段”包括全長抗體的部分，優(yōu)選地其抗原結(jié)合或可變區(qū)?？贵w片段的實例包括fab、fab′、f(ab)2、f(ab’)2、f(ab)3、fv、單鏈fv(scfv)、dsfv、fd片段，和dab片段；vh、vl、vhh和v-nar結(jié)構(gòu)域；微型抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體；和由抗體片段、和一個或多個分離的cdr或功能互補位形成的多特異性抗體片段，其中分離的cdr或抗原結(jié)合殘基或多肽可以結(jié)合或連接在一起，以致形成功能抗體片段。
在一些實施方案中，本發(fā)明包括含有編碼人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)的核酸序列。在本文中，核酸序列包含其保守置換的變體(例如簡并密碼子的置換)和互補序列。術(shù)語“核酸”和“多核苷酸”是同義的，包含基因、cdna分子、mrna分子以及它們的片段例如寡核苷酸。
在一些實施方案中，本發(fā)明包括含有編碼人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)的核酸序列的表達載體，其中的核酸序列與至少一種調(diào)節(jié)序列可操作連接?！翱刹僮鬟B接”指的是編碼序列以允許編碼序列的表達的方式與調(diào)節(jié)序列連接。調(diào)節(jié)序列選擇用來在合適的宿主細胞中指導(dǎo)目的蛋白質(zhì)的表達，包含啟動子、增強子和其它的表達調(diào)控元件。
在本文中，載體可以指包含本發(fā)明的核酸或其片段的、能夠攜帶遺傳信息并且可以將遺傳信息遞送到細胞中的分子或試劑。典型的載體包括質(zhì)粒、病毒、噬菌體、黏粒和微型染色體。載體可以是克隆載體(即用于將遺傳信息轉(zhuǎn)移到細胞中的載體，可以繁殖所述細胞并且可以選擇存在或不存在所述遺傳信息的所述細胞)或表達載體(即包含必要的遺傳元件從而允許所述載體的遺傳信息在細胞中表達的載體)。因此，克隆載體可以包含選擇標記，以及與所述克隆載體所指定的細胞類型相匹配的復(fù)制起點，而表達載體則包含對于影響指定靶細胞中的表達必要的調(diào)節(jié)元件。
本發(fā)明的核酸或其片段可以插入到合適的載體中以形成攜帶本發(fā)明核酸片段的克隆載體或表達載體。這種新載體也是本發(fā)明的一部分。所述載體可以包括質(zhì)粒、噬菌體、黏粒、微型染色體或病毒，也包括只在特定細胞中瞬時表達的裸dna。本發(fā)明克隆載體和表達載體能夠自發(fā)的復(fù)制，因此能夠為用于隨后克隆的高水平表達或高水平復(fù)制目的提供高拷貝數(shù)。表達載體可以包括用于驅(qū)動本發(fā)明的核酸片段表達的啟動子，可選的編碼使所述肽表達產(chǎn)物分泌或整合到膜上的信號肽的核酸序列，本發(fā)明的核酸片段，以及可選的編碼終止子的核酸序列。當在生產(chǎn)菌株或細胞系中操作表達載體時，載體引入到宿主細胞中時可以整合到宿主細胞的基因組中，也可以不能被整合到宿主細胞基因組中。載體通常攜帶復(fù)制位點，以及能夠在轉(zhuǎn)化細胞中提供表型選擇的標記序列。例如，使用源自大腸桿菌的質(zhì)粒pbr322轉(zhuǎn)化大腸桿菌。pbr322質(zhì)粒包含氨芐青霉素和四環(huán)素抗性基因并且為鑒別轉(zhuǎn)化的細胞提供容易的方法。
本發(fā)明的表達載體用于轉(zhuǎn)化宿主細胞。這種轉(zhuǎn)化細胞也是本發(fā)明的一部分，可以是用于增殖本發(fā)明的核酸片段和載體、或用于重組制備本發(fā)明的多肽的培養(yǎng)細胞或細胞系。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化細胞包括微生物如細菌(如大腸桿菌、芽孢桿菌等)。宿主細胞也包括來自多細胞生物如真菌、昆蟲細胞、植物細胞或哺乳動物細胞，優(yōu)選來自人類的細胞。所述轉(zhuǎn)化細胞能夠復(fù)制本發(fā)明的核酸片段。當重組制備本發(fā)明的肽組合時，所述表達產(chǎn)物可以輸出到培養(yǎng)基中或攜帶在所述轉(zhuǎn)化細胞的表面。
在一些實施方案中，本文任何抗體或人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)可以用于檢測一種或多種靶分子在生物樣品中的存在。術(shù)語“檢測”用于本文中時，包括定量或定性檢測。在一些實施方案中，生物樣品包含細胞或組織。
在一些實施方案中，提供用于診斷或檢測方法，所述方法包括將生物樣品與如本文的抗體或人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)抗原在允許所述抗體或人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)抗原與靶標結(jié)合的條件下接觸，并檢測在所述抗體或人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)抗原與靶標之間是否形成復(fù)合物。該方法可以是體外或體內(nèi)方法。
在一些實施方案中，提供標記的抗體或標記的人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)。標記包括但不限于熒光標記，發(fā)色團標記，電子致密標記，化學發(fā)光標記，和放射性標記，以及間接標記如酶或配體，例如，通過酶促反應(yīng)或分子相互作用來間接檢測。示例性標記包括但不限于放射性同位素，熒光團，羅丹明及其衍生物，熒光素酶，熒光素，辣根過氧化物酶(hrp)，堿性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖類氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，生物素/抗生物素蛋白，自旋標記，噬菌體標記等等。
本發(fā)明的人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)或其片段可用作免疫原，例如，用于疫苗開發(fā)，或作為抗原用于hiv抗體檢測的免疫測定。本發(fā)明的免疫測定包括elisa，還包括ria以及其它非酶聯(lián)抗體結(jié)合試驗或方法。
在elisa試驗的某些實施方案中，抗原序列的肽被固定到一個表面上，優(yōu)選的表面顯示蛋白質(zhì)親和性，如聚苯乙烯微量滴定板的加樣孔。沖洗去除未完全吸收的物質(zhì)后，將一種非特異性蛋白(如牛血清白蛋白、奶粉溶液、明膠、pvp、superblock)，結(jié)合或包被到加樣孔上。這能夠封閉固定表面上的非特異性吸收位點，因此濺少抗血清在表面上非特弄性結(jié)合造成的背景。經(jīng)適當?shù)陌黄?如3小時)后，用適當?shù)牡鞍踪|(zhì)(如牛血清白蛋白、酪蛋白、奶粉溶液)包被加樣孔，然后用適當?shù)木彌_液如pbs沖洗數(shù)次。然后可使平板加樣孔干燥，或在其依然潮濕的情況下使用?？乖镔|(zhì)與加樣孔結(jié)合、用非反應(yīng)性物質(zhì)包被以減少背景、以及沖洗去除未結(jié)合的物質(zhì)后，使固定表面與待測的抗血清、或者臨床或生物提取物接觸，其方式有助于免疫復(fù)合物(抗原/抗體)形成。這種條件優(yōu)選包括用稀釋劑，如應(yīng)用bsa和磷酸緩沖鹽液(pbs)/吐溫稀釋抗血清。這些加入的試劑有助于減少非特異性背景。待測標本與結(jié)合抗原之間形成特異性免疫復(fù)合物后進行沖洗，在一些實施方案中，可以通過將其置于對第一抗體有特異性的第二抗體中，可測定免疫復(fù)合物形成的發(fā)生或量。在這種試驗中，典型的待測標本是來自人類的，第二抗體優(yōu)選對人類igg、igm或iga普遍有特異性的抗體。第二抗體優(yōu)選具有一種偶聯(lián)酶，后者與適當?shù)娘@色底物孵育后會產(chǎn)生顏色。與第二酶標抗體孵育后隨之沖洗去除未結(jié)合的物質(zhì)，通過與顯色底物孵育，對標記物的數(shù)量進行定量。通過測量顏色產(chǎn)生的程度能完成數(shù)量測定。在一些實施方案中，待測標本與結(jié)合抗原之間形成特異性免疫復(fù)合物后進行沖洗之后，也可以將其置于抗原中，可測定免疫復(fù)合物形成的發(fā)生或量。第二抗原可以具有一種偶聯(lián)酶，后者與適當?shù)娘@色底物孵育后會產(chǎn)生顏色。與第二酶標抗原孵育后隨之沖洗去除未結(jié)合的物質(zhì)，通過與顯色底物孵育，對標記物的數(shù)量進行定量。通過測量顏色產(chǎn)生的程度能完成數(shù)量測定。
在一些實施方案中，本文涉及用于確定抗體存在的方法，所述抗體可以是感染hiv如hiv-1早期產(chǎn)生的抗體。在一些實施方案中，所述抗體結(jié)合本發(fā)明的人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)的氨基酸構(gòu)成的表位。所述方法包括將可能包含所述抗體的生物樣品與至少一種本發(fā)明的人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)接觸，并且定量或定性確定所述至少一種人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)與所述樣品中的抗體之間的結(jié)合。所述方法可以采用任何形式，并且可以例如非競爭性或競爭性的elisa、ria或磁性免疫測定、凝集測定和基于表面等離子共振的測定如biacore測定。
在本文中，生物樣品可以指處于健康和/或病理狀態(tài)的生物組織、細胞或流體的樣品。在一些實施方案中，所述生物樣品來自懷疑感染hiv的受試者。在一些實施方案中，所述生物樣品含有感染hiv后產(chǎn)生的抗體。在一些實施方案中，所述生物樣品可以是血液樣品。
本文提供的人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)可以用于確定例如感染hiv的受試者中的抗體的存在，由此具有預(yù)測價值。所述方法也將允許監(jiān)測治療的功效。
在一些實施方案中，本發(fā)明提供抗hiv抗體檢測試驗，該試驗應(yīng)用上述人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)或其片段作為靶抗原。所述試驗可以是elisa試驗，其可以提供在試驗中早期抗hiv抗體的檢測，可以提供在常規(guī)eia和wb技術(shù)測試為陰性的標本中檢測早期抗hiv抗體。
在一些實施方案中，本文提供測試或診斷裝置，所述裝置包含：
(i)能夠結(jié)合hiv抗體的人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)；和
(ii)當所述抗體結(jié)合所述人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)指示的指示劑。
所述測試裝置可以是測試條，來自于所述受試者的所述液體樣品放置到所述測試條上，或者elisa測定板，所述elisa測定板具有其中可放置來自于單個受試者的液體樣品的孔。所述測試裝置可被配置用于流式細胞儀、生物分析儀、生物傳感器中。
在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種制品(例如試劑盒)，所述制品包含可用于診斷hiv感染的材料。該制品包括容器和在容器上或與容器一起的標簽或包裝說明書。適合的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器、iv溶液袋等。所述容器可以由各種材料如玻璃或塑料制成。容器裝有組合物，所述組合物是單獨地或與可有效用于診斷hiv的另一種組合物結(jié)合。組合物中至少一種活性試劑是本文的抗體或人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)。此外，所述制品可以包含：(a)其中包含組合物的第一容器，其中所述組合物包含本文的抗體或人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)；和(b)其中包含組合物的第二容器，其中所述組合物包含第二抗體和/或其它相關(guān)試劑。本發(fā)明的制品還可以包括包裝說明書，所述包裝說明書指明所述組合物可以用于診斷所述疾病或感染。所述制品(例如試劑盒)還可以包括第二或第三容器，所述第二或第三容器包含緩沖劑，如注射用水，磷酸鹽緩沖鹽水，葡萄糖溶液，還可以包括其他材料，如其他緩沖劑、稀釋劑、濾器、針頭和注射器。
在一些實施方案中，本文提供包括所述人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)的制品，如微量滴定板(其上可以包被有所述人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì))。
在一些實施方案中，本文提供含有本文描述的重組蛋白質(zhì)的hiv抗體檢測試劑盒。
在一些實施方案中，所述檢測試劑盒可以包括例如上述微量滴定板。在一些實施方案中，所述試劑盒中還可以包括容器，其中包含例如對hiv抗體具有親和力的第二抗體。
在一些實施方案中，微量滴定板可以包含滴定孔如聚苯乙烯微量滴定孔，這些加樣孔包被人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)、或hiv感染的完整細跑、或其細胞裂解物。
在一些實施方案中，本文提供用于確定例如感染hiv的受試者中的抗體存在的試劑盒，所述抗體結(jié)合本申請的人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)的氨基酸組成的表位，所述試劑盒包含至少一種本發(fā)明的人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)，相關(guān)的緩沖劑，用于使液體樣品與所述人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)反應(yīng)所需的試劑，以及用于確定抗體和所述人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)之間存在陽性或陰性結(jié)合反應(yīng)的試劑。這種試劑盒可以包括用于分離和/或儲存液體樣品的容器，用于使所述人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)與樣品接觸的容器和試劑，以及用于確定人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)與樣品中的成分之間的結(jié)合存在的試劑。為了確定抗體的存在，所述試劑盒可以例如利用帶有第二標記的抗體或抗原(雙抗原夾心法)，其中所述標記可以是任何合適的標記，如熒光或放射性標記、酶標記或結(jié)合標記，如用于結(jié)合鏈霉親和素的生物素標記。在試劑盒中，人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)可以與固體支持物結(jié)合，或者所述試劑盒至少可以包括適于結(jié)合所述人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)的固體支持物。
在一些實施方案中，本文提供一個試劑盒，其用于早期抗hiv抗體檢測和人類免疫缺陷病毒感染。所述試劑盒包括能夠檢測與人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)抗原起免疫反應(yīng)的早期抗hiv抗體的試劑。
在某些實施方案中，試劑盒還可能包括一種容器，其包括一種能夠檢測與人類免疫缺陷病毒重組蛋白質(zhì)起免疫反應(yīng)的早期抗hiv抗體的第二抗體。
試劑盒的hiv抗原試劑可為液體溶液形式、附著于固體支持物上的形式、或為干燥粉劑。當試劑為一種液體溶液時，該液體溶液優(yōu)選是水溶液。當試劑是附著于固體支持物上的形式時，優(yōu)選的固體支持物可以是層析介質(zhì)、塑料珠或平板、或顯微鏡栽玻片。當試劑為一種干燥粉劑時，通過加入適當溶劑可重構(gòu)粉劑。在其它的實施方案中，試劑盒可進一步包括一種包含適當溶劑的容器。
在某些實施方案中，試劑盒包括一種容器，其中包括定量的第二抗體，如偶聯(lián)堿性磷酸酶的羊抗人igg或igm或其它抗人igg第二抗體，以及第二個容器，其中包括一定量的緩沖液。在其它實施方案中，試劑盒可進一步包括第三個容器，它包括適當?shù)牡孜?，如用于堿性磷酸酶的pnpp，或用于過氧化物酶的底物。第四個容器可以包括一種適當?shù)摹敖K止”緩沖劑。
下文提供了一些實例用于示例性說明本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明的范圍。
實施例1
重組蛋白的設(shè)計
通過基因合成的方式合成編碼seqidno：1的基因序列，并對其中x53、x85、x98、x105、x109、x111、x132、x133位點的氨基酸進行突變設(shè)計，
將x53位的氨基酸由堿性脂肪族氨基酸k突變?yōu)樗嵝灾咀灏被醗或q，將x85位的氨基酸由堿性脂肪族氨基酸k突變?yōu)橹咀灏被醗或d或q，將x98位的氨基酸由r置換為k，將x105位的氨基酸由酸性脂肪族氨基酸n突變?yōu)榉枷阕灏被醘或y，將x109位氨基酸由s突變?yōu)閞，將x111位氨基酸由酸性脂肪族氨基酸q突變?yōu)橹行园被醠或i，將x132位氨基酸由酸性脂肪族氨基酸e突變?yōu)閴A性帶正電荷的r基氨基酸k或r或h，將x133位氨基酸由帶羥基氨基酸s突變?yōu)榉橇u基氨基酸v或n。
根據(jù)以上突變方向構(gòu)建突變克隆，其中優(yōu)選方案為其中優(yōu)選突變方案x53、x85、x105、x109、x111、x132、x133分別為e、e、f、r、l、k、v命名為hiv-ag-1，分別為q、d、f、r、l、r、v命名為hiv-ag-2，分別為e、q、y、r、i、k、v命名為hiv-ag-3，分別為q、e、f、r、l、r、n命名為hiv-ag-4，分別為q、d、y、r、l、k、n命名為hiv-ag-5，分別為q、e、y、r、i、h、n命名為hiv-ag-6，分別為e、q、f、r、i、r、v命名為hiv-ag-7，分別為e、q、y、r、i、h、n命名為hiv-ag-8。并構(gòu)建到pmd18-t載體(takara大連寶生物，貨號：6011)中。seqidno：1的基因序列構(gòu)建克隆命名為pmd18-t-hiv-ag-0，突變克隆分別命名為pmd18-t-hiv-ag-1至pmd18-t-hiv-ag-8用于后續(xù)擴增與核酸片段保存。
實施例2
重組蛋白的設(shè)計
在實施例1基礎(chǔ)上，對hiv-ag-1至hiv-ag-8中序列x98、x106、x109、x120和x139的氨基酸進行突變設(shè)計。
將x98位的氨基酸r突變?yōu)閗，將x106位的氨基酸由t突變?yōu)閑，將x109位氨基酸由r突變?yōu)閠，將x120位的氨基酸由r突變?yōu)閗，將x139位氨基酸由n突變?yōu)閐。
新序列分別命名為hiv-ag-9至hiv-ag-16。并構(gòu)建到pmd18-t載體中。分別命名為pmd18-t-hiv-ag-9至pmd18-t-hiv-ag-16用于后續(xù)擴增與核酸片段保存。
實施例3
重組蛋白表達載體的構(gòu)建、誘導(dǎo)表達及純化
重組蛋白表達載體的構(gòu)建與誘導(dǎo)表達：設(shè)計上游引物(帶ecori酶切位點)和下游引物(帶bamhi酶切位點)，以pmd18-t-hiv-ag-0至pmd18-t-hiv-ag-8為模板，擴增目的基因。目的基因純化后，用ecori(takara大連寶生物，貨號：1010a)和bamhi限制性內(nèi)切酶(takara大連寶生物，貨號：1040a)進行雙酶切，37℃孵育2h。純化酶切后的產(chǎn)物并與經(jīng)過相同酶切過的載體pet-28a進行連接，22℃孵育2h，16℃孵育2h。用熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21感受態(tài)(neb(newenglandbiolabs)，貨號：c2530h)，并涂布于含50ug/mlkan的lb平板，37℃培養(yǎng)16h。挑取陽性克隆，經(jīng)菌液pcr鑒定、雙酶切鑒定后送測序。選取測序完全正確的陽性單克隆接種到含50ug/mlkan的lb培養(yǎng)基中，37度震蕩培養(yǎng)。待od600達到0.6-0.8后，加入1.0mmiptg，37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)2-4h，提取總蛋白，sds-page鑒定重組蛋白表達情況。通過重組蛋白n端帶有的6*his標簽，經(jīng)過鎳離子螯合純化和sp柱純化后得到純度達到96％的蛋白。將得到的蛋白分別命名為hiv-ag-0至hiv-ag-16。
實施例4
突變克隆hiv-ag-1至hiv-ag-8重組抗原在酶免產(chǎn)品工藝中的應(yīng)用與活性及特異性評價
酶免檢測按如下方式進行操作：
包被：將重組蛋白按100ng/ml的工作濃度加入到50mmcbph9.6的包被液中，混勻后按每孔100ul加入到聚苯乙烯板中，4℃包被18-20小時。
封閉：取出包被板室溫平衡30min，用洗滌液洗板2次，每孔加150ul封閉液37℃封閉2小時。拍干置于濕度小于30％的電子干燥箱中干燥24h后待用。
標記：將重組蛋白按推薦方式標記hr按50ng/ml用酶工作液稀釋后混勻(酶稀釋液配方：20mmpb150mmnacl0.5％bsa0.05％tween-2000.1％p300)。
反應(yīng)模式和反應(yīng)時間：50ul待測樣品+50ul樣品稀釋液，37度恒溫箱反應(yīng)60min；洗板5次，拍干后加入100ul標記重組蛋白-hr工作液，37℃反應(yīng)30min；洗板5次，加顯色劑a和b各50ul，顯色30min；加入終止液50ul，用450nm和630nm雙波長檢測，檢測要求在10min之內(nèi)讀完。
與市售試劑盒進行性能對比實驗，hiv-1陽性血清500份、hiv-1抗體陰性血清3000份。結(jié)果如表1所示，本發(fā)明的重組蛋白用于hiv-1抗體檢測，靈敏度有提升，特異性明顯改善，優(yōu)于現(xiàn)有產(chǎn)品。
表1突變后檢測結(jié)果對比1
實施例5
突變克隆hiv-ag-1至hiv-ag-16重組抗原在酶免工藝中的活性評價
酶免檢測按如下方式進行操作：
包被：將重組蛋白按100ng/ml的工作濃度加入到50mmcbph9.6的包被液中，混勻后按每孔100ul加入到聚苯乙烯板中，4℃包被18-20小時。
封閉：取出包被板室溫平衡30min，用洗滌液洗板2次，每孔加150ul封閉液37℃封閉2小時。拍干置于濕度小于30％的電子干燥箱中干燥24h后待用。
標記：將重組蛋白按推薦方式標記hr按50ng/ml用酶工作液稀釋后混勻(酶稀釋液配方：20mmpb150mmnacl0.5％bsa0.05％tween-2000.1％p300)。
反應(yīng)模式和反應(yīng)時間：50ul待測樣品+50ul樣品稀釋液，37度恒溫箱反應(yīng)60min；洗板5次，拍干后加入100ul標記重組蛋白-hrp工作液，37℃反應(yīng)30min；洗板5次，加顯色劑a和b各50ul，顯色30min；加入終止液50ul，用450nm和630nm雙波長檢測，檢測要求在10min之內(nèi)讀完。
hiv-1陽性血清500份，每份按1∶200用樣品稀釋液進行稀釋后作為待測標本進行活性檢測。結(jié)果如表2所示，進行突變后，500份陽性標本稀釋后檢測的平均靈敏度有顯著提高。
表2突變后檢測結(jié)果對比2
序列表
seqidno：1
seqidno：2：
其中第n位的xaa以xn表示，其中
x53是k，e或q，優(yōu)選是e或q，
x85是k，e或d或q，優(yōu)選是e或d或q，
x98是r，k，優(yōu)選是k，
x105是n，f或y，優(yōu)選是f或y，
x106是t，e，優(yōu)選是e，
x109是s，r或t，優(yōu)選是r或t，
x111是q，l或i，優(yōu)選是l或i，
x120是r，k，優(yōu)選是k，
x132是e，k或r或h，優(yōu)選是k或r或h，
x133是s，v或n，優(yōu)選是v或n，
x139是n，d，優(yōu)選是d。