一種具有抗炎作用羊棲菜多糖的制備方法及在功能性食品中的應用
【專利摘要】本申請公開了一種用于具有抗炎作用的羊棲菜多糖，還涉及該羊棲菜多糖的制備方法以及該羊棲菜多糖在保健品中的應用，本方法制備的水溶性羊棲菜多糖無細胞毒性，安全可靠，表現(xiàn)出明顯的抗炎作用，因此可以成為治療和預防炎癥的功能性食品。且本發(fā)明方法操作簡單，適宜規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)。
【專利說明】
一種具有抗炎作用羊棲菜多糖的制備方法及在功能性食品中的應用
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及一種用于具有抗炎作用的羊棲菜多糖，還涉及該羊棲菜多糖的制備方法以及該羊棲菜多糖在保健品中的應用。
【背景技術】
[0002]炎癥(inflammat1n)是具有血管系統(tǒng)的活體組織對損傷因子所產(chǎn)生的防御性反應。它包括致炎因子引起的損傷、機體防御性反應和組織損傷恢復三個方面。適度的炎癥反應是機體保護自我的一種免疫反應，過度的炎癥會導致機體的免疫損傷，誘發(fā)各種病癥，如類風濕關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、自身免疫性溶血性貧血等。患病機體的血液中檢測到大量的炎癥相關因子(如了即-€1、幾-1|3、11^6、丨勵3和0^-2等)，這些因子浸潤機體，引發(fā)各種不良反應，嚴重威脅到機體健康。因此預防和輔助治療炎癥顯得尤為重要。
[0003]在炎癥治療和預防研究中，已經(jīng)開發(fā)出許多抗炎藥物，如腎上腺皮質激素類制劑:強的松、氫化可的松、地塞米松等激素類藥物。但這類藥物容易產(chǎn)生依賴性，并且對過敏性的重度炎癥的療效還不盡人意。而抗炎效果較強的環(huán)磷酰胺、氨甲喋呤等藥物的毒性較大，在發(fā)揮免疫作用的同時，對機體的正常免疫功能也產(chǎn)生較大的傷害。因此，開發(fā)有效、安全、依賴性及毒副作用低的抗炎藥物顯得日益重要。相比之下，生產(chǎn)出具有抗炎作用的功能性食品，長期服用，預防急性炎癥，輔助治療慢性炎癥具有更大的市場價值。
[0004]在長期的研究中發(fā)現(xiàn)，許多多糖類物質作為一種天然產(chǎn)物，在炎癥抑制方面表現(xiàn)出良好的效果。如銀杏多糖(劉春明等，東北師范大學，2007:1-29)在小鼠體內急性腹腔炎癥實驗中表現(xiàn)出較強的抑制作用，在體外則能明顯抑制中性粒細胞與穩(wěn)定轉染P-選擇(P-selectin)的CHO(中國倉鼠卵巢細胞)細胞的粘附。LPS是產(chǎn)生內毒素血癥的重要原因，可刺激機體產(chǎn)生TNF-α、IL-6等促炎癥細胞因子，后者觸發(fā)瀑布式炎癥級聯(lián)反應，進一步激活炎癥細胞(吳金峰等，中國中西醫(yī)結合雜志，2009，29 (4):330-334)。靈芝多糖(Md.AbulHasnat，et.Phytochemistry ,phytochem.2014.10.019)和來自墨角藻的褐藻多糖硫酸酯(Hye Young Park,et.Food and Chemical Toxicology 49(2011) 1745-1752)能顯著抑制LPS誘導的炎癥異常表達的NO、PGE2、IL-10、iNOS和C0X-2等炎癥因子，并且通過抑制ΙκΒα的磷酸化來抑制NF-kB經(jīng)典免疫調節(jié)通路的活化，同時下調ERK、JUK、P38和MAPK等相關通路來達到有效抑制炎癥的作用。這些天然產(chǎn)物給我們提供了豐富的資源。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明公開了一種羊棲菜多糖的制備方法，該方法制備的羊棲菜多糖有較好的抗炎功效，調節(jié)機體免疫，保護機體免受免疫反應過激帶來的損傷。
[0006]本發(fā)明還公開了將上述羊棲菜多糖作為一種用于抗炎的片劑、膠囊等功能性食品O
[0007]針對羊棲菜多糖本身，一種抗炎作用的羊棲菜多糖的制備方法，其特征在于包括有以下步驟:
[0008](I)干燥粉碎;新鮮羊棲菜放入鼓風干燥箱中，40?60°C干燥48h，干燥藻體剪碎成段，放入粉碎機中研磨至10-40目，得到羊棲菜藻粉；
[0009](2)回流脫脂:按照羊棲菜藻粉:95%乙醇= l:4(m:v)，回流脫脂3次，每次3h，得到脫脂羊棲菜藻粉；
[0010](3)提取濃縮液:按照脫脂羊棲菜藻粉:蒸餾水=l:30(m:v)，60?90°C煮提3次，時間依次為4、3、2h，合并3次煮提液，減壓濃縮體積至1/10，得到濃縮液；
[0011](4)乙醇沉淀:在濃縮液中加入95 %乙醇至乙醇終濃度為80 %，室溫醇沉過夜，棄上清，離心收集沉淀；
[0012](5)干燥:將得到的沉淀進行溶劑干燥，依次使用95%乙醇、無水乙醇、丙酮洗滌沉淀，得到羊棲菜多糖；
[0013](6)烘干:將上述羊棲菜多糖放入真空干燥箱中，40?60°C減壓烘干；
[0014](7)脫色及洗脫:烘干后的羊棲菜多糖經(jīng)DEAE-纖維素柱脫色，用2mol/L NaCl洗脫，洗脫液濃縮后，冷凍干燥所得樣品為SPFs;
[0015](8)SPFs再次經(jīng)DEAE-瓊脂糖凝膠CL-6B，依次經(jīng)過0.5和1.0mol/L NaCl洗脫分級，得到的第一個峰和第二個峰分別命名為Fl和F2;
[0016](9)F2再用丙烯葡聚糖凝膠S-400HR凝膠柱按分子量大小進行分級，得到兩個級分，截取峰型均一且含量較多的峰二，透析凍干后得產(chǎn)物羊棲菜多糖SFPF-2，產(chǎn)率3%-1.5%。
[0017]將上述羊棲菜多糖作為原料，將上述制備得到羊棲菜多糖作為原料，按照藥學領域的常規(guī)生產(chǎn)方法，制備用于抗炎的片劑、膠囊或功能性食品。
[0018]本方法制備的水溶性羊棲菜多糖無細胞毒性，安全可靠，表現(xiàn)出明顯的抗炎作用，因此可以成為治療和預防炎癥的功能性食品。且本發(fā)明方法操作簡單，適宜規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0019]圖1 SFPF-2對RAW264.7細胞活性的影響；
[0020]圖2不同濃度SFPF-2對RAW264.7巨噬細胞吞噬能力的影響；
[0021]圖3-1、3-2、3-3分別為不同濃度3???-2對1^3誘導下1^1264.7細胞因子分泌量的影響；
[0022]圖4 SFPF-2對iNOS mRNA轉錄水平的影響；
[0023]圖5-1、5-2、5-3、5-4及圖5-5分別為SFPF-2對NF-κΒ免疫調節(jié)信號通路的相關蛋白的影響及灰度分析。
【具體實施方式】
[0024]下面結合附圖和實施例，對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0025]一種羊棲菜多糖的制備方法，將清洗干凈的新鮮羊棲菜放入烘箱中，40?60°C烘烤48h，剪碎成段，放入粉碎機中研磨I?2min，得到羊棲菜藻粉。稱量500g羊棲菜藻粉，按照羊棲菜藻粉:95%乙醇= l:4(m:v)，60?80°C回流脫脂3次，時間依次為4、3、2h，，得到脫脂羊棲菜藻粉。按照脫脂羊棲菜藻粉:蒸餾水=1:30(!11:7)，80°(:煮提3次，時間依次為411，311，2h，合并3次煮提液，減壓濃縮體積至1/12。濃縮液中加入乙醇至終濃度為80%乙醇，室溫醇沉過夜，棄上清，離心收集沉淀。將得到的沉淀常規(guī)干燥，依次使用95%乙醇、無水乙醇、丙酮洗滌沉淀，得到羊棲菜多糖。將上述羊棲菜多糖放入真空干燥箱中，50°C減壓烘干，得到奶黃色粉末，羊棲菜多糖SFPs得率為18?25%，經(jīng)測定SFPs (羊棲菜多糖)成分含量為75?85%。再次經(jīng)DEAE-Sephaose CL-6B，經(jīng)過0.5和1.0mol/L NaCl分級，，得到級分Fl和F2。卩2經(jīng)Sephacry I S-400HR凝膠柱，按分子量大小進行分級，得到兩個級分，截取峰型均一且含量較多的峰，透析凍干后得最終的產(chǎn)物SFPF-2。該多糖主要由褐藻多糖硫酸酯組成，其單糖組成為甘露糖、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖和巖藻糖(2.4:0.7:13.3:3.1:80.6)等構成，其分子量為2.4\1041^^。其得率為1.76%。
[0026]按本發(fā)明方法制得的羊棲菜多糖(SFPF-2)進行抗炎活性實驗，結果如下:
[0027]SFPF-2對RAW264.7細胞毒性實驗結果，參考圖1:
[0028]SFPF-2對細胞吞噬能力的影響，參考圖2:
[0029]SFPF-2減少LPS誘導下細胞因子的表達量，參考圖3;
[0030]SFPF-2對LPS誘導下免疫因子反轉錄水平的影響，參考圖4;
[0031]SFPF-2對NF-κΒ免疫調節(jié)信號通路的相關蛋白的影響，參考圖5;
[0032]上述實驗結果顯示SFPF-2對RAW264.7巨噬細胞無細胞毒性。在LPS誘導構造的炎癥細胞模型中，與LPS組比較，細胞的吞噬能力顯著降低，趨向于control組。在ELISA檢測試驗中，與LPS組相比，多糖共處理組中TNF-α、IL-1β和I L_6的分泌量明顯下降，其中TNF-α和
IL-Ιβ的分泌量隨著多糖濃度的增加，分泌量隨之減少。iNOS--誘導型一氧化氮合成酶，
是機體NOS活性氮自由基產(chǎn)生的催化酶。其含量的高低可做為一種機體內炎癥程度的指標。與LPS組相比，SFPF-2處理組的iNOS在mRNA轉錄水平明顯降低。在WB相關蛋白檢測實驗中，多糖處理組中總P-65和ΙκΒα明顯呈現(xiàn)濃度負相關作用，同時P-65和ΙκΒα蛋白的磷酸化也受至IJ明顯抑制。NF-kB信號通路的激活明顯受到了抑制，從而緩解了LPS誘導的炎癥反應帶來的損傷。
[0033]綜上所述，本方法制備的水溶性羊棲菜多糖SFPF-2無細胞毒性，安全可靠，SFPF-2表現(xiàn)出明顯的抗炎作用，因此可以成為治療和預防炎癥的功能性食品。且本發(fā)明方法操作簡單，適宜規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)。
[0034]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和變型，上述假設的這些改進和變型同應視為本發(fā)明的保護范圍。
【主權項】
1.一種抗炎作用的羊棲菜多糖的制備方法，其特征在于包括有以下步驟: (1)干燥粉碎:新鮮羊棲菜放入鼓風干燥箱中，40?60°C干燥48h，干燥藻體剪碎成段，放入粉碎機中研磨至10-40目，得到羊棲菜藻粉； (2)回流脫脂:按照羊棲菜藻粉:95%乙醇=l:4(m:v)，回流脫脂3次，每次3h，得到脫脂羊棲菜藻粉； (3)提取濃縮液:按照脫脂羊棲菜藻粉:蒸餾水=l:30(m:v)，60?90°C煮提3次，時間依次為4、3、2h，合并3次煮提液，減壓濃縮體積至1/10，得到濃縮液； (4)乙醇沉淀:在濃縮液中加入95%乙醇至乙醇終濃度為80 %，室溫醇沉過夜，棄上清，離心收集沉淀； (5)干燥:將得到的沉淀進行溶劑干燥，依次使用95%乙醇、無水乙醇、丙酮洗滌沉淀，得到羊棲菜多糖； (6)烘干:將上述羊棲菜多糖放入真空干燥箱中，40?60°(:減壓烘干； (7)脫色及洗脫:烘干后的羊棲菜多糖經(jīng)DEAE-纖維素柱脫色，用2mol/LNaCl洗脫，洗脫液濃縮后，冷凍干燥所得樣品為SPFs; (8)SPFs再次經(jīng)DEAE-瓊脂糖凝膠CL-6B，依次經(jīng)過0.5和1.0moI/L NaCl洗脫分級，得到的第一個峰和第二個峰分別命名為Fl和F2; (9)F2再用丙烯葡聚糖凝膠S-400HR凝膠柱按分子量大小進行分級，得到兩個級分，截取峰型均一且含量較多的峰二，透析凍干后得產(chǎn)物羊棲菜多糖SFPF-2，產(chǎn)率3%-1.5%。2.將權利要求1中的羊棲菜多糖作為原料，將上述制備得到羊棲菜多糖作為原料，按照藥學領域的常規(guī)生產(chǎn)方法，制備用于抗炎的片劑、膠囊或功能性食品。
【文檔編號】A23L33/125GK106046191SQ201610556342
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月1日
【發(fā)明人】吳明江, 陳柳君, 張旭, 何丹, 林秀秀, 楊珊珊, 陳陪超
【申請人】溫州大學