本發(fā)明屬于生物領域，具體涉及一種食用菌凝集素及其在抑制棕囊藻生長中的應用。
背景技術：
凝集素是一種從各種植物、無脊椎動物和高等動物中提純的糖蛋白或結合糖的蛋白。它具有能與糖專一性、非共價可逆結合的特點，部分凝集素還具有免疫調節(jié)和抑制腫瘤生長的作用，同時還參與生物體內的一些重要生理過程；在研究生物體內細胞癌變、受精、分化和分子識別等重要生命過程中起著重要作用，所以日益成為國內外生物研究的熱點之一。凝集素按不同的分類方法可以分很多類型，主要依據其結合的糖的類型或其來源的物種進行區(qū)分。按照凝集素結合糖的類型，把自然界中的凝集素分成若干類型，就叫該糖凝集素，如：d一甘露糖凝集素、l一巖藻糖凝集素(荊豆凝集素)。按照物種的來源分類，凝集素可以分為動物凝集素(哺乳動物凝集素、無脊椎動物凝集素、昆蟲凝集素等)、植物凝集素、微生物凝集素。而本發(fā)明所涉及的凝集素為食用菌凝集素，也就是植物凝集素。
食用菌又稱白蘑菇、蘑菇、洋蘑菇，是世界上最普遍研究最廣的一種菇類，喜生長在糞草酵料上的一種傘菌，食用菌所含的酪氨酶有明顯降低血壓作用；多糖的醌類化合物與巰基結合，可抑制脫氧核糖核酸合成，在醫(yī)學上，有抑制腫瘤細胞活性的作用。而雙孢蘑菇2796、真姬菇以及長裙竹蓀是我國20世紀90年代初選育出的一種質量好高產量的食用菌種類，得到了較大的推廣與研究。
hori等(1996)首次報道了幾種陸生植物和海藻凝集素對某些海洋微藻的凝集作用；鄭怡等(2002)發(fā)現(xiàn)壇紫菜凝集素(phl)能夠凝集一定濃度范圍內的單細胞藻類；陳國強(2008)以褐藻門的鐵釘菜(ishigeokamurae)的凝集素為試驗材料，研究發(fā)現(xiàn)鐵釘菜凝集素能抑制多紋膝溝藻和棕囊藻的生長。然而目前有關凝集素對海洋微藻影響的研究，主要集中在海洋大型藻類的凝集素提取、微觀層面的細胞凝集反應等方面的研究，未見凝集素對微藻選擇性抑制作用的研究。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供一種食用菌凝集素及其在抑制棕囊藻生長中的應用，明確了雙孢蘑菇部分重要生化特性的影響，為開發(fā)環(huán)保的選擇性抑藻劑技術提供新思路和新方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：
一種食用菌凝集素及其在抑制棕囊藻生長中的應用，所述食用菌凝集素為雙孢蘑菇2796凝集素，其提取步驟為：
取食用菌子實體，按質量體積比為1:5加入0.9%w/v生理鹽水，在4℃下浸泡18h；然后用高速組織搗碎機將其均漿后再次放在4℃下浸泡4h，4層紗布過濾，棄濾渣，取濾液；在4℃，9000r/min下冷凍離心,20min，取出上清液；加入22.6%w/v硫酸銨鹽析，并用79-1磁力加熱攪拌器使其混勻，以此得到沉淀為40%的飽和溶液部分，放入到4℃下18h使其充分沉淀，取上清；再次在4℃，9000r/min下冷凍離心,20min，取出上清液，加入12%w/v硫酸銨鹽析，并用79-1磁力加熱攪拌器使其混勻，以此得到沉淀為60%的飽和溶液部分，放入到4℃下18h使其充分沉淀，在4℃，9000r/min下冷凍離心,20min，取出沉淀；將沉淀溶于1mol/l的nacl中，裝入透析袋中除鹽，用相同的鹽濃度透析至外透析液無so42-檢出為止；所得透析液聚乙二醇濃縮后上deae-sepharosefastflow柱，以0.05mol/l，ph7.8的磷酸緩沖液pbs對含1molnacl的同一緩沖液梯度洗脫，檢測波長280nm，分管收集，以鴿子血檢測各峰的凝血活性，收集活性峰；然后活性峰上sephadexg-100柱層析純化，流速4ml/管，10min/管，洗脫液為0.05mol/l、ph8.0的pbs緩沖液，檢測波長280nm，分管收集后檢測各峰的凝血活性，收集活性峰，冷凍干燥即得所述食用菌凝集素純品。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種上述食用菌凝集素抑制棕囊藻生長的方法，其使用方法為：將所提取的食用菌凝集素直接加入棕囊藻生長水域中，抑制其生長。
食用菌2796凝集素的分離純化
取食用菌子實體，按質量體積比為1:5加入0.9%w/v生理鹽水，在4℃下浸泡18h；然后用高速組織搗碎機將其均漿后再次放在4℃下浸泡4h，4層紗布過濾，棄濾渣，取濾液；在4℃，9000r/min下冷凍離心,20min，取出上清液；加入22.6%w/v硫酸銨鹽析，并用79-1磁力加熱攪拌器使其混勻，以此得到沉淀為40%的飽和溶液部分，放入到4℃下18h使其充分沉淀，取上清液再次在4℃，9000r/min下冷凍離心,20min，取出上清液，加入12%w/v硫酸銨鹽析，并用79-1磁力加熱攪拌器使其混勻，以此得到沉淀為60%的飽和溶液部分，放入到4℃下18h使其充分沉淀，在4℃，9000r/min下冷凍離心,20min，取出沉淀；將沉淀溶于1mol/l的nacl中，裝入透析袋中除鹽，用相同的鹽濃度透析至外透析液無so42-檢出為止；所得透析液聚乙二醇濃縮后上deae-sepharosefastflow柱（1.6cm×30cm），以磷酸緩沖液pbs（0.05mol/l,ph7.8）對含1molnacl的同一緩沖液梯度洗脫，檢測波長280nm，分管收集，以鴿子血檢測各峰的凝血活性，收集活性峰；然后活性峰上sephadexg-100柱(2.6cm×60cm)層析純化，流速4ml/管，10min/管，洗脫液pbs（0.05mol/l，ph8.0），檢測波長280nm，分管收集后檢測各峰的凝血活性，收集活性峰，冷凍干燥即得食用菌2796凝集素純品。
本發(fā)明的優(yōu)點在于：
將雙孢蘑菇凝集素應用于棕囊藻的特應性抑制，明確了雙孢蘑菇部分重要生化特性的影響，為開發(fā)環(huán)保的選擇性抑藻劑技術提供新思路和新方法。
附圖說明
圖1雙孢蘑菇凝集素對棕囊藻室內模擬抑制試驗，圖1a為雙孢蘑菇凝集素對高濃度棕囊藻的殺滅效果，圖1b為雙孢蘑菇凝集素對低濃度棕囊藻的殺滅效果。
具體實施方式
實施例1食用菌2796凝集素的制備
取食用菌子實體，按質量體積比為1:5加入0.9%w/v生理鹽水，在4℃下浸泡18h；然后用高速組織搗碎機將其均漿后再次放在4℃下浸泡4h，4層紗布過濾，棄濾渣，取濾液；在4℃，9000r/min下冷凍離心20min，取出上清液；加入22.6%w/v硫酸銨鹽析，并用79-1磁力加熱攪拌器使其混勻，以此得到沉淀為40%的飽和溶液部分，放入到4℃下18h使其充分沉淀，取上清；再次在4℃，9000r/min下冷凍離心20min，取出上清液，加入12%w/v硫酸銨鹽析，并用79-1磁力加熱攪拌器使其混勻，以此得到沉淀為60%的飽和溶液部分，放入到4℃下18h使其充分沉淀，在4℃，9000r/min下冷凍離心20min，取出沉淀；將沉淀溶于1mol/l的nacl中，裝入透析袋中除鹽，用相同的鹽濃度透析至外透析液無so42-檢出為止；所得透析液聚乙二醇濃縮后上deae-sepharosefastflow柱（1.6cm×30cm），以磷酸緩沖液pbs（0.05mol/l,ph7.8）對含1molnacl的同一緩沖液梯度洗脫，檢測波長280nm，分管收集，以鴿子血檢測各峰的凝血活性，收集活性峰；然后活性峰上sephadexg-100柱(2.6cm×60cm)層析純化，流速4ml/管，10min/管，洗脫液pbs（0.05mol/l，ph8.0），檢測波長280nm，分管收集后檢測各峰的凝血活性，收集活性峰，冷凍干燥即得食用菌2796凝集素純品。
實施例2凝集素對微藻細胞增殖的影響
1、棕囊藻的培養(yǎng)
棕囊藻在lrh-250-g光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為25±1℃，光照強度e3000±50lx，光暗周期12h，實驗中藻類培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為f/2培養(yǎng)基。
2、凝集素對棕囊藻細胞增殖的影響(藻細胞計數)
棕囊藻在正常的生長環(huán)境下，通過abl為雙孢蘑菇凝集素；hml為真姬菇凝集素；dil為長裙竹蓀凝集素和對照處理，三種凝集素對棕囊藻的藻細胞增殖影響研究結果表明(表1)，雙孢蘑菇凝集素對棕囊藻細胞增殖具有顯著抑制作用。
表1凝集素對微藻細胞增殖的影響
abl為雙孢蘑菇凝集素；hml為真姬菇凝集素；dil為長裙竹蓀凝集素；下同
實施例3凝集素對棕囊藻細胞的凝集實驗
試驗步驟：
(1)海洋棕囊藻在lrh-250-g光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為25±1℃，光照強度e3000±50lx，光暗周期12h，實驗中藻類培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為f/2培養(yǎng)基。
(2)各種微藻培養(yǎng)至指數生長期時，離心收集微藻細胞，加滅菌后的海水，3000r/min下離心5min，洗滌2次，最后加入4倍體積的滅菌海水配成藻細胞懸液。
(3)在96孔v型血凝板上用40μl凝集素溶液與等量生理鹽水系列倍比稀釋后，加入40μl的藻細胞懸液，以等量消毒海水作為空白對照，振蕩均勻，室溫下靜置2h，顯微觀察。
實驗結果如表2所示，凝集素對微藻細胞的凝集實驗的結果表明，雙孢蘑菇凝集素（abl）以及長裙竹蓀凝集素（dil）在一定濃度下對棕囊藻細胞具有凝集作用。
表2食用菌凝集素對微藻的凝集作用
abl為雙孢蘑菇凝集素；hml為真姬菇凝集素；dil為長裙竹蓀凝集素；下同
“+”凝集；“-”不凝集；下同
實施例4凝集素對微藻細胞運動能力的影響
試驗步驟：
在96孔“v”型血凝板上用40μl凝集素溶液與等量生理鹽水系列倍比稀釋后，加入40μl經離心洗滌過的藻細胞懸液，以等量消毒海水作為空白對照，振蕩均勻，室溫下靜置1h，顯微觀察其運動情況。
實驗結果如表3所示，實驗表明雙孢蘑菇凝集素能強烈地抑制棕囊藻鞭毛的擺動使其失去運動能力，且這種鞭毛抑制作用表現(xiàn)出很強的特異性，對其他幾種供試的有鞭毛的微藻中僅對塔胞藻的鞭毛有微弱的抑制作用。
表3凝集素對微藻細胞運動能力的影響
實施例5雙孢蘑菇凝集素對棕囊藻室內模擬抑制試驗
模擬赤潮發(fā)生時的藻類密度高的環(huán)境情況，跟蹤觀察雙孢蘑菇凝集素對高密度棕囊藻的殺滅效果(圖1a，圖1b)。結果顯示在t<3d時雙孢蘑菇凝集素處理的右缸和對照組左缸的葉綠素濃度變化基本一致，當t>5d后，左缸與右缸的葉綠素濃度變化趨勢開始出現(xiàn)差異。對照組，在不斷補充營養(yǎng)鹽的條件下，雖然其葉綠素濃度出現(xiàn)了弱的下降趨勢，但總體仍維持在1.1mg/l以上的高水平，藻液藻密度高且分布均勻。相比之下，雙孢蘑菇凝集素處理的右缸在t>2d后逐漸觀察到棕囊藻藻體沉淀的現(xiàn)象，但在t=3d時，攪勻取樣測得的葉綠素濃度數值與對照組差異不大，這可能與藻細胞沉淀但并未解體有關。但隨著時間的增加，沉底的藻細胞開始解體，藻液的葉綠素濃度開始急劇下降，呈現(xiàn)出先急后緩的趨勢，這可能與凝集素的降解有關。
本發(fā)明過程中還發(fā)現(xiàn)，1mmol/liptg可以誘導雙孢蘑菇凝集素基因在大腸桿菌中表達，為今后穩(wěn)定、大量獲得雙孢蘑菇凝集素奠定基礎。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發(fā)明的涵蓋范圍。