本發(fā)明涉及皰疹病毒檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地指一種同步檢測(cè)人類皰疹病毒6、8型的引物、探針及試劑盒。
背景技術(shù)：
：現(xiàn)有研究證實(shí)人類皰疹病毒(humanherpesvirus，HHV)-6，-7，-8，能通過(guò)輸血傳播，并在初次感染人體后入侵人類的外周血單個(gè)有核細(xì)胞的CD4+T細(xì)胞，隨后進(jìn)入潛伏狀態(tài)，引起持續(xù)性感染，在免疫功能低下和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的個(gè)體中活化而致病。針對(duì)皰疹病毒6、7、8型，現(xiàn)有技術(shù)中提供了一種多重?zé)晒舛縋CR方法，選定U67、U36、ORF65分別作為HHV-6、HHV-7、HHV-8的靶基因，該方法可以對(duì)上述三種病毒進(jìn)行一次性檢出，靈敏度較高，但是其存在的缺陷是在使用中假陽(yáng)性率高，特別是針對(duì)HHV-6、HHV-7型的皰疹病毒案例會(huì)有超過(guò)10％的假陽(yáng)性，影響了該技術(shù)臨床應(yīng)用中的推廣。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有皰疹病毒檢測(cè)方法假陽(yáng)性率較高的缺陷，提供一種高靈敏度且高特異性的同步檢測(cè)人類皰疹病毒6、8型的引物、探針及試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所設(shè)計(jì)的用于同步檢測(cè)人類皰疹病毒6、8型的引物及熒光探針組如下：(1)正向引物HHV6-F，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；反向引物HHV6-R，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；熒光探針HHV6-P，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；(2)正向引物HHV8-F，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；反向引物HHV8-R，其核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；熒光探針HHV8-P，其核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。本發(fā)明還提供了一種用于同步檢測(cè)人類皰疹病毒6、8型的熒光定量PCR試劑盒，由如下組分組成：DNA提取液、熒光定量PCR反應(yīng)液、HHV6標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板、HHV8標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板和陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品；所述熒光定量PCR反應(yīng)液包含以下組分：(1)正向引物HHV6-F，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；反向引物HHV6-R，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；熒光探針HHV6-P，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；(2)正向引物HHV8-F，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；反向引物HHV8-R，其核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；熒光探針HHV8-P，其核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；(3)PCR10×buffer、MgCl2、dNTPs含dUTP、DNA聚合酶、UNG酶、無(wú)菌雙蒸水。在上述方案中，所述試劑盒的熒光定量PCR擴(kuò)增條件為50℃2min，95℃5min，95℃15s、62℃30s、40個(gè)循環(huán)，62℃開(kāi)始收集熒光信號(hào)。本發(fā)明的發(fā)明人通過(guò)大量的試驗(yàn)，在嘗試過(guò)多種靶基因的組合之后，確定以U69、ORF73分別作為HHV-6、HHV-8的靶基因；HHV-6的U69產(chǎn)物長(zhǎng)度154bp序列如下：GTGTCATTTCGGCTTTCATAGCTGGTGTCATCCGTGCAAAATCAGGAGCCGACTTATTATCTCACGAGTGTGTTATTAATAACCTATTGATTTCAAATTCCGTTTGTATGAGTCATAAAGTGTCTTTGTCACGTACTTATGATATTGATCTCCAHHV-8的ORF73產(chǎn)物長(zhǎng)度173bp序列如下：CTGACTTTCCTTGCTAATCTCGTTGTCCCCATTATCCTCGCCAGCCTGATTATTTTCGGAACATTCTTTTTCATTCTTGGATGCTTCTTCTGCAATCTCCGCAAGGAGCACCAACATGGCTGTGTCATCACCCCAGGATCCCTCAGACGGGGATGATGATCCTATGGAGATGG以上述兩種靶基因?yàn)槟繕?biāo)設(shè)計(jì)出的引物，結(jié)合優(yōu)化的擴(kuò)增體系及擴(kuò)增條件，在雙重PCR擴(kuò)增過(guò)程中，交互影響較小，能夠獲得較好的特異性，靈敏度高。本發(fā)明的有益效果：通過(guò)選定新的靶基因，并重新設(shè)計(jì)了引物和探針，優(yōu)化反應(yīng)體系，大幅度降低了人類皰疹病毒臨床同步檢測(cè)的假陽(yáng)性率，靈敏度高，特異性好且檢測(cè)用時(shí)更短，使該技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)臨床上的應(yīng)用與推廣。附圖說(shuō)明圖1為雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)HHV-6、HHV-8的標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實(shí)施方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。實(shí)施例1本實(shí)施例提供了一種用于同步檢測(cè)人類皰疹病毒6、8型的引物及熒光探針組，改組含有三對(duì)引物及三條探針，序列如下：(1)正向引物HHV6-F，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；反向引物HHV6-R，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；熒光探針HHV6-P，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，熒光探針5′端標(biāo)記FAM，3′端淬滅基團(tuán)BHQ；(2)正向引物HHV8-F，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；反向引物HHV8-R，其核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；熒光探針HHV8-P，其核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，熒光探針5′端標(biāo)記Cy5，3′端淬滅基團(tuán)BHQ。上述引物及探針均委托上海生工生物人工合成。實(shí)施例2本實(shí)施例提供了一種用于同步檢測(cè)人類皰疹病毒6、8型的熒光定量PCR試劑盒一、試劑盒組成與配制1)引物及熒光探針組同實(shí)施例12)DNA提取液DNA提取液可以采用市售DNA提取試劑盒，也可以自行配制。本實(shí)施例中DNA提取液配方：配制200mmol/LNaCl，100mmol/LTris-HCl，1％SDS，50mmol/LEDTA，調(diào)pH到8.5，3mg/ml蛋白酶K(臨用前加入)3)雙重?zé)晒舛縋CR的反應(yīng)體系如下：試劑終濃度或單位體積中含量PCR10×buffer5μlMgCl24mmol/LdNTP(含dUTP)0.48mmol/LTagDNA聚合酶0.5UUNG酶0.2UHHV-6引物0.29μmol/LHHV-6探針0.24μmol/LHHV-8引物0.31μmol/LHHV-8探針0.24μmol/LDNA模板5μlddH2O加至50μl總反應(yīng)體積50μl4)陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品：含有HSV1、HSV2的無(wú)菌雙蒸水。5)陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)品：HHV-6(A型U1102株、B型Z29株)，濃度為1×109Copies/L；HHV-8(GK株)，濃度為1×109Copies/L。使用上述試劑盒時(shí)，雙重?zé)晒舛縋CR的反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃2min，95℃5min，95℃15s、62℃30s、40個(gè)循環(huán)，62℃開(kāi)始收集熒光信號(hào)。試驗(yàn)例1將實(shí)施例2中的熒光定量PCR試劑盒，針對(duì)70例疑似HHV患者的全血樣本DNA雙重?zé)晒舛縋CR。(1)雙重?zé)晒舛縋CR標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建將HHV-6、HHV-8的陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為5.0×108Copies/ml、5.0×107Copies/ml、5.0×106Copies/ml、5.0×105Copies/ml、5.0×104Copies/ml、5.0×103Copies/ml、5.0×102Copies/ml。。將上述稀釋品利用雙重?zé)晒舛縋CR的反應(yīng)體系擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為50℃2min，95℃5min，95℃15s、62℃30s、40個(gè)循環(huán)，62℃開(kāi)始收集熒光信號(hào)。然后根據(jù)質(zhì)粒模板拷貝數(shù)及Ct值構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2)針對(duì)每個(gè)疑似HHV患者樣本進(jìn)行雙重?zé)晒舛縋CR擴(kuò)增。分別對(duì)每個(gè)疑似HHV患者全血樣本進(jìn)行DNA提取，然后對(duì)每個(gè)DNA樣本重復(fù)三次雙重?zé)晒舛縋CR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件同上，每次試驗(yàn)均需構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線并同時(shí)擴(kuò)增陰性對(duì)照(HSV1、HSV2)。試驗(yàn)例2同樣將實(shí)施例2中的熒光定量PCR試劑盒，針對(duì)70例疑似HHV患者的全血樣本DNA雙重?zé)晒舛縋CR，試驗(yàn)過(guò)程與試驗(yàn)例1相同，不同點(diǎn)僅在于雙重?zé)晒舛縋CR的擴(kuò)增條件為50℃2min，95℃5min，95℃15s58℃40s、40個(gè)循環(huán)，58℃結(jié)束開(kāi)始收集熒光信號(hào)。結(jié)果1、雙重?zé)晒舛縋CR的靈敏度、線性范圍和特異性圖1顯示雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)HHV-6、HHV-8的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其動(dòng)力學(xué)范圍包括7個(gè)數(shù)量級(jí)(102～108Copies/ml)，相關(guān)系數(shù)分別為0.9911和0.9923，平均斜率為-3.4(HHV-6為-3.43，HHV-8為-3.37)符合標(biāo)準(zhǔn)曲線的要求。HHV-6、HHV-8有近似的敏感性，靈敏度達(dá)到1.0×102Copies/mL。每次實(shí)驗(yàn)中HHV-6、HHV-8的標(biāo)準(zhǔn)株均有擴(kuò)增曲線，HSV1、HSV2均無(wú)擴(kuò)增曲線，表明方法有很好的特異性。1、試驗(yàn)例1的雙重?zé)晒舛縋CR的臨床評(píng)價(jià)以DNA測(cè)序方法作為金標(biāo)準(zhǔn)，與試驗(yàn)例1雙重?zé)晒舛縋CR進(jìn)行70例患者血樣結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果檢測(cè)出的HHV-6，HHV-8的陽(yáng)性率分別為41.4％、2.8％，經(jīng)過(guò)與測(cè)序結(jié)果比對(duì)，雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)HHV-6，HHV-8的靈敏度均達(dá)到100％，特異性分別為96.3％、100％，見(jiàn)表1，表明方法的靈敏度和特異性均符合臨床應(yīng)用的要求。表1.臨床樣本中雙重PCR與測(cè)序結(jié)果的比較2、試驗(yàn)例2的雙重?zé)晒舛縋CR的臨床評(píng)價(jià)以DNA測(cè)序方法作為金標(biāo)準(zhǔn)，與試驗(yàn)例2雙重?zé)晒舛縋CR進(jìn)行70例患者血樣結(jié)果進(jìn)行比較，見(jiàn)表2。表2.臨床樣本中雙重PCR與測(cè)序結(jié)果的比較對(duì)比表1和表2，反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序的選擇對(duì)結(jié)果有顯著影響，試驗(yàn)例1通過(guò)對(duì)上述條件的優(yōu)化可以達(dá)到較佳效果。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3