本發(fā)明涉及一種禽類腸道凝結(jié)芽孢桿菌定量檢測試劑盒及檢測方法，屬于微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)為革蘭氏陽性菌，屬厚壁菌門，營養(yǎng)細(xì)胞呈桿狀，兩端鈍圓，在培養(yǎng)基中呈單個或成對出現(xiàn)，少數(shù)呈短鏈狀。菌落形態(tài)為不透明白色，呈圓形，表面突出。凝結(jié)芽孢桿菌的最適生長溫度為37～45℃，最適pH為6.6～7.0。該菌可以產(chǎn)生芽孢，對環(huán)境有很強(qiáng)的抗性，其芽孢經(jīng)90℃處理10min或100℃處理5min不會失活。在室溫干燥情況下，固體芽孢可保存3～5年不失活。

凝結(jié)芽孢桿菌比其他種類的腸道益生菌更能耐受胃酸和消化酶的作用。在胃中芽孢吸收水分而膨脹，代謝加快，進(jìn)入十二指腸既能萌發(fā)為營養(yǎng)細(xì)胞并生長繁殖，定居于腸道各段。凝結(jié)芽孢桿菌在腸道內(nèi)大量生長繁殖，一方面消耗腸道中的游離氧，產(chǎn)生有利于腸道益生菌生長的厭氧環(huán)境，另一方面產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物，如L(+)-乳酸、凝固素、Lactosporin、α-淀粉酶、脂肪酶及蛋白酶等，這些物質(zhì)均為生物活性成分，能有效抑制腸道內(nèi)有害菌生長繁殖，發(fā)揮其益生菌功效。

目前，凝結(jié)芽孢桿菌作為微生態(tài)制劑的有效菌種在家禽生產(chǎn)上已得到廣泛應(yīng)用。但是該菌種在家禽腸道內(nèi)的計數(shù)卻十分困難。眾所周知，腸道微生物與寄主之間是一種互利共生關(guān)系，不同畜禽品種其腸道微生物的種類和數(shù)量存在明顯差異，如何實(shí)現(xiàn)腸道內(nèi)凝結(jié)芽孢桿菌的定量檢測是一項(xiàng)亟待解決的難題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種禽類腸道凝結(jié)芽孢桿菌定量檢測試劑盒。

同時，本發(fā)明還提供一種禽類腸道凝結(jié)芽孢桿菌定量檢測的方法。

為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

禽類腸道凝結(jié)芽孢桿菌定量檢測試劑盒，包括以下引物：

BaciS：5'-GGCAACCTGCCTGTAAGA-3'；

BaciAS：5'-TGTAAGTGRCAGCCGAAGC-3'，R指代堿基A或G。

具體的，禽類腸道凝結(jié)芽孢桿菌定量檢測試劑盒還包括2×SYBR qPCR mix、Baci標(biāo)準(zhǔn)濃度質(zhì)粒DNA、ddH₂O、DNA Marker和使用說明書等。

更具體的，禽類腸道凝結(jié)芽孢桿菌定量檢測試劑盒的組成為：2×SYBR qPCR mix500μL，10μmol/L BaciS 50μL，10μmol/L BaciAS 50μL，系列濃度(10¹～10⁸分子/μL)Baci質(zhì)粒DNA各10μL，ddH₂O 1mL。

禽類腸道凝結(jié)芽孢桿菌定量檢測的方法，包括以下步驟：

1)以待檢測樣品總基因組DNA為模板，用引物BaciS、BaciAS進(jìn)行熒光實(shí)時定量PCR擴(kuò)增；

2)擴(kuò)增反應(yīng)完畢，測定溶液的Cq值，并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到樣品中凝結(jié)芽孢桿菌的濃度。

步驟1)中擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：2×SYBR qPCR mix 10.0μL，10μmol/L BaciS 0.7μL，10μmol/L BaciAS 0.7μL，待檢測樣品總基因組DNA 1.0～2.0μL，ddH₂O 6.6～7.6μL，共計20.0μL。

步驟1)中擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94℃變性15s；60℃退火20s；72℃延伸20s，采集熒光信號；最后72℃延伸5min。

步驟2)中擴(kuò)增所得片段的核苷酸序列見SEQ ID NO:1。

步驟2)中標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作步驟為：以Baci標(biāo)準(zhǔn)濃度質(zhì)粒DNA為模板，分別用引物BaciS、BaciAS進(jìn)行熒光實(shí)時定量PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增完畢，測定各溶液的Cq值，建立Cq值與對應(yīng)濃度的對數(shù)值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。進(jìn)一步作回歸分析，得到線性回歸方程。

所述擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：2×SYBR qPCR mix 10.0μL，10μmol/L BaciS 0.7μL，10μmol/LBaciAS 0.7μL，Baci標(biāo)準(zhǔn)濃度質(zhì)粒DNA(濃度10¹～10⁸分子/μL)1.0～2.0μL，ddH₂O 6.6～7.6μL，共計20.0μL。擴(kuò)增的反應(yīng)程序同上。

本發(fā)明的有益效果：

熒光實(shí)時定量PCR能夠快速、準(zhǔn)確定量樣品中的核酸濃度，因此可用于腸道微生物的分類和定量研究。本發(fā)明以凝結(jié)芽孢桿菌基因組18S rDNA中保守序列為目標(biāo)檢測片段，采用生物信息學(xué)方法設(shè)計合成覆蓋目標(biāo)片段的特異性引物序列，結(jié)合熒光實(shí)時定量核酸擴(kuò)增技術(shù)，定量分析禽類腸道內(nèi)凝結(jié)芽孢桿菌。與其他腸道微生物計數(shù)方法相比，該方法具有操作簡便、快速高效、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)，適于高通量檢測分析。

本發(fā)明中用于定量分析禽類腸道內(nèi)凝膠芽孢桿菌的試劑盒包含2×SYBR qPCR mix、Baci標(biāo)準(zhǔn)濃度質(zhì)粒DNA、引物對BaciS/BaciAS等組分，其中引物對BaciS/BaciAS根據(jù)禽類腸道微生物宏基因組特點(diǎn)設(shè)計，能夠特異性地擴(kuò)增禽類腸道中凝結(jié)芽孢桿菌基因組18SrDNA的保守序列，而不會擴(kuò)增禽類腸道中其他種類微生物的同源基因序列，具有較高的特異性和準(zhǔn)確性。使用時，先按照說明書配制qPCR反應(yīng)體系，設(shè)定反應(yīng)程序，進(jìn)行熒光實(shí)時定量PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)完畢，測定溶液的Cq值，并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方法，計算得到待測樣品中凝結(jié)芽孢桿菌的濃度。

附圖說明

圖1為本發(fā)明中qPCR的反應(yīng)程序；

圖2為實(shí)施例2中qPCR的擴(kuò)增曲線；

圖3為實(shí)施例2中qPCR的溶解曲線；

圖4為實(shí)施例2中qPCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性回歸方程。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例僅對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制。

實(shí)施例1

禽類腸道凝結(jié)芽孢桿菌定量檢測試劑盒的組成為：2×SYBR qPCR mix(購自北京索萊寶科技有限公司)500μL，10μmol/L BaciS 50μL，10μmol/L BaciAS 50μL，系列濃度(10¹～10⁸分子/μL)Baci質(zhì)粒DNA各10μL，ddH₂O 1mL，DNA Marker和試劑盒使用說明書一份。其中，引物BaciS、BaciAS的核苷酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示。

實(shí)施例2

禽類腸道凝結(jié)芽孢桿菌定量檢測的方法，包括以下步驟：

1)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

以Baci標(biāo)準(zhǔn)濃度質(zhì)粒DNA為模板(濃度見下表1)，配制qPCR反應(yīng)體系(組成見下表2)，分別用引物BaciS、BaciAS(如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示)進(jìn)行熒光實(shí)時定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序如圖1所示，即94℃預(yù)變性3min；94℃變性15s；60℃退火20s；72℃延伸20s，采集熒光信號；最后72℃延伸5min。

表1 Baci標(biāo)準(zhǔn)濃度質(zhì)粒DNA的濃度

表2 qPCR反應(yīng)體系

擴(kuò)增反應(yīng)完畢，得到qPCR擴(kuò)增曲線(見圖2)，同時添加融解曲線(見圖3)。由圖2可知，Baci標(biāo)準(zhǔn)濃度質(zhì)粒DNA的稀釋倍數(shù)合適；由圖3可知，qPCR產(chǎn)物單一，可排除非特異性擴(kuò)增和異常擴(kuò)增。

建立Baci標(biāo)準(zhǔn)濃度質(zhì)粒DNA的Cq值(X)與對應(yīng)濃度的對數(shù)值(Y)之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖4)，作回歸分析，得到線性回歸方程：Y＝-0.3687X+13.418，R²＝0.9572。因?yàn)锽aci標(biāo)準(zhǔn)濃度質(zhì)粒DNA是以10為倍數(shù)稀釋的，所以后面需要計算10^Y確定凝結(jié)芽孢桿菌的濃度。

2)提取待檢測樣品中腸道微生物總基因組DNA，并以此為模板用引物BaciS、BaciAS進(jìn)行熒光實(shí)時定量PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：2×SYBR qPCR mix 10.0μL，10μmol/LBaciS 0.7μL，10μmol/L BaciAS 0.7μL，腸道微生物總基因組DNA 1.6μL，ddH₂O 7.0μL，共計20.0μL；反應(yīng)程序同上。

3)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，測定溶液的Cq值為29.87，代入線性回歸方程，得到Y(jié)＝2.4049，則每微升樣品基因組DNA中的凝結(jié)芽孢桿菌數(shù)量為10^2.4049≈254個。