本發(fā)明涉及一種個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定的方法和系統(tǒng)，尤其涉及一種對(duì)未知豬檢材進(jìn)行個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定的方法和系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
：微衛(wèi)星標(biāo)記(microsatellite)，又稱短串聯(lián)重復(fù)序列(shorttandemrepeats,STRs)或簡單重復(fù)序列(simplesequencerepeats),是指重復(fù)單位長度為2-6個(gè)堿基的重復(fù)序列。由于重復(fù)單位的重復(fù)次數(shù)在個(gè)體間呈高度變異性并且數(shù)量豐富，因此STR是目前法醫(yī)DNA分析中最常用的一類遺傳標(biāo)記。法醫(yī)DNA分析技術(shù)除了對(duì)人類進(jìn)行DNA分析外，還可對(duì)動(dòng)物進(jìn)行種屬鑒定、個(gè)體識(shí)別及親權(quán)關(guān)系鑒定。豬是我國農(nóng)村常見的家畜，隨著人們對(duì)親子鑒定技術(shù)了解的加深，越來越多的民事及刑事案件中要求對(duì)豬進(jìn)行親子鑒定和個(gè)體識(shí)別，另外養(yǎng)豬業(yè)也是我國畜牧業(yè)和農(nóng)村支柱產(chǎn)業(yè)的重要組成部分，種屬分析在豬育種方面也具有重要的作用。專利CN102154280A中公開了一種豬微衛(wèi)星標(biāo)記的復(fù)合擴(kuò)增的方法及其專用引物。其選取了10個(gè)二核苷酸重復(fù)序列，分別為：SW240，SW951，SW857，S0155，S0386，SW902，S0255，S0101，S0227，S0355，構(gòu)建了十重復(fù)合擴(kuò)增體系，為四色熒光檢測系統(tǒng)。但是，上述位點(diǎn)均為二核苷酸重復(fù)序列，分型結(jié)果中stutter峰比較嚴(yán)重，并且部分位點(diǎn)遺傳多態(tài)性較差，并且存在累積個(gè)體識(shí)別率較差的問題。如何提供一種可解決上述問題的檢測方法和系統(tǒng)成為有待解決的問題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種對(duì)未知豬檢材進(jìn)行個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定的方法，能獲得未知豬檢材包括12個(gè)常染色體STR基因座、以及性別決定基因座PigSTRAM在內(nèi)共13個(gè)基因座的分型結(jié)果，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)未知豬檢材的個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定。本發(fā)明還提供一種對(duì)未知豬檢材進(jìn)行個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定的系統(tǒng)，通過該系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)未知來源個(gè)體針對(duì)上述13個(gè)基因座的準(zhǔn)確分型，從而對(duì)未知豬檢材進(jìn)行個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定。本發(fā)明還提供了一種復(fù)合檢測體系，所述檢測體系能準(zhǔn)確獲得未知豬檢材包括12個(gè)常染色體STR基因座和性別決定基因座PigSTRAM在內(nèi)共13個(gè)基因座的分型結(jié)果。本發(fā)明還提供了一種檢測試劑盒，包括所述的復(fù)合檢測體系。本發(fā)明提供的一種對(duì)未知豬檢材進(jìn)行個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定的方法，該方法包括：1)提取未知豬檢材的DNA；2)獲得所述DNA包括12個(gè)常染色體STR基因座、以及性別決定基因座PigSTRAM在內(nèi)共13個(gè)基因座的分型結(jié)果，所述12個(gè)常染色體STR基因座為SW240、PigSTR13E、PigSTR15A、S0655、PigSTR11B、PigSTR14A、387A12F、PigSTR4C、PigSTR17A、PigSTR5C、PigSTR7B和S0386；3)根據(jù)未知豬檢材13個(gè)基因座的基因型進(jìn)行個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定。在本發(fā)明的方案中，所述13個(gè)基因座是申請人通過對(duì)大量豬個(gè)體的生存環(huán)境、種族起源等進(jìn)行綜合分析獲得的。所述未知豬檢材可以為來自豬的血液、組織等樣本，這些樣本的個(gè)體來源未知。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述2)包括采用與所述13個(gè)基因座一一對(duì)應(yīng)的13對(duì)擴(kuò)增引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增以獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的步驟；所述擴(kuò)增引物為序列表中SEQIDNo.1至SEQIDNo.26的核苷酸序列。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式中，其中2)還包括在獲得擴(kuò)增產(chǎn)物后，使用遺傳分析儀分析該擴(kuò)增產(chǎn)物，以獲得所述13個(gè)基因座的基因型的步驟。在本發(fā)明的方案中，所述遺傳分析儀可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)使用的遺傳分析儀，例如ABI3130或ABI3500型遺傳分析儀，通過ID-X軟件或其他GeneMapper軟件等分析該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物中所述13個(gè)基因座的基因型。本發(fā)明提供的一種對(duì)未知豬檢材進(jìn)行個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括DNA提取體系，復(fù)合檢測體系，以及推斷體系；所述DNA提取體系用于提取未知豬檢材的DNA；所述復(fù)合檢測體系用于獲得所述DNA包括12個(gè)常染色體STR基因座、以及性別決定基因座PigSTRAM在內(nèi)共13個(gè)基因座的分型結(jié)果，所述12個(gè)常染色體STR基因座為SW240、PigSTR13E、PigSTR15A、S0655、PigSTR11B、PigSTR14A、387A12F、PigSTR4C、PigSTR17A、PigSTR5C、PigSTR7B和S0386；所述推斷體系用于根據(jù)未知豬檢材13個(gè)基因座的基因型進(jìn)行個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述復(fù)合檢測體系用于采用與所述13個(gè)基因座一一對(duì)應(yīng)的13對(duì)擴(kuò)增引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增以獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，所述擴(kuò)增引物為序列表中SEQIDNo.1至SEQIDNo.26的核苷酸序列。更進(jìn)一步的，所述復(fù)合檢測體系還用于在獲得擴(kuò)增產(chǎn)物后，使用遺傳分析儀分析該擴(kuò)增產(chǎn)物，以獲得所述13個(gè)基因座的基因型。更進(jìn)一步的，所述遺傳分析儀利用針對(duì)各基因座的等位基因的分型標(biāo)準(zhǔn)物來確定未知豬檢材DNA中各基因座的基因型。本發(fā)明提供的一種復(fù)合檢測體系，所述體系包括未知豬檢材DNA，13個(gè)基因座，以及擴(kuò)增引物，所述復(fù)合檢測體系用于獲得所述DNA包括12個(gè)常染色體STR基因座、以及性別決定基因座PigSTRAM在內(nèi)共13個(gè)基因座的分型結(jié)果，所述12個(gè)常染色體STR基因座為SW240、PigSTR13E、PigSTR15A、S0655、PigSTR11B、PigSTR14A、387A12F、PigSTR4C、PigSTR17A、PigSTR5C、PigSTR7B和S0386；所述擴(kuò)增引物由與所述13個(gè)基因座一一對(duì)應(yīng)的13對(duì)擴(kuò)增引物組成，所述擴(kuò)增引物為序列表中SEQIDNo.1至SEQIDNo.26的核苷酸序列。在本發(fā)明的方案中，所述DNA聚合酶可以是FastStartDNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、HotstartDNA聚合酶中的一種或多種。本發(fā)明還提供了一種檢測試劑盒，包括所述的復(fù)合檢測體系。在本發(fā)明的方案中，本發(fā)明利用所述復(fù)合檢測體系進(jìn)行13個(gè)基因座的分型的方法，包括：1)將提取的未知豬檢材DNA作為模板；2)使用所述擴(kuò)增引物對(duì)作為模板的未知豬檢材DNA進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)以得到擴(kuò)增產(chǎn)物；3)將所述擴(kuò)增產(chǎn)物利用遺傳分析儀進(jìn)行分析，以獲得13個(gè)基因座的分型結(jié)果。在本發(fā)明的方案中，所述13個(gè)基因座信息如表1所示：表1本發(fā)明提供的優(yōu)選擴(kuò)增引物序列如下。所述13對(duì)擴(kuò)增引物及其相對(duì)應(yīng)的基因座如下表2所示，PCRU代表上游引物，PCRL代表下游引物；表2本發(fā)明方案具有以下的優(yōu)點(diǎn)：1、本發(fā)明的檢測方法和檢測系統(tǒng)采用特定的STR基因座組合中二核苷酸重復(fù)序列2個(gè)，四核苷酸重復(fù)序列10個(gè)，性別決定基因座1個(gè)，減少了現(xiàn)有檢測系統(tǒng)的檢測結(jié)果中存在嚴(yán)重的stutter峰的問題。2、本發(fā)明的檢測方法和檢測系統(tǒng)采用特定組合的13個(gè)基因座，解決了現(xiàn)有檢測系統(tǒng)中遺傳多態(tài)性差及累積個(gè)體識(shí)別率和累積非父排除率不高的問題。3、本發(fā)明的方案可以通過使用熒光標(biāo)記，利用常規(guī)的遺傳分析儀，根據(jù)所要擴(kuò)增的基因的分子量和熒光顏色的不同，獲得直觀的檢測結(jié)果，并且該結(jié)果與現(xiàn)有檢測系統(tǒng)相比，準(zhǔn)確性為100％。4、本發(fā)明提供的方案能有效從基因水平實(shí)現(xiàn)對(duì)未知豬個(gè)體來源的推斷，為其個(gè)體識(shí)別及親權(quán)關(guān)系鑒定提供準(zhǔn)確的科學(xué)依據(jù)。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例中使用的100份豬抗凝血(雄性53份，雌性47份)，由公安部物證鑒定中心提供；在240例豬的無關(guān)個(gè)體來自公安部物證鑒定中心。以下實(shí)施例中使用的方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用試劑耗材和儀器如下表3所示：表3實(shí)施例1、對(duì)本發(fā)明的對(duì)未知豬檢材進(jìn)行個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定的方法和系統(tǒng)準(zhǔn)確性的驗(yàn)證在本實(shí)施例中，所述未知豬檢材為100份豬抗凝血(雄性53份，雌性47份)，已知其個(gè)體來源，但在本申請實(shí)施例1的實(shí)施過程中設(shè)定其個(gè)體來源未知，采用本申請方法和系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定，包括：1)利用本發(fā)明的系統(tǒng)中的DNA提取體系提取未知豬檢材的DNA，2)利用本發(fā)明的系統(tǒng)中的復(fù)合檢測體系獲得所述DNA包括12個(gè)常染色體STR基因座以及性別決定基因座PigSTRAM在內(nèi)共13個(gè)基因座的分型結(jié)果，3)利用本發(fā)明的系統(tǒng)中所述推斷體系，根據(jù)未知豬檢材13個(gè)基因座的基因型進(jìn)行個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定。本實(shí)施例中，所述復(fù)合檢測體系包括未知豬檢材DNA，13個(gè)基因座，以及擴(kuò)增引物，所述復(fù)合檢測體系用于獲得所述DNA包括12個(gè)常染色體STR基因座、以及性別決定基因座PigSTRAM在內(nèi)共13個(gè)基因座的分型結(jié)果，所述12個(gè)常染色體STR基因座為SW240、PigSTR13E、PigSTR15A、S0655、PigSTR11B、PigSTR14A、387A12F、PigSTR4C、PigSTR17A、PigSTR5C、PigSTR7B和S0386；所述擴(kuò)增引物由與所述13個(gè)基因座一一對(duì)應(yīng)的13對(duì)擴(kuò)增引物組成，所述擴(kuò)增引物為序列表中SEQIDNo.1至SEQIDNo.26的核苷酸序列。1、提取待檢測的100個(gè)樣本的DNA作為模板采用QIAampDNABloodMidi試劑盒(QIAGEN公司，德國)分別提取上述100個(gè)樣本的DNA，使用NanoDrop2000cSpectrophotometer(Thermo公司，美國)進(jìn)行定量。提取DNA步驟和定量步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。2、利用所述復(fù)合檢測體系進(jìn)行13個(gè)基因座的分型，包括：將提取的未知豬檢材DNA作為模板；使用所述擴(kuò)增引物對(duì)提取的DNA模板進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；將擴(kuò)增產(chǎn)物利用遺傳分析儀確定13個(gè)基因座的分型結(jié)果。具體過程如下：2.1、引物池配置擴(kuò)增引物池的配置，其中所述擴(kuò)增引物中為所述13個(gè)基因座一一對(duì)應(yīng)的13對(duì)擴(kuò)增引物，本實(shí)施例中，優(yōu)選的，所述13個(gè)基因座的擴(kuò)增引物為序列表中SEQIDNo.1至SEQIDNo.26的核苷酸序列；本發(fā)明提供的各種引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。將合成好的引物用1×TE緩沖液稀釋到100μM，將13個(gè)基因座的上下游引物等比混合，得到濃度為50μM的引物。從13管PCR引物中分別取不同體積加入到一個(gè)新的離心管中，作為13重PCR引物池，引物池中針對(duì)各STR位點(diǎn)的引物的終濃度如下表4所示：表4基因座基因座終濃度(μM)SW240SW2400.5PigSTR13E13E0.5PigSTR15A15A0.3S0655S06550.4PigSTR11B11B0.4PigSTR14A14A0.3387A12F12F0.3PigSTR4C4C0.4PigSTR17A17A0.3PigSTR5C5C0.5PigSTR7B7B0.3S0386S03861PigSTRAMAmelogenin0.32.2、多重PCR反應(yīng)本實(shí)施例使用9700型PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行多重PCR反應(yīng)。(1)配置PCRmix(25μL體系)，如下表5所示。表5試劑名稱濃度PCR引物池12.5μLTris-HCl20mMKCl50mMMgCl21.6mM牛血清白蛋白0.8mg/mlTween-200.2％甘油3.2％NaN30.02％dNTP200μMTaq酶2U未知豬檢材DNA模板(1ng/μL)1μL總計(jì)25μL(2)擴(kuò)增程序PCR擴(kuò)增過程的熱循環(huán)參數(shù)為：①95℃，11min；②28個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)94℃1min，60℃1min，72℃1min；③72℃，60min；④25℃，保溫。2.3、PCR產(chǎn)物分型待分型樣品的準(zhǔn)備：1.電泳上樣混合物的準(zhǔn)備，按下面比率準(zhǔn)備內(nèi)標(biāo)和去離子甲酰胺組成上樣混合物：10μlTyper500內(nèi)標(biāo)+1000μl去離子甲酰胺，混合均勻。2.每管加入10μl上樣混合物、1μl擴(kuò)增產(chǎn)物，混勻。3.95℃變性3分鐘，立即放在冰上冷卻3分鐘，之后電泳。ABI3130XL型遺傳分析儀上進(jìn)行檢測。應(yīng)用ABI3130XLDateCollectionSoftware3.1收集數(shù)據(jù)，GeneMapper3.3軟件對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行分析，獲得所述13個(gè)基因座的基因型。2.4、結(jié)果分析為了驗(yàn)證分型結(jié)果的準(zhǔn)確性，從100份DNA樣品中隨機(jī)抽取50份DNA樣品，對(duì)13個(gè)基因座進(jìn)行測序(北京邁奧德恩生物科技有限公司測序)，采用本實(shí)施例的復(fù)合檢測體系獲得的所有的分型結(jié)果與測序結(jié)果均一致，一致性達(dá)到100％，此結(jié)果證本發(fā)明復(fù)合檢測體系分型結(jié)果準(zhǔn)確。3、根據(jù)未知豬檢材13個(gè)基因座的基因型進(jìn)行個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定由本實(shí)施例方法獲得的上述100份檢材的個(gè)體來源和親權(quán)鑒定結(jié)果，與其已知的個(gè)體來源和親權(quán)鑒定結(jié)果一致，說明本發(fā)明方法可以對(duì)未知豬檢材的個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定。實(shí)施例2本發(fā)明檢測系統(tǒng)的累積個(gè)體識(shí)別率和累積非父排除率分析采用本發(fā)明系統(tǒng)按照實(shí)施例1所述方法獲得240例豬的無關(guān)個(gè)體的分型結(jié)果，并計(jì)算這些結(jié)果中針對(duì)12個(gè)常染色體STR基因座，中國豬的個(gè)體識(shí)別率、雜合度、多態(tài)性信息含量、非父排除率以及匹配概率。具體的，采用Powerstatsv1.2軟件計(jì)算個(gè)體識(shí)別率(DP)、雜合度(H)、多態(tài)信息含量(PIC)、非父排除率(PE)、匹配概率(Pm)，如下表6所示。并根據(jù)以下公式1-2計(jì)算累積非父排除率和累積個(gè)體識(shí)別力。表6DPHPICPEPm4C0.9090.6420.740.3440.0915C0.9000.6330.750.3330.1007B0.9160.6830.740.4030.08411B0.8000.5130.610.1990.20012F0.9720.7950.900.5900.02813E0.8550.5060.640.1930.14514A0.8520.5830.630.2710.14815A0.9550.5750.880.2620.04517A0.9360.6960.790.4220.064S03860.9500.6960.830.4220.050S06550.9220.3330.840.0780.078SW2400.9620.7920.860.5840.038累積個(gè)體識(shí)別能力計(jì)算公式1：TDP＝1-(1-DP1)(1-DP2)(1-DP3)…(1-DPK),DPK為第k個(gè)基因座的DP值。累積非父排除率計(jì)算公式2:CEP＝1-(1-PE1)(1-PE2)(1-PE3)…(1-PEK),PEK為第k個(gè)基因座的PE值?？梢钥闯?，上述12個(gè)豬的STR基因座累計(jì)匹配概率(PM)為3.9208×10-14，累計(jì)個(gè)體識(shí)別力(TDP)為0.999999999999961，累計(jì)非父排除概率(CEP)為0.9952。而CN102154280A檢測系統(tǒng)的累積個(gè)體識(shí)別力(TDP)和累積非父排除率(CEP)為0.99999998和0.9921。可以看出，本申請的檢測系統(tǒng)大大提高了對(duì)豬檢材的個(gè)體識(shí)別率，解決了現(xiàn)有檢測系統(tǒng)累積個(gè)體識(shí)別率和累積非父排除率不高的問題。當(dāng)前第1頁1 2 3