本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種DNA測(cè)序方法。
背景技術(shù)：
：DNA是遺傳信息的載體，其內(nèi)四種堿基對(duì)的特定排列順序是遺傳信息的本質(zhì)所在。確定DNA中堿基對(duì)的特定排列順序被稱為DNA測(cè)序，其對(duì)于揭示生命奧秘、控制遺傳過程、推動(dòng)疾病診斷、提升醫(yī)療技術(shù)有著根本的促進(jìn)作用。迄今為止，先后已經(jīng)有兩代測(cè)序技術(shù)被成功研發(fā)并得到廣泛應(yīng)用：第一代基于雙脫氧鏈終止法的測(cè)序技術(shù)打開了人類揭示遺傳奧秘的大門，奠定了基因工程最為重要的基礎(chǔ)；第二代大規(guī)模平行合成熒光檢測(cè)法，則是在第一代測(cè)序技術(shù)的基礎(chǔ)上，利用PCR擴(kuò)增及熒光檢測(cè)技術(shù)，該方法在很大程度上提高了測(cè)序的效率，為第一個(gè)人類基因組測(cè)序的完成做出了巨大貢獻(xiàn)。盡管前兩代測(cè)序技術(shù)發(fā)展的很成熟，但是仍舊有許多弊端亟待解決，如PCR擴(kuò)增耗時(shí)長(zhǎng)成本高，熒光標(biāo)記及檢測(cè)過程復(fù)雜不穩(wěn)定等等。同時(shí)，隨著人類對(duì)生命本質(zhì)的理解加深和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域技術(shù)手段的不斷進(jìn)步，個(gè)性化治療方案及分子診斷逐漸成為熱點(diǎn)，這對(duì)DNA測(cè)序提出了更高的要求。因此，如何快速、準(zhǔn)確、低成本進(jìn)行DNA測(cè)序已經(jīng)成為炙手可熱的研究領(lǐng)域。目前相對(duì)成熟的DNA測(cè)序技術(shù)是基于納米孔的電學(xué)測(cè)試平臺(tái)，甚至已經(jīng)有商業(yè)化測(cè)試儀原型出現(xiàn)，但還存在諸多缺陷，如DNA移動(dòng)速度難以控制、測(cè)序信號(hào)分辨率低、測(cè)序不準(zhǔn)確等等，使基于此方法的測(cè)序技術(shù)的發(fā)展陷入瓶頸。隨著各種新型納米材料的不斷涌現(xiàn)，以及微納加工技術(shù)的不斷升級(jí)進(jìn)步，具有單分子檢測(cè)能力的器件平臺(tái)迅猛發(fā)展，為DNA測(cè)序的持續(xù)推進(jìn)提供源源不斷的動(dòng)力和機(jī)會(huì)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何進(jìn)行DNA測(cè)序。為解決上述問題，本發(fā)明首先提供了DNA測(cè)序方法。本發(fā)明所提供的DNA測(cè)序方法具體可為方法一，依次可包括如下步驟：(1)在待測(cè)DNA的3’末端增加標(biāo)簽序列，形成含有標(biāo)簽序列的待測(cè)DNA；所述標(biāo)簽序列的核苷酸序列與測(cè)序引物的核苷酸序列反向互補(bǔ)；(2)將所述含有標(biāo)簽序列的待測(cè)DNA和所述測(cè)序引物混合，形成5’末端雙鏈主體單鏈形式的產(chǎn)物；(3)完成步驟(2)后，將產(chǎn)物分別與dATP、dCTP、dTTP和dGTP混合，得到四個(gè)體系，分別將每個(gè)體系加入特異DNA聚合酶修飾的單分子器件，讀取電信號(hào)，與其它三個(gè)體系的電信號(hào)顯著不同的體系中的dNTP即為a1)或a2)：a1)所述待測(cè)DNA的3’末端的第一個(gè)核苷酸；a2)所述待測(cè)DNA的3’末端的第一區(qū)段的核苷酸；所述第一區(qū)段由N個(gè)核苷酸組成，N為自然數(shù)且大于等于2。本發(fā)明所提供的DNA測(cè)序方法具體可為方法二，依次可包括如下步驟：(1)在待測(cè)DNA的3’末端增加標(biāo)簽序列，形成含有標(biāo)簽序列的待測(cè)DNA；所述標(biāo)簽序列的核苷酸序列與測(cè)序引物的核苷酸序列反向互補(bǔ)；(2)將所述含有標(biāo)簽序列的待測(cè)DNA和所述測(cè)序引物混合，形成5’末端雙鏈主體單鏈形式的產(chǎn)物；(3)完成步驟(2)后，將產(chǎn)物分別與dATP、dCTP、dTTP和dGTP混合，得到四個(gè)體系，分別將每個(gè)體系加入特異DNA聚合酶修飾的單分子器件，讀取電信號(hào)，與其它三個(gè)體系的電信號(hào)顯著不同的體系中的dNTP即為a1)或a2)：a1)所述待測(cè)DNA的3’末端的第一個(gè)核苷酸；a2)所述待測(cè)DNA的3’末端的第一區(qū)段的核苷酸；所述第一區(qū)段由N個(gè)核苷酸組成，N為自然數(shù)且大于等于2；(4)將前一步驟中與其它三個(gè)體系的電信號(hào)顯著不同的體系的產(chǎn)物分別與dATP、dCTP、dTTP和dGTP混合，得到四個(gè)體系，分別將每個(gè)體系加入所述特異DNA聚合酶修飾的單分子器件，讀取電信號(hào)，與其它三個(gè)體系的電信號(hào)顯著不同的體系中的dNTP即為b1)或b2)：b1)所述待測(cè)DNA的3’末端的第二個(gè)核苷酸；b2)所述待測(cè)DNA的3’末端的第二區(qū)段的核苷酸；所述第二區(qū)段由M個(gè)核苷酸組成，M為自然數(shù)且大于等于2。本發(fā)明所提供的DNA測(cè)序方法具體可為方法三，依次可包括如下步驟：(1)在待測(cè)DNA的3’末端增加標(biāo)簽序列，形成含有標(biāo)簽序列的待測(cè)DNA；所述標(biāo)簽序列的核苷酸序列與測(cè)序引物的核苷酸序列反向互補(bǔ)；(2)將所述含有標(biāo)簽序列的待測(cè)DNA和所述測(cè)序引物混合，形成5’末端雙鏈主體單鏈形式的產(chǎn)物；(3)完成步驟(2)后，將產(chǎn)物分別與dATP、dCTP、dTTP和dGTP混合，得到四個(gè)體系，分別將每個(gè)體系加入特異DNA聚合酶修飾的單分子器件，讀取電信號(hào)，與其它三個(gè)體系的電信號(hào)顯著不同的體系中的dNTP即為a1)或a2)：a1)所述待測(cè)DNA的3’末端的第一個(gè)核苷酸；a2)所述待測(cè)DNA的3’末端的第一區(qū)段的核苷酸；所述第一區(qū)段由N個(gè)核苷酸組成，N為自然數(shù)且大于等于2；(4)將前一步驟中與其它三個(gè)體系的電信號(hào)顯著不同的體系的產(chǎn)物分別與dATP、dCTP、dTTP和dGTP混合，得到四個(gè)體系，分別將每個(gè)體系加入所述特異DNA聚合酶修飾的單分子器件，讀取電信號(hào)，與其它三個(gè)體系的電信號(hào)顯著不同的體系中的dNTP即為b1)或b2)：b1)所述待測(cè)DNA的3’末端的第二個(gè)核苷酸；b2)所述待測(cè)DNA的3’末端的第二區(qū)段的核苷酸；所述第二區(qū)段由M個(gè)核苷酸組成，M為自然數(shù)且大于等于2；(5)重復(fù)步驟(4)，直至獲得所述待測(cè)DNA的測(cè)序結(jié)果。上述DNA測(cè)序方法中，所述a2)中，N具體可為50。上述DNA測(cè)序方法中，所述b2)中，M具體可為50。上述DNA測(cè)序方法中，所述待測(cè)DNA為單鏈DNA。當(dāng)待測(cè)DNA為雙鏈DNA時(shí)，需先變性，再和所述測(cè)序引物混合。上述DNA測(cè)序方法中，所述測(cè)序引物的核苷酸序列可如序列表中序列4自5’末端起第51至68位所示。上述DNA測(cè)序方法中，所述單分子器件可為以低維納米材料或單個(gè)分子為傳感核心的超靈敏電學(xué)測(cè)序器件。所述單分子器件可以是現(xiàn)有技術(shù)中任何能響應(yīng)單分子變化的器件，即本領(lǐng)域技術(shù)人員通過檢測(cè)或觀察該單分子器件的變化，便能知曉相應(yīng)的分子是否發(fā)生變化。以本發(fā)明為例，本發(fā)明使用了單分子器件，具體使用了以石墨烯或硅納米線作為電極的單分子器件，并使其與所述特異DNA聚合酶連接，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過檢測(cè)該單分子器件的電流變化，就可知曉所述特異DNA聚合酶的構(gòu)象是否發(fā)生了變化。上述DNA測(cè)序方法中，所述單分子器件具體可為c1)或c2)或c3)或c4)：c1)石墨烯基單分子器件；c2)硅納米線單分子器件；c3)一維納米材料單分子器件；c4)低維納米材料單分子器件。所述石墨烯基單分子器件和所述硅納米線單分子器件的制備過程均可參考文獻(xiàn)(CaoY，DongS，LiuS，HeL，GanL，YuX，SteigerwaldML，WuX，LiuZ，GuoX.Buildinghigh-throughputmolecularjunctionsusingindentedgraphenepointcontacts.AngewChemIntEdEngl.2012Dec3；51(49)：12228—32.)中記載的方法。所述特異DNA聚合酶和所述單分子器件的連接方式，可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知公用的任何方式，只要保證所述特異DNA聚合酶的活性和構(gòu)象變化即可。所述特異DNA聚合酶和所述石墨烯基單分子器件的連接方式具體可按照下述步驟進(jìn)行：(1)制備所述石墨烯基單分子器件；(2)將所述石墨烯基單分子器件和對(duì)苯二胺混合，得到末端被氨基修飾的石墨烯電極；(3)將1,3,5-tris(4-carbonylphenyloxy)benzene和所述末端被氨基修飾的石墨烯電極混合，得到電學(xué)回路；(4)將所述電學(xué)回路和N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽混合，得到Sulfo-NHS活化的電學(xué)回路；(5)將所述Sulfo-NHS活化的電學(xué)回路和N-(2-氨乙基)馬來酰亞胺鹽酸鹽混合，得到處理后的石墨烯基單分子器件；(6)將所述處理后的石墨烯基單分子器件和過量的所述特異DNA聚合酶混合，得到特異DNA聚合酶修飾的石墨烯基單分子器件。所述特異DNA聚合酶和所述硅納米線單分子器件的連接方式具體可按照下述步驟進(jìn)行：(1)制備所述硅納米線單分子器件；(2)將所述硅納米線單分子器件和HF溶液混合，得到刻蝕的硅納米線單分子器件；所述HF溶液由7體積份的40％(質(zhì)量百分比)的NH4F水溶液和1體積份的HF水溶液混合而成，其中HF水溶液的濃度為40％(質(zhì)量百分比)，具體可為北京化工廠的產(chǎn)品。(3)將所述刻蝕的硅納米線單分子器件和10—十一碳炔酸混合，得到電學(xué)回路；(4)將步驟(3)所述電學(xué)回路和N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽混合，得到Sulfo-NHS活化的電學(xué)回路；(5)將步驟(4)所述Sulfo-NHS活化的電學(xué)回路和N-(2-氨乙基)馬來酰亞胺鹽酸鹽混合，得到處理后的硅納米線單分子器件；(6)將所述處理后的硅納米線單分子器件和過量的所述特異DNA聚合酶混合，得到酶修飾的硅納米線單分子器件。上述DNA測(cè)序方法中，所述特異DNA聚合酶滿足如下條件：(1)具有DNA聚合酶的生物活性；(2)與所述單分子器件進(jìn)行連接且僅有一個(gè)連接位點(diǎn)，提供該連接位點(diǎn)的氨基酸殘基位于所述特異DNA聚合酶的構(gòu)象變化區(qū)；(3)提供該連接位點(diǎn)的氨基酸殘基在所述特異DNA聚合酶中僅出現(xiàn)一次。所述“與所述單分子器件進(jìn)行連接且僅有一個(gè)連接位點(diǎn)，提供該連接位點(diǎn)的氨基酸殘基位于所述特異DNA聚合酶的構(gòu)象變化區(qū)”指的是只有一個(gè)氨基酸殘基與單分子器件連接，且不影響所述特異DNA聚合酶的構(gòu)象變化。所述“提供該連接位點(diǎn)的氨基酸殘基在所述特異DNA聚合酶中僅出現(xiàn)一次”指的是：為了保證只有唯一一個(gè)連接位點(diǎn)，若所述特異DNA聚合酶中除了該連接位點(diǎn)外，在其它位置還有與該連接位點(diǎn)一致的氨基酸或氨基酸序列，則需將其它位置的氨基酸或氨基酸序列進(jìn)行修飾或突變，以防止其它位置的氨基酸或氨基酸序列與單分子器件連接。如果所述特異DNA聚合酶中，除了該唯一連接位點(diǎn)外，其余位置沒有與該唯一連接位點(diǎn)一致的氨基酸或氨基酸序列，則無需將其它位置的氨基酸或氨基酸序列進(jìn)行修飾或突變。所述修飾或突變指的是在不改變所述特異DNA聚合酶活性和構(gòu)象變化的情況下，結(jié)合本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)知識(shí)，進(jìn)行的修飾或突變，如本發(fā)明中，將序列表中序列1所示的氨基酸序列自N末端起第907位的半胱氨酸殘基替換為絲氨酸殘基。所述DNA聚合酶可為大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ。大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的氨基酸序列可如序列表中序列1所示，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。上述DNA測(cè)序方法中，所述特異DNA聚合酶可用微腔包被。所述微腔的材質(zhì)可為聚二甲基硅氧烷。每一個(gè)特異DNA聚合酶用一個(gè)所述微腔包被。上述DNA測(cè)序方法中，所述特異DNA聚合酶可為b1)或b2)或b3)：b1)氨基酸序列是序列表中序列3所示的蛋白質(zhì)；b2)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)；b3)將序列表中序列1所示的氨基酸序列自N末端起第907位的半胱氨酸殘基替換為非半胱氨酸殘基，第790位的亮氨酸殘基變?yōu)榘腚装彼釟埢?，得到的蛋白質(zhì)。所述b3)具體可為將序列表中序列1所示的氨基酸序列自N末端起第907位的半胱氨酸殘基替換為絲氨酸殘基，第790位的亮氨酸殘基變?yōu)榘腚装彼釟埢?，得到的蛋白質(zhì)。所述特異DNA聚合酶與所述單分子器件的連接時(shí)，所述特異DNA聚合酶的連接位點(diǎn)為序列表中序列1所示的氨基酸序列自N末端起第790位的半胱氨酸。上述DNA測(cè)序方法中，所述讀取電信號(hào)是通過檢測(cè)所述特異DNA聚合酶的構(gòu)象變化進(jìn)行的。所述特異DNA聚合酶也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述DNA測(cè)序方法中，所述待測(cè)DNA為5’-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3’、5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’、5’-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3’或5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了用于DNA測(cè)序的試劑盒。本發(fā)明所提供的DNA測(cè)序的試劑盒，具體可為試劑盒甲，所述試劑盒甲可包括上述任一所述特異DNA聚合酶。上述試劑盒甲中，還可包括所述測(cè)序引物。上述試劑盒甲中，還可包括上述任一所述單分子器件。上述試劑盒甲中，還可包括記載有上述任一所述DNA測(cè)序方法的載體。本發(fā)明所提供的DNA測(cè)序的試劑盒，具體可為試劑盒乙，所述試劑盒乙可包括上述任一所述特異DNA聚合酶修飾的單分子器件。上述試劑盒乙中，還可包括所述測(cè)序引物。上述試劑盒乙中，還可包括記載有上述任一所述DNA測(cè)序方法的載體。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所提供的方法可進(jìn)行DNA測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，DNA的合成速度與已有文獻(xiàn)(TivoliJ.Olsen，YongkiChoi，PatrickC.Sims，O.TolgaGul，BradL.Corso，ChengjunDong，WilliamA.Brown，PhilipG.CollinsandGregoryA.Weiss，ElectronicMeasurementsofSingle-MoleculeProcessingbyDNAPolymeraseI(KlenowFragment),JournaloftheAmericanChemicalSociety2013，135，7855-7860)記載的合成速度基本一致。本發(fā)明所提供的DNA測(cè)序方法具有重要的應(yīng)用價(jià)值。附圖說明圖1為酶修飾的石墨烯基單分子器件的制備。圖2為低分辨探針臺(tái)檢測(cè)電學(xué)性質(zhì)；其中Vsd為源漏偏壓，Isd為源漏電流。圖3為酶修飾的石墨烯基單分子器件和酶修飾的硅納米線單分子器件。圖4為半胱氨酸和處理后的石墨烯基單分子器件進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)式。圖5為采用酶修飾的石墨烯基單分子器件對(duì)模板鏈C進(jìn)行DNA測(cè)序的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)和峰值統(tǒng)計(jì)結(jié)果。圖6為采用酶修飾的石墨烯基單分子器件對(duì)模板鏈C進(jìn)行DNA測(cè)序的高態(tài)時(shí)間和低態(tài)時(shí)間的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。圖7為采用酶修飾的石墨烯基單分子器件對(duì)模板鏈A進(jìn)行DNA測(cè)序的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)和峰值統(tǒng)計(jì)結(jié)果。圖8為采用酶修飾的石墨烯基單分子器件對(duì)模板鏈A進(jìn)行DNA測(cè)序的高態(tài)時(shí)間和低態(tài)時(shí)間的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。圖9為采用酶修飾的石墨烯基單分子器件對(duì)模板鏈G進(jìn)行DNA測(cè)序的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)和峰值統(tǒng)計(jì)結(jié)果。圖10為采用酶修飾的石墨烯基單分子器件對(duì)模板鏈G進(jìn)行DNA測(cè)序的高態(tài)時(shí)間和低態(tài)時(shí)間的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。圖11為采用酶修飾的石墨烯基單分子器件對(duì)模板鏈T進(jìn)行DNA測(cè)序的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)和峰值統(tǒng)計(jì)結(jié)果。圖12為采用酶修飾的石墨烯基單分子器件對(duì)模板鏈T進(jìn)行DNA測(cè)序的高態(tài)時(shí)間和低態(tài)時(shí)間的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。圖13為酶修飾的硅納米線單分子器件的制備。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。DTT緩沖液為含50mMNaCl、10mMMgCl2和1mMDTT的pH7.8、10mMTris－HCl緩沖液。HF溶液：由7體積份的40％(質(zhì)量百分比)的NH4F水溶液和1體積份的HF水溶液混合而成；其中HF水溶液的濃度為40％(質(zhì)量百分比)，具體可為北京化工廠的產(chǎn)品。單鏈DNA分子甲：5’-(C)50ACTGGCCGTCGTTTTACA-3’(序列表中序列4所示)。單鏈DNA分子乙：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’(序列表中序列5所示)。單鏈DNA分子丙：5’-(A)50ACTGGCCGTCGTTTTACA-3’(序列表中序列6所示)。單鏈DNA分子?。?’-(G)50ACTGGCCGTCGTTTTACA-3’(序列表中序列7所示)。單鏈DNA分子戊：5’-(T)50ACTGGCCGTCGTTTTACA-3’(序列表中序列8所示)。模板鏈C的制備方法為：人工合成單鏈DNA分子甲和單鏈DNA分子乙，然后將10μL單鏈DNA分子甲(單鏈DNA分子甲的濃度為10μM)、10μL單鏈DNA分子乙(單鏈DNA分子乙的濃度為10μM)和980μLDTT緩沖液混合，70℃加熱1h，自然冷卻至室溫，即獲得模板鏈C。模板鏈C需在動(dòng)力學(xué)測(cè)試前3h制備。模板鏈A的制備方法為：人工合成單鏈DNA分子丙和單鏈DNA分子乙，然后將10μL單鏈DNA分子丙(單鏈DNA分子丙的濃度為10μM)、10μL單鏈DNA分子乙(單鏈DNA分子乙的濃度為10μM)和980μLDTT緩沖液混合，70℃加熱1h，自然冷卻至室溫，即獲得模板鏈A。模板鏈A需在動(dòng)力學(xué)測(cè)試前3h制備。模板鏈G的制備方法為：人工合成單鏈DNA分子丁和單鏈DNA分子乙，然后將10μL單鏈DNA分子丁(單鏈DNA分子丁的濃度為10μM)、10μL單鏈DNA分子乙(單鏈DNA分子乙的濃度為10μM)和980μLDTT緩沖液混合，70℃加熱1h，自然冷卻至室溫，即獲得模板鏈G。模板鏈G需在動(dòng)力學(xué)測(cè)試前3h制備。模板鏈T的制備方法為：人工合成單鏈DNA分子戊和單鏈DNA分子乙，然后將10μL單鏈DNA分子戊(單鏈DNA分子戊的濃度為10μM)、10μL單鏈DNA分子乙(單鏈DNA分子乙的濃度為10μM)和980μLDTT緩沖液混合，70℃加熱1h，自然冷卻至室溫，即獲得模板鏈T。模板鏈T需在動(dòng)力學(xué)測(cè)試前3h制備。低分辨探針臺(tái)由半導(dǎo)體參數(shù)儀(安捷倫公司的產(chǎn)品，型號(hào)為4155C)和探針臺(tái)(KarlSuess公司的產(chǎn)品，型號(hào)為PM5)兩個(gè)部分組成。高分辨探針臺(tái)由前置放大器(DigitalInstruments公司的產(chǎn)品，型號(hào)為DL1211)和鎖相放大器(ZurichInstruments公司的產(chǎn)品，型號(hào)為HF2LI)兩個(gè)核心部件組成。1,3,5-tris(4-carbonylphenyloxy)benzene為濟(jì)南恒化科技有限公司的產(chǎn)品。dATP溶液由DTT緩沖液溶解dATP獲得。dCTP溶液由DTT緩沖液溶解dCTP獲得。dTTP溶液由DTT緩沖液溶解dTTP獲得。dGTP溶液由DTT緩沖液溶解dGTP獲得。dATP、dCTP、dTTP和dGTP均為北京賽百盛基因技術(shù)有限公司的產(chǎn)品。實(shí)施例1、采用石墨烯基單分子器件進(jìn)行DNA測(cè)序一、酶修飾的石墨烯基單分子器件的制備1、制備石墨烯基單分子器件石墨烯基單分子器件的制備過程參考如下文獻(xiàn)：CaoY，DongS，LiuS，HeL，GanL，YuX，SteigerwaldML，WuX，LiuZ，GuoX.Buildinghigh-throughputmolecularjunctionsusingindentedgraphenepointcontacts.AngewChemIntEdEngl.2012Dec3；51(49)：12228—32.石墨烯基單分子器件上具有納米間隙的石墨烯電極(以下簡(jiǎn)稱石墨烯電極，其結(jié)構(gòu)式如圖1中(1))。2、末端氨基修飾完成步驟1后，將所述石墨烯基單分子器件和對(duì)苯二胺(見圖1中(2))混合，得到末端被氨基修飾的石墨烯電極。末端被氨基修飾的石墨烯電極的結(jié)構(gòu)式見圖1中(3)。3、電學(xué)回路的構(gòu)建完成步驟2后，將1,3,5-tris(4-carbonylphenyloxy)benzene(見圖1中(4))和末端被氨基修飾的石墨烯電極混合，得到電學(xué)回路。用低分辨探針臺(tái)檢測(cè)電學(xué)回路的電學(xué)性質(zhì)，結(jié)果見圖2中左上圖。電學(xué)回路的部分結(jié)構(gòu)式如圖1中(5)所示。4、NHS活化完成步驟3后，將電學(xué)回路和N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽(見圖1中(6))混合，得到Sulfo-NHS活化的電學(xué)回路。用低分辨探針臺(tái)檢測(cè)Sulfo-NHS活化的電學(xué)回路的電學(xué)性質(zhì)，結(jié)果見圖2中右上圖。NHS活化的電學(xué)回路的部分結(jié)構(gòu)式如圖1中(7)所示。5、處理后的石墨烯基單分子器件的獲得完成步驟4后，將Sulfo-NHS活化的電學(xué)回路和N-(2-氨乙基)馬來酰亞胺鹽酸鹽(見圖1中(8))混合，得到處理后的石墨烯基單分子器件。處理后的石墨烯基單分子器件的部分結(jié)構(gòu)式如圖1中(9)所示。用低分辨探針臺(tái)檢測(cè)處理后的石墨烯基單分子器件的電學(xué)性質(zhì)，結(jié)果見圖2中左下圖。6、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的改造(1)改造原則大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ(以下簡(jiǎn)稱DNA聚合酶Ⅰ)的氨基酸序列如序列表中序列1所示，核苷酸序列如序列表中序列2所示。改造后的DNA聚合酶Ⅰ需同時(shí)具有如下特點(diǎn)：(1)具有DNA聚合酶Ⅰ的生物活性，即指導(dǎo)DNA的合成；(2)改造后的DNA聚合酶Ⅰ可與處理后的石墨烯基單分子器件進(jìn)行連接且僅有一個(gè)連接位點(diǎn)，提供該連接位點(diǎn)的氨基酸殘基(命名為供體氨基酸殘基)應(yīng)位于改造后的DNA聚合酶Ⅰ的構(gòu)象變化區(qū)(目的為提高后續(xù)DNA測(cè)序的靈敏度)；(3)供體氨基酸殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸和非提供連接位點(diǎn)的氨基酸殘基(命名為非供體氨基酸殘基)對(duì)應(yīng)的氨基酸種類不同。(2)改造后的DNA聚合酶Ⅰ的獲得經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)，得到改造后的DNA聚合酶Ⅰ。改造后的DNA聚合酶Ⅰ(氨基酸序列如序列表中序列3所示)，由生工生物工程(上海)股份有限公司制備。改造后的DNA聚合酶Ⅰ為將DNA聚合酶Ⅰ(氨基酸序列如序列表中序列1所示)自N末端起第907位的半胱氨酸殘基變?yōu)榻z氨酸殘基，第790位的亮氨酸殘基變?yōu)榘腚装彼釟埢?。序列表中序?自N末端起第790位氨基酸殘基位于構(gòu)象變化區(qū)。7、酶修飾的石墨烯基單分子器件的制備完成步驟6后，將處理后的石墨烯基單分子器件和過量的改造后的DNA聚合酶Ⅰ(見圖1中(10))混合，得到酶修飾的石墨烯基單分子器件(圖3中左圖)，酶修飾的石墨烯基單分子器件的部分結(jié)構(gòu)式見圖1中(11)。用低分辨探針臺(tái)檢測(cè)酶修飾的石墨烯基單分子器件的電學(xué)性質(zhì)，結(jié)果見圖2中右下圖。改造后的DNA聚合酶Ⅰ中半胱氨酸和處理后的石墨烯基單分子器件進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)式見圖4。將制備的酶修飾的石墨烯基單分子器件置于低分辨探針臺(tái)，觀察導(dǎo)電性，若具有導(dǎo)電性，則進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)。二、采用酶修飾的石墨烯基單分子器件對(duì)模板鏈C進(jìn)行DNA測(cè)序1、取酶修飾的石墨烯基單分子器件，將改造后的DNA聚合酶Ⅰ的區(qū)域用體積為40μL的微腔進(jìn)行包被，微腔的材質(zhì)為聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)，得到含有微腔的石墨烯基單分子器件。2、完成步驟1后，將含有微腔的石墨烯基單分子器件置于高分辨探針臺(tái)，采樣5min，進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測(cè)試(即測(cè)試源漏電流隨時(shí)間的變化情況)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5中A的左圖。然后采用MatLab軟件進(jìn)行初步的峰值統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5中A的右圖。3、完成步驟1后，向含有微腔的石墨烯基單分子器件的微腔中加入10μLDTT緩沖液，采樣5min，進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測(cè)試(即測(cè)試源漏電流隨時(shí)間的變化情況)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5中B的左圖。然后采用MatLab軟件進(jìn)行初步的峰值統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5中B的右圖。4、完成步驟1后，向含有微腔的石墨烯基單分子器件的微腔中加入30μL含100nM模板鏈C的DTT緩沖液，采樣5min，進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測(cè)試(即測(cè)試源漏電流隨時(shí)間的變化情況)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5中C的左圖。然后采用MatLab軟件進(jìn)行初步的峰值統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5中C的右圖。5、完成步驟1后，向含有微腔的石墨烯基單分子器件的微腔中加入30μL含100nM模板鏈C的DTT緩沖液、5μL的dATP溶液(濃度為5μM)、5μL的dTTP溶液(濃度為5μM)和5μL的dCTP溶液(濃度為5μM)，采樣10min，進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測(cè)試(即測(cè)試源漏電流隨時(shí)間的變化情況)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5中D的左圖。然后采用MatLab軟件進(jìn)行初步的峰值統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5中D的右圖。6、完成步驟1后，向含有微腔的石墨烯基單分子器件的微腔中加入30μL含100nM模板鏈C的DTT緩沖液和5μL的dGTP溶液(濃度為5μM)，采樣10min，測(cè)試聚合酶在進(jìn)行DNA合成時(shí)源漏電流隨時(shí)間的變化情況，亦即DNA聚合酶進(jìn)行DNA聚合時(shí)的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5中E的左圖。然后采用MatLab軟件進(jìn)行初步的峰值統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5中E的右圖。結(jié)果表明，步驟6中的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)與其它對(duì)照實(shí)驗(yàn)中的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)在表觀上有本質(zhì)區(qū)別，即當(dāng)體系中存在與模板鏈C以及與之匹配的脫氧核苷酸時(shí)，體系的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)才能與其余四組對(duì)照實(shí)驗(yàn)不同。7、將步驟6獲得的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)拉展，采用Qub軟件選定相應(yīng)的高態(tài)電流(即大電流)及低態(tài)電流(即小電流)(圖6中A)。將高態(tài)電流對(duì)應(yīng)的高態(tài)時(shí)間(τhi)和低態(tài)電流對(duì)應(yīng)的低態(tài)時(shí)間(τlow)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見圖6中B和C。根據(jù)平均低態(tài)時(shí)間和平均高態(tài)時(shí)間，計(jì)算得到本體系中DNA的合成速度是每秒62.62個(gè)dGTP核苷酸(見表1)，與已有的文獻(xiàn)(TivoliJ.Olsen，YongkiChoi，PatrickC.Sims，O.TolgaGul，BradL.Corso，ChengjunDong，WilliamA.Brown，PhilipG.CollinsandGregoryA.Weiss，ElectronicMeasurementsofSingle-MoleculeProcessingbyDNAPolymeraseI(KlenowFragment),JournaloftheAmericanChemicalSociety2013，135，7855-7860)記載的合成速度基本一致。值得說明的是，這里提及的平均，并不是簡(jiǎn)單意義上的線性平均，而是在指數(shù)分布基礎(chǔ)上的泊松平均，具體的計(jì)算過程，由MatLab軟件進(jìn)行。表1模板鏈C模板鏈G模板鏈T模板鏈Aτlow(ms)0.1560.1220.7102.825τhi(ms)15.8136.8233.5853.575合成速度(個(gè)/秒)62.62143.99232.83156.25三、采用酶修飾的石墨烯基單分子器件對(duì)模板鏈A進(jìn)行DNA測(cè)序1、同步驟二中1。2、同步驟二中2。動(dòng)力學(xué)測(cè)試的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7中A的左圖。峰值統(tǒng)計(jì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7中A的右圖。3、同步驟二中3。動(dòng)力學(xué)測(cè)試的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7中B的左圖。峰值統(tǒng)計(jì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7中B的右圖。4、同步驟二中4的方法，僅將模板鏈C替換為模板鏈A。動(dòng)力學(xué)測(cè)試的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7中C的左圖。峰值統(tǒng)計(jì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7中C的右圖。5、完成步驟1后，向含有微腔的石墨烯基單分子器件的微腔中加入30μL含100nM模板鏈A的DTT緩沖液、5μL的dATP溶液(濃度為5μM)、5μL的dGTP溶液(濃度為5μM)和5μL的dCTP溶液(濃度為5μM)，采樣10min，進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測(cè)試(即測(cè)試源漏電流隨時(shí)間的變化情況)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7中D的左圖。然后采用MatLab軟件進(jìn)行初步的峰值統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7中D的右圖。6、完成步驟1后，向含有微腔的石墨烯基單分子器件的微腔中加入30μL含100nM模板鏈A的DTT緩沖液和5μL的dTTP溶液(濃度為5μM)，采樣10min，測(cè)試聚合酶在進(jìn)行DNA合成時(shí)源漏電流隨時(shí)間的變化情況，亦即DNA聚合酶進(jìn)行DNA聚合時(shí)的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7中E的左圖。然后采用MatLab軟件進(jìn)行初步的峰值統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7中E的右圖。結(jié)果表明，步驟6中的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)與其它對(duì)照實(shí)驗(yàn)中的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)在表觀上有本質(zhì)區(qū)別，即當(dāng)體系中存在與模板鏈A以及與之匹配的脫氧核苷酸時(shí)，體系的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)才能與其余四組對(duì)照實(shí)驗(yàn)不同。7、按照步驟二中7的方法，將高態(tài)電流對(duì)應(yīng)的高態(tài)時(shí)間(τhi)和低態(tài)電流對(duì)應(yīng)的低態(tài)時(shí)間(τlow)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖8(左圖為低態(tài)時(shí)間，右圖為高態(tài)時(shí)間)。根據(jù)平均低態(tài)時(shí)間和平均高態(tài)時(shí)間，計(jì)算得到本體系中DNA的合成速度是每秒156.25個(gè)dTTP核苷酸(見表1)，與已有的文獻(xiàn)(TivoliJ.Olsen，YongkiChoi，PatrickC.Sims，O.TolgaGul，BradL.Corso，ChengjunDong，WilliamA.Brown，PhilipG.CollinsandGregoryA.Weiss，ElectronicMeasurementsofSingle-MoleculeProcessingbyDNAPolymeraseI(KlenowFragment),JournaloftheAmericanChemicalSociety2013，135，7855-7860)記載的合成速度基本一致。四、采用酶修飾的石墨烯基單分子器件對(duì)模板鏈G進(jìn)行DNA測(cè)序1、同步驟二中1。2、同步驟二中2。動(dòng)力學(xué)測(cè)試的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖9中A的左圖。峰值統(tǒng)計(jì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖9中A的右圖。3、同步驟二中3。動(dòng)力學(xué)測(cè)試的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖9中B的左圖。峰值統(tǒng)計(jì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖9中B的右圖。4、同步驟二中4的方法，僅將模板鏈C替換為模板鏈G。動(dòng)力學(xué)測(cè)試的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖9中C的左圖。峰值統(tǒng)計(jì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖9中C的右圖。5、完成步驟1后，向含有微腔的石墨烯基單分子器件的微腔中加入30μL含100nM模板鏈G的DTT緩沖液、5μL的dATP溶液(濃度為5μM)、5μL的dGTP溶液(濃度為5μM)和5μL的dTTP溶液(濃度為5μM)，采樣10min，進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測(cè)試(即測(cè)試源漏電流隨時(shí)間的變化情況)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖9中D的左圖。然后采用MatLab軟件進(jìn)行初步的峰值統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖9中D的右圖。6、完成步驟1后，向含有微腔的石墨烯基單分子器件的微腔中加入30μL含100nM模板鏈G的DTT緩沖液和5μL的dCTP溶液(濃度為5μM)，采樣10min，測(cè)試聚合酶在進(jìn)行DNA合成時(shí)源漏電流隨時(shí)間的變化情況，亦即DNA聚合酶進(jìn)行DNA聚合時(shí)的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖9中E的左圖。然后采用MatLab軟件進(jìn)行初步的峰值統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖9中E的右圖。結(jié)果表明，步驟6中的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)與其它對(duì)照實(shí)驗(yàn)中的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)在表觀上有本質(zhì)區(qū)別，即當(dāng)體系中存在與模板鏈G以及與之匹配的脫氧核苷酸時(shí)，體系的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)才能與其余四組對(duì)照實(shí)驗(yàn)不同。7、按照步驟二中7的方法，將高態(tài)電流對(duì)應(yīng)的高態(tài)時(shí)間(τhi)和低態(tài)電流對(duì)應(yīng)的低態(tài)時(shí)間(τlow)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖10(左圖為低態(tài)時(shí)間，右圖為高態(tài)時(shí)間)。根據(jù)平均低態(tài)時(shí)間和平均高態(tài)時(shí)間，計(jì)算得到本體系中DNA的合成速度是每秒143.99個(gè)dCTP核苷酸(見表1)，與已有的文獻(xiàn)(TivoliJ.Olsen，YongkiChoi，PatrickC.Sims，O.TolgaGul，BradL.Corso，ChengjunDong，WilliamA.Brown，PhilipG.CollinsandGregoryA.Weiss，ElectronicMeasurementsofSingle-MoleculeProcessingbyDNAPolymeraseI(KlenowFragment),JournaloftheAmericanChemicalSociety2013，135，7855-7860)記載的合成速度基本一致。五、采用酶修飾的石墨烯基單分子器件對(duì)模板鏈T進(jìn)行DNA測(cè)序1、同步驟二中1。2、同步驟二中2。動(dòng)力學(xué)測(cè)試的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖11中A的左圖。峰值統(tǒng)計(jì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖11中A的右圖。3、同步驟二中3。動(dòng)力學(xué)測(cè)試的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖11中B的左圖。峰值統(tǒng)計(jì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖11中B的右圖。4、同步驟二中4的方法，僅將模板鏈C替換為模板鏈T。動(dòng)力學(xué)測(cè)試的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖11中C的左圖。峰值統(tǒng)計(jì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖11中C的右圖。5、完成步驟1后，向含有微腔的石墨烯基單分子器件的微腔中加入30μL含100nM模板鏈T的DTT緩沖液、5μL的dCTP溶液(濃度為5μM)、5μL的dGTP溶液(濃度為5μM)和5μL的dTTP溶液(濃度為5μM)，采樣10min，進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測(cè)試(即測(cè)試源漏電流隨時(shí)間的變化情況)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖11中D的左圖。然后采用MatLab軟件進(jìn)行初步的峰值統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖11中D的右圖。6、完成步驟1后，向含有微腔的石墨烯基單分子器件的微腔中加入30μL含100nM模板鏈T的DTT緩沖液和5μL的dATP溶液(濃度為5μM)，采樣10min，測(cè)試聚合酶在進(jìn)行DNA合成時(shí)源漏電流隨時(shí)間的變化情況，亦即DNA聚合酶進(jìn)行DNA聚合時(shí)的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖11中E的左圖。然后采用MatLab軟件進(jìn)行初步的峰值統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖11中E的右圖。結(jié)果表明，步驟6中的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)與其它對(duì)照實(shí)驗(yàn)中的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)在表觀上有本質(zhì)區(qū)別，即當(dāng)體系中存在與模板鏈T以及與之匹配的脫氧核苷酸時(shí)，體系的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)才能與其余四組對(duì)照實(shí)驗(yàn)不同。7、按照步驟二中7的方法，將高態(tài)電流對(duì)應(yīng)的高態(tài)時(shí)間(τhi)和低態(tài)電流對(duì)應(yīng)的低態(tài)時(shí)間(τlow)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖12(左圖為低態(tài)時(shí)間，右圖為高態(tài)時(shí)間)。根據(jù)平均低態(tài)時(shí)間和平均高態(tài)時(shí)間，計(jì)算得到本體系中DNA的合成速度是每秒232.83個(gè)dATP核苷酸(見表1)，與已有的文獻(xiàn)(TivoliJ.Olsen，YongkiChoi，PatrickC.Sims，O.TolgaGul，BradL.Corso，ChengjunDong，WilliamA.Brown，PhilipG.CollinsandGregoryA.Weiss，ElectronicMeasurementsofSingle-MoleculeProcessingbyDNAPolymeraseI(KlenowFragment),JournaloftheAmericanChemicalSociety2013，135，7855-7860)記載的合成速度基本一致。因此，采用酶修飾的石墨烯基單分子器件可進(jìn)行DNA測(cè)序。實(shí)施例2、采用硅納米線單分子器件進(jìn)行DNA測(cè)序一、酶修飾的硅納米線單分子器件的制備1、制備硅納米線單分子器件硅納米線單分子器件的制備過程參考如下文獻(xiàn)：CaoY，DongS，LiuS，HeL，GanL，YuX，SteigerwaldML，WuX，LiuZ，GuoX.Buildinghigh-throughputmolecularjunctionsusingindentedgraphenepointcontacts.AngewChemIntEdEngl.2012Dec3；51(49)：12228—32.硅納米線單分子器件上具有納米間隙的硅納米線電極(以下簡(jiǎn)稱硅納米線電極)。2、刻蝕完成步驟1后，將硅納米線單分子器件和HF溶液混合，得到刻蝕的硅納米線單分子器件。部分刻蝕的硅納米線單分子器件的結(jié)構(gòu)示意圖如圖13中(1)所示。3、電學(xué)回路的構(gòu)建完成步驟2后，將刻蝕的硅納米線單分子器件和10—十一碳炔酸(見圖13中(2))混合，得到電學(xué)回路。電學(xué)回路的部分結(jié)構(gòu)示意圖如圖13中(3)所示。4、Sulfo-NHS活化完成步驟3后，將電學(xué)回路和N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽(見圖13中(4))混合，得到Sulfo-NHS活化的電學(xué)回路。Sulfo-NHS活化的電學(xué)回路的部分結(jié)構(gòu)式如圖13中(5)所示。5、處理后的硅納米線單分子器件的獲得完成步驟4后，將Sulfo-NHS活化的電學(xué)回路和N-(2-氨乙基)馬來酰亞胺鹽酸鹽(見圖13中(6))混合，得到處理后的硅納米線單分子器件。處理后的硅納米線單分子器件的部分結(jié)構(gòu)式如圖13中(7)所示。6、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的改造同實(shí)施例1步驟一中的6。7、酶修飾的硅納米線單分子器件的制備完成步驟6后，將處理后的硅納米線單分子器件和過量的改造后的DNA聚合酶Ⅰ(見圖7中(8))混合，得到酶修飾的硅納米線單分子器件(見圖3中右圖)。部分酶修飾的硅納米線單分子器件的結(jié)構(gòu)示意圖如圖7中(7)所示。將制備的酶修飾的硅納米線單分子器件置于低分辨探針臺(tái)，觀察導(dǎo)電性，若具有導(dǎo)電性，則進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)。二、采用酶修飾的硅納米線單分子器件對(duì)模板鏈C進(jìn)行DNA測(cè)序按照實(shí)施例1步驟二的方法，將酶修飾的石墨烯基單分子器件替換為酶修飾的硅納米線單分子器件，其它步驟均不變，得到本體系中DNA的合成速度是每秒65.30個(gè)dGTP核苷酸，與采用酶修飾的石墨烯基單分子器件對(duì)模板鏈C進(jìn)行DNA測(cè)序的結(jié)果無顯著差異。三、采用酶修飾的硅納米線單分子器件對(duì)模板鏈A進(jìn)行DNA測(cè)序按照實(shí)施例1步驟三的方法，將酶修飾的石墨烯基單分子器件替換為酶修飾的硅納米線單分子器件，其它步驟均不變，得到本體系中DNA的合成速度是每秒117.27個(gè)TTP核苷酸，與采用酶修飾的石墨烯基單分子器件對(duì)模板鏈A進(jìn)行DNA測(cè)序的結(jié)果無顯著差異。四、采用酶修飾的硅納米線單分子器件對(duì)模板鏈G進(jìn)行DNA測(cè)序按照實(shí)施例1步驟四的方法，將酶修飾的石墨烯基單分子器件替換為酶修飾的硅納米線單分子器件，其它步驟均不變，得到本體系中DNA的合成速度是每秒154.51個(gè)dCTP核苷酸，與采用酶修飾的石墨烯基單分子器件對(duì)模板鏈G進(jìn)行DNA測(cè)序的結(jié)果無顯著差異。五、采用酶修飾的硅納米線單分子器件對(duì)模板鏈T進(jìn)行DNA測(cè)序按照實(shí)施例1步驟五的方法，將酶修飾的石墨烯基單分子器件替換為酶修飾的硅納米線單分子器件，其它步驟均不變，得到本體系中DNA的合成速度是每秒234.60個(gè)dATP核苷酸，與采用酶修飾的石墨烯基單分子器件對(duì)模板鏈T進(jìn)行DNA測(cè)序的結(jié)果無顯著差異。因此，采用酶修飾的硅納米線單分子器件可進(jìn)行DNA測(cè)序。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3