本發(fā)明涉及疾病的基因診斷
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是一種與結(jié)直腸癌相關(guān)的基因septin9甲基化的檢測(cè)。
背景技術(shù)：
：結(jié)直腸癌是世界第三大高發(fā)癌癥，每年因結(jié)直腸癌死亡的患者可達(dá)60萬。早期結(jié)直腸癌患者的5年生存率約為80％，由于結(jié)直腸癌早期往往無特殊癥狀，容易延誤治療時(shí)機(jī)，至晚期時(shí)生存率僅為10％左右。2000年以前，歐美一些國(guó)家就已在全國(guó)推廣結(jié)直腸癌高危人群的篩查。2006年，美國(guó)50歲至75歲的人群中，60％的人至少參加過一次結(jié)直腸癌的篩查。近年來，我國(guó)惡性腫瘤中結(jié)直腸癌發(fā)病率位列第三，高達(dá)31/10萬，直追歐美國(guó)家。然而，患者的早診率遠(yuǎn)落后于國(guó)外，確診時(shí)約60％的患者是中晚期。如果大腸癌在早期能夠準(zhǔn)確檢測(cè)到，這樣就能夠盡早進(jìn)行預(yù)防和治療，提高治愈率，并且能夠降低治療成本。目前來講，結(jié)直腸癌早期診斷主要有以下三種方式：1、糞便潛血試驗(yàn)(gFOBT)或免疫法糞便潛血試驗(yàn)(FIT)；2、進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查；3、CT結(jié)腸成像?，F(xiàn)在，糞便潛血首推的是FIT，這與gFOBT存在很大不同。2008年一項(xiàng)對(duì)比gFOBT和FIT的研究顯示，在做大規(guī)模篩查時(shí)，F(xiàn)IT的依從性較好為60％，gFOBT為47％；FIT的敏感性為5.5％，而gFOBT為2.4％；CRC和進(jìn)展期腺癌的發(fā)生率FIT為1.4％，高于gFOBT的0.6％。對(duì)于結(jié)腸鏡檢測(cè)，2009年一項(xiàng)研究顯示，全結(jié)腸鏡檢查可以降低左半的CRC死亡風(fēng)險(xiǎn)，但是在右半，全結(jié)腸鏡檢查并不能對(duì)死亡率有較大改善。對(duì)于左右半結(jié)果不同的原因目前存在爭(zhēng)議。有觀點(diǎn)認(rèn)為，左右半結(jié)果不同是因?yàn)楹芏嘟Y(jié)腸鏡檢測(cè)并沒有評(píng)估所有右半的結(jié)腸，最重要的是左右兩側(cè)的結(jié)腸具有不同的生物學(xué)特性，右半結(jié)腸息肉較少，呈扁平狀，很容易漏檢。糞便潛血檢查的靈敏度相對(duì)較低，而結(jié)腸鏡檢查具有很大的創(chuàng)傷性。所以需一種同時(shí)具備檢測(cè)靈敏度高、創(chuàng)傷性小的結(jié)直腸癌早期篩查的方法。Septin9基因位于常染色體17q25.3，作為高度保守的GTP結(jié)合蛋白廣泛存在于人類細(xì)胞，研究顯示Septin9基因甲基化在CRC及部分癌前病變患者外周血中有較高的檢出率，由于僅需要抽取外周靜脈血，故其患者依從性較高。利用分子檢測(cè)手段，對(duì)結(jié)直腸癌的早期篩查具有無創(chuàng)性，檢測(cè)靈敏度高。DNA異常甲基化是人類腫瘤常見的改變。發(fā)生在啟動(dòng)子區(qū)以及基因內(nèi)部的CpG島異常甲基化是基因失活的最常見機(jī)制。目前檢測(cè)DNA甲基化檢測(cè)方法有：甲基化特異性的PCR(Methylation-specificPCR，MSP)、亞硫酸氫鹽測(cè)序法(BisulfitesequencingPCR，BSP)、高分辨率熔解曲線法(HighResolutionMelting，HRM)和高通量測(cè)序方法等。相對(duì)于其他的檢測(cè)方法而言，亞硫酸氫鹽測(cè)序法(BisulfitesequencingPCR，BSP)是DNA甲基化檢測(cè)中的“金標(biāo)準(zhǔn)”，檢測(cè)較為精準(zhǔn)，但其檢測(cè)靈敏度相對(duì)較低，且操作較繁瑣、成本高。高分辨率熔解曲線法(HighResolutionMelting，HRM)在PCR擴(kuò)增中通過觀察熔解曲線的變化來判斷DNA是否發(fā)生甲基化，此類方法結(jié)果分析相對(duì)復(fù)雜。高通量測(cè)序檢測(cè)方法主要是涉及到的成本太高，不利于臨床上的推廣。對(duì)于甲基化特異性的PCR(Methylation-specificPCR，MSP)檢測(cè)方法，操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)較短，結(jié)果易于分析。專利公開號(hào)CN104164516A(公開日2014.11.26)公開了一種基于人結(jié)直腸癌特異性甲基化檢測(cè)的引物及試劑盒，是針對(duì)SEPTIN9基因的啟動(dòng)子區(qū)域設(shè)計(jì)了一對(duì)用于人結(jié)直腸癌特異性甲基化檢測(cè)的PCR引物，對(duì)輔助診斷結(jié)直腸癌有一定作用，但其特異性和靈敏度仍然有待提高。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決現(xiàn)有技術(shù)對(duì)于結(jié)直腸癌相關(guān)基因septin9基因的甲基化情況檢測(cè)靈敏度和特異性不高的問題，本發(fā)明提供了一對(duì)新的檢測(cè)引物，另外基于該引物對(duì)，本發(fā)明還提供了一種簡(jiǎn)單方便的檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明提供的檢測(cè)septin9基因甲基化的引物，包括目的基因引物對(duì)，其核苷酸序列如下所示：Septin9正向引物F：5'-CCGAAATAATCCCATCCAAC-3'(SEQIDNO.1)，Septin9反向引物R：5'-GCGATTCGTTGTTTATTAGTTATTAT-3'(SEQIDNO.2)。本發(fā)明基于甲基化特異性的PCR(Methylation-specificPCR，MSP)方法，設(shè)計(jì)了一對(duì)針對(duì)septin9基因-1200bp到-1500bp這一片段甲基化位點(diǎn)的引物。研究表明，這一位點(diǎn)的甲基化程度相對(duì)較高，具備重要的臨床檢測(cè)意義。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)septin9基因甲基化的試劑盒，包括以上所述的引物。制備成試劑盒，更加方便攜帶使用。優(yōu)選地，上述檢測(cè)septin9基因甲基化的試劑盒，還包括內(nèi)參基因引物對(duì)，其核苷酸序列如下：內(nèi)參基因(β-actin)正向引物F：5'-GTGATGGAGGAGGTTTAG-3'(SEQIDNO.3)，內(nèi)參基因(β-actin)反向引物R：5'-AAATTACAAAAACCACAA-3'(SEQIDNO.4)。其一，增加內(nèi)參基因的檢測(cè)，對(duì)樣本基因組檢測(cè)起到對(duì)照作用，排除內(nèi)源因素的干擾；其二，增加內(nèi)參的檢測(cè)，結(jié)合靶基因?qū)颖窘Y(jié)果進(jìn)行判讀，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。優(yōu)選地，上述檢測(cè)septin9基因甲基化的試劑盒，還包括兩個(gè)TaqMan-MGB探針，分別為septin9基因探針和內(nèi)參基因(β-actin)探針，其核苷酸序列如下：septin9基因探針：5'-TTATGTCGGATTTCGCGGTTAA-3'(SEQIDNO.5)，內(nèi)參基因(β-actin)探針：5'-CACCACCCAACACACAATAACAAAC-3'(SEQIDNO.6)；兩個(gè)探針的5'端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)，且兩個(gè)探針的熒光報(bào)告基團(tuán)顯示的顏色不同。在選取特異性探針序列的同時(shí)，相比普通的taqman探針，利用MGB探針進(jìn)行檢測(cè)，能夠增加檢測(cè)的靈敏度和特異性，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。優(yōu)選地，上述檢測(cè)septin9基因甲基化的試劑盒，septin9基因探針核苷酸序列5'端標(biāo)記FAM，3'端標(biāo)記BHQ1；內(nèi)參基因(β-actin)探針核苷酸序列5'端標(biāo)記VIC，3'端標(biāo)記BHQ1。通過利用不同熒光基團(tuán)標(biāo)記的方式，能夠更好的將靶基因與內(nèi)參基因區(qū)分開來，對(duì)結(jié)果的判讀一目了然，更加清楚。優(yōu)選地，上述檢測(cè)septin9基因甲基化的試劑盒，還包括兩個(gè)Blocker引物，核苷酸序列如下：Blocker1引物：5'-ACCCGCTGCCCACCAGCCATCATG-CY3-3'(SEQIDNO.7)，Blocker2引物：5'-TATGTTGGATTTTGTGGTTAATGTGTA-CY3-3'(SEQIDNO.8)；兩個(gè)Blocker引物的3’端均標(biāo)記有熒光染料CY3，以阻止Blocker引物的擴(kuò)增過程。在PCR擴(kuò)增過程中，目的片段的引物容易與未發(fā)生甲基化的基因片段以及未發(fā)生重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的基因片段結(jié)合，出現(xiàn)突破擴(kuò)增，進(jìn)而產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增條帶，影響最終的判讀結(jié)果。因此，本試劑盒在擴(kuò)增體系中額外增加了多條Blocker引物，目的是讓這條引物特異性與除了甲基化片段之外的其他基因片段結(jié)合，進(jìn)而摒棄上述基因片段的突破擴(kuò)增，使目的引物只與甲基化片段結(jié)合，進(jìn)一步提高PCR擴(kuò)增靈敏度以及擴(kuò)增特異性。優(yōu)選地，上述檢測(cè)septin9基因甲基化的試劑盒，還包括PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液包括DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+。添加PCR反應(yīng)液后，試劑盒能夠一步完成熒光定量PCR，減少污染風(fēng)險(xiǎn)，使檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確。優(yōu)選地，上述檢測(cè)septin9基因甲基化的試劑盒，檢測(cè)對(duì)象為人的血漿提取的DNA。以血漿DNA作為檢測(cè)對(duì)象，不會(huì)對(duì)人體組織造成床上，患者依從性更好，同時(shí)也更加方便檢測(cè)。本發(fā)明提供的檢測(cè)septin9基因甲基化的引物及試劑盒，具有如下有益效果：本發(fā)明針對(duì)septin9基因的-1200bp到-1500bp片段設(shè)計(jì)甲基化檢測(cè)引物，特異性強(qiáng)，能夠有效檢出septin9基因的甲基化情況。本發(fā)明提供的試劑盒，操作簡(jiǎn)便、易于判讀，對(duì)儀器的要求不高，并且整個(gè)PCR過程采用全封閉形式，避免了交叉污染的可能，使結(jié)果更加精準(zhǔn)。另外附加內(nèi)參基因的檢測(cè)引物以及相應(yīng)探針，采用Taqman-MGB探針檢測(cè)的手段，通過探針與甲基化序列特異性結(jié)合，進(jìn)而將甲基化位點(diǎn)進(jìn)一步精確檢測(cè)。對(duì)比于用PCR特異性引物進(jìn)行檢測(cè)的方法，利用探針對(duì)甲基化位點(diǎn)進(jìn)行識(shí)別，具有更高的靈敏度、精準(zhǔn)性。而且還增加了兩個(gè)Blocker引物以去除非甲基化基因的干擾，嚴(yán)格控制非特異性條帶的擴(kuò)增，使這個(gè)試劑盒檢測(cè)靈敏度更高、特異性更好。試劑盒檢測(cè)的高靈敏性適用于結(jié)直腸癌血漿游離DNA的早期篩查。附圖說明圖1為實(shí)施例2中一個(gè)陽性樣本的septin9甲基化檢測(cè)情況。圖2上圖表示的是陽性樣本進(jìn)行8次重復(fù)；下圖表示的是陰性樣本進(jìn)行8次重復(fù)。具體實(shí)施方式為了使本
技術(shù)領(lǐng)域：
的人員更好地理解本發(fā)明方案，下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實(shí)施例中，除特殊說明外，所使用的生物材料和試劑均為本領(lǐng)域常規(guī)使用，可通過商業(yè)途徑獲得。實(shí)施例1試劑盒制備試劑盒內(nèi)含有的引物及探針序列：Septin9正向引物F：5'-CCGAAATAATCCCATCCAAC-3'，Septin9反向引物R：5'-GCGATTCGTTGTTTATTAGTTATTAT-3'；內(nèi)參基因正向引物F：5'-GTGATGGAGGAGGTTTAG-3'，內(nèi)參基因反向引物R：5'-AAATTACAAAAACCACAA-3'；septin9基因探針：FAM-TTATGTCGGATTTCGCGGTTAA-MGB-BHQ1；內(nèi)參基因探針：VIC-CACCACCCAACACACAATAACAAAC-BHQ1；Blocker1引物：5'-ACCCGCTGCCCACCAGCCATCATG-CY3-3'；Blocker2引物：5'-TATGTTGGATTTTGTGGTTAATGTGTA-CY3-3'。(1)預(yù)混好的檢測(cè)septin9基因甲基化的引物探針混合液：(2)DNAPCR擴(kuò)增MIX：實(shí)施例2試劑盒檢測(cè)septin9基因甲基化1)取10例血漿樣本進(jìn)行游離DNA提取，游離DNA提取試劑盒來自天根生化科技有限公司；2)游離DNA提取完成，對(duì)提取好的DNA進(jìn)行重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化，得到純化好的DNA，轉(zhuǎn)化試劑盒來自天根生化科技有限公司；3)配制PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：4)PCR擴(kuò)增程序如下：第一擴(kuò)增階段：37℃UDG酶反應(yīng)2min；第二擴(kuò)增階段：95℃預(yù)變性3min；第三擴(kuò)增階段：94℃變性15s，60℃退火延伸35s，45個(gè)循環(huán)；信號(hào)收集，第三階段60℃收集FAM，VIC信號(hào)。5)檢測(cè)結(jié)果分析利用上述反應(yīng)體系對(duì)10例樣本進(jìn)行檢測(cè)，能夠準(zhǔn)確檢出5例陽性樣本，目的基因Ct值與內(nèi)參基因Ct值之差均小于11，說明septin9發(fā)生甲基化。對(duì)剩下的5例陰性樣本沒有擴(kuò)增曲線，目的基因Ct值與內(nèi)參基因Ct值之差均大于11，說明septin9沒有發(fā)生甲基化。判讀方法，如表1。表1結(jié)果判讀參考樣品和對(duì)照品的Ct值結(jié)果結(jié)果△Ct(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)≤11septin9發(fā)生甲基化△Ct(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)>11septin9未發(fā)生甲基化6)成品試劑盒的性能驗(yàn)證利用配制完成的成品試劑盒進(jìn)行產(chǎn)品精密度、穩(wěn)定性的檢測(cè)，根據(jù)上述設(shè)置的條件進(jìn)行產(chǎn)品性能驗(yàn)證，使用上述提取的樣本，若目的基因Ct值與內(nèi)參基因Ct值之差均小于11，說明septin9發(fā)生甲基化。若目的基因Ct值與內(nèi)參基因Ct值之差均大于11，說明septin9沒有發(fā)生甲基化。圖2中，上圖表示的是陽性樣本進(jìn)行8次重復(fù)，目的基因Ct值與內(nèi)參基因Ct值之差均小于11，說明septin9發(fā)生甲基化；下圖表示的是陰性樣本進(jìn)行8次重復(fù)，目的基因Ct值與內(nèi)參基因Ct值之差均小于11，說明septin9發(fā)生甲基化。以上實(shí)施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>北京鑫諾美迪基因檢測(cè)技術(shù)有限公司<120>檢測(cè)septin9基因甲基化的引物及試劑盒<130>P20160144<160>8<170>PatentInversion3.5<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1ccgaaataatcccatccaac20<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>2gcgattcgttgtttattagttattat26<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>3gtgatggaggaggtttag18<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>4aaattacaaaaaccacaa18<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>5ttatgtcggatttcgcggttaa22<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>6caccacccaacacacaataacaaac25<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>7acccgctgcccaccagccatcatg24<210>8<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>8tatgttggattttgtggttaatgtgta27當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3