本發(fā)明涉及一種PEDV和TGEV雙重RT-PCR檢測(cè)方法及其探針引物組合與試劑盒，屬于病毒核酸檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

豬流行性腹瀉(Porcine Epidemic Diarrhea,PED)和豬傳染性胃腸炎(Transmissible Gastroenteritis,TGE)二者均為高度接觸性腸道疾病，主要發(fā)生在冬季和春季等寒冷季節(jié)，感染后，主要引起豬的嘔吐、腹瀉、食欲下降和脫水，各年齡段的豬均易感染。分別由兩種RNA病毒：豬流行性腹瀉病毒(Porcine Epidemic Diarrhea virus,PEDV)和傳染性胃腸炎病毒(Transmissible Gastroenteritis virus,TGEV)引起。該兩種病毒均可以破壞小腸上皮細(xì)胞而引起腸絨毛萎縮，對(duì)哺乳仔豬的致死率分別為30％-80％、80％-100％。由于二者引起的臨床癥狀、病理變化和流行病學(xué)極為相似，且往往混合感染，單憑臨床癥狀和組織病理學(xué)難以鑒別診斷。近幾年二者已成為當(dāng)前豬場(chǎng)常見(jiàn)的病毒性腹瀉，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

目前常規(guī)的病毒診斷方法有病毒分離、熒光抗體檢測(cè)、血清學(xué)診斷方法和免疫組織化學(xué)以及PCR方法等，病毒分離困難，PCR方法因其具有快速、特異、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)己經(jīng)廣泛應(yīng)用于畜禽傳染病的快速診斷。以上這些診斷方法在特異性上尚存在一定的缺陷，在敏感性方面對(duì)早期感染往往不能做出準(zhǔn)確的判定；并且單一的RT-PCR方法用于多種病毒感染的臨床鑒別診斷，不能一次達(dá)到目的，且因?yàn)樾枰獙?duì)不同檢測(cè)病毒分別進(jìn)行擴(kuò)增，不僅樣品需求量較大，且耗時(shí)較長(zhǎng)。此外疾病的嚴(yán)重程度與病毒的含量相關(guān)，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法很難準(zhǔn)確測(cè)定樣品中的病毒含量，這使得實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法不僅在定量研究中具有重要意義，而且在檢測(cè)病毒存在及其在疾病發(fā)展過(guò)程中病毒對(duì)機(jī)體持續(xù)性作用方面也起重要作用。因此，開(kāi)發(fā)出一種同時(shí)特異檢測(cè)兩種豬病毒感染的雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，有助于提升病毒檢測(cè)水平，在疾病診斷和防治及食品安全等方面具有重要的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種PEDV和TGEV雙重RT-PCR探針引物組合，包括以下引物對(duì)和探針：

PEDV上游引物：CGTGGAATTTCATTAGGTTTGCTTA

PEDV下游引物：CAAGTGCTGTGCTGTCCTCTAGT

PEDV探針：CAAGTGCTGTGCTGTCCTCTAGT

TGEV上游引物：GCAGGTAAAGGTGATGTGACAAGAT

TGEV下游引物：ACATTCAGCCAGTTGTGGGTAAT

TGEV探針：CTTGGCACTGCTCCCATTGGCAAC。

作為優(yōu)選，所述PEDV探針和TGEV探針序列的3’端結(jié)合相同的熒光淬滅基團(tuán)；所述PEDV探針和TGEV探針序列的5’端結(jié)合不同的熒光報(bào)告基團(tuán)。

作為優(yōu)選，所述熒光淬滅基團(tuán)為BHQ1；所述PEDV探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為HEX；所述TGEV探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種PEDV和TGEV雙重RT-PCR檢測(cè)方法，包括以下步驟：

1)病毒總RNA提??；

2)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；

3)RT-PCR擴(kuò)增：利用上述探針引物組合，以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，收集熒光信號(hào)；

4)結(jié)果判定:若擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生的Ct值≤38，則為陽(yáng)性。

作為優(yōu)選，步驟3)中，RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下：2μL 10×PCR buffer、2μL 2.5mΜdNTP、1U Ace Taq DNA聚合酶、0.3μM PEDV上游引物、0.3μM PEDV下游引物、0.2μM PEDV探針、0.3μM TGEV上游引物、0.3μM TGEV下游引物和0.25μM TGEV探針、補(bǔ)足至20μL的ddH₂O。

作為優(yōu)選，步驟3)中，RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序如下：95℃1min；95℃10s，60℃30s，40個(gè)循環(huán)，從60℃開(kāi)始收集熒光信號(hào)。

本發(fā)明的目的之三在于提供一種PEDV和TGEV雙重RT-PCR檢測(cè)試劑盒，包括上述的探針引物組合。

作為優(yōu)選，上述試劑盒還包括RT-PCR緩沖液、DNA聚合酶、酶混合物、陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品；所述陰性對(duì)照為滅菌后焦碳酸二乙酯處理水。

作為優(yōu)選，所述RT-PCR緩沖液為氯化鎂和三磷酸脫氧核糖核苷酸的混合物；所述酶混合物包括RNA酶抑制劑，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和Ace Taq DNA聚合酶。

相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)，采用PEDV和TGEV兩種病毒的特異性引物和探針，提供了一種PEDV和TGEV雙重TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒。該發(fā)明是通過(guò)一個(gè)RT-PCR反應(yīng)可以從樣本中同時(shí)檢測(cè)出PEDV和TGEV的存在，比傳統(tǒng)的普通PCR和單重?zé)晒舛縋CR方法更簡(jiǎn)便、省時(shí)和快捷，并且能夠?qū)Υ龣z測(cè)的病毒進(jìn)行實(shí)時(shí)準(zhǔn)確定量。本發(fā)明提供的試劑盒可判定在疾病爆發(fā)時(shí)哪種病毒在起主要作用，從而為實(shí)現(xiàn)臨床早期診斷和及時(shí)制定治療方案、減少死亡率及后遺癥成為可能。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例2步驟1)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，其中，曲線A為PEDV病毒，曲線B為T(mén)GEV病毒；

圖2為實(shí)施例2步驟2)的特異性試驗(yàn)結(jié)果圖；

圖3為實(shí)施例2步驟3)的敏感性試驗(yàn)結(jié)果圖；

圖4為實(shí)施例2步驟3)的普通RT-PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面，結(jié)合附圖以及具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述：

以下具體實(shí)施方式中，如未特殊說(shuō)明，所采用的試劑或儀器均可通過(guò)市售的途徑獲得。采用的DNA聚合酶為DNA聚合酶為Vazyme公司生產(chǎn)的Ace Taq DNA Polymerase(Code NO P401-d2)。

本發(fā)明提供一種PEDV和TGEV雙重RT-PCR探針引物組合，包括以下引物對(duì)和探針：

PEDV上游引物SEQ ID No.1：CGTGGAATTTCATTAGGTTTGCTTA

PEDV下游引物SEQ ID No:2：CAAGTGCTGTGCTGTCCTCTAGT

PEDV探針SEQ ID No.3：CAAGTGCTGTGCTGTCCTCTAGT

TGEV上游引物SEQ ID No.4：GCAGGTAAAGGTGATGTGACAAGAT

TGEV下游引物SEQ ID No.5：ACATTCAGCCAGTTGTGGGTAAT

TGEV探針SEQ ID No.6：CTTGGCACTGCTCCCATTGGCAAC。

以下具體實(shí)施方式中，PEDV和TGEV的上下游引物和探針委托上海Invitrogen公司合成。以下具體實(shí)施例中，使用的PEDV探針為HEX-CAAGTGCTGTGCTGTCCTCTAGT-BHQ1，使用的TGEV探針為FAM-CTTGGCACTGCTCCCATTGGCAAC-BHQ1。

本發(fā)明同時(shí)提供了一種PEDV和TGEV雙重RT-PCR檢測(cè)方法，包括以下步驟：

1)病毒總RNA提??；

2)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；

3)RT-PCR擴(kuò)增：利用上述的探針引物組合，以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，收集熒光信號(hào)；

4)結(jié)果判定:若擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生的Ct值≤38，則為陽(yáng)性。

本發(fā)明提供的PEDV和TGEV雙重RT-PCR檢測(cè)試劑盒，包括上述的探針引物組合。

本發(fā)明中，PEDV上游引物和PEDV下游引物的Tm值范圍為59.2-61.3℃；PEDV探針的Tm值為71℃；TGEV上游引物和TGEV下游引物為58-62.1℃、TGEV探針的Tm值為70.6℃。

實(shí)施例1：制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品

1)病毒總RNA提取

將含有PEDV和TGEV病毒的組織樣品各100mg置于1.5mL離心管中，用病毒RNA/DNA抽提試劑盒Axyprep Body Fluid Vial DNA/RNA Miniprep Kit(AXYGEN)提取，得到病毒總RNA；

2)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

在無(wú)RNase的0.2mL PCR管中依次加入步驟1)制備的病毒總RNA 10μL，OligodT-Adaptor primer(10pmol/L)2μL，5×Buffer 4μL，dNTP Mixture(10mM)2μL，RNase Inhibitor(40U/μL)0.5μL，M-MLV(200U/μL)1μL，不含RNase的ddH₂O補(bǔ)足至20μL。37℃60min，72℃10min。待反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束后，所得反應(yīng)液即為cDNA模板；

3)qPCR擴(kuò)增

qPCR反應(yīng)體系(總反應(yīng)體積20μL)：取2μL步驟2)獲得的cDNA為模板進(jìn)行TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，其中10×PCR buffer2μL，2.5mΜdNTP 2μL，Ace Taq DNA聚合酶1.5U，0.3μM PEDV上游引物、0.3μM PEDV下游引物、0.2μM PEDV探針、0.3μM TGEV上游引物、0.3μM TGEV下游引物和0.25μM TGEV探針、補(bǔ)足至20μL的ddH₂O；反應(yīng)參數(shù)為：95℃1min；95℃10s，60℃30s，40個(gè)循環(huán)，從60℃開(kāi)始收集熒光信號(hào)。

4)獲得質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品

將步驟3)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，按照DNA Gel Extraction Kit操作方法回收目的片段，將回收產(chǎn)物連接到PMD18-T載體上，通過(guò)大腸桿菌DH-5α感受態(tài)轉(zhuǎn)化，挑取其中白色單菌落進(jìn)行鑒定，重組質(zhì)粒序列委托上海Invitrogen公司進(jìn)行序列測(cè)定。利用Plasmid Miniprep Kit提取測(cè)序正確的重組質(zhì)粒DNA，PEDV陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的序列如SEQ ID No.7所示；TGEV陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品序列如SEQ ID No.8所示，利用核酸蛋白檢測(cè)儀(thermo)定量重組質(zhì)粒PEDV為1.8×10¹¹Copies/μL，TGEV為8.1×10¹¹Copies/μL。

實(shí)施例2：檢測(cè)方法的建立及驗(yàn)證

1)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

取實(shí)施例1獲得的PEDV和TGEV陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，以無(wú)菌去離子水將質(zhì)粒按照1.0×10¹Copies/μL-1.0×10⁶Copies/μL 10倍梯度稀釋制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系：2μL標(biāo)準(zhǔn)溶液作為模板，10×buffer 2μL，2.5mΜdNTP 2μL，Ex Taq DNA聚合酶1U，0.3μM PEDV上游引物、0.3μM PEDV下游引物、0.2μM PEDV探針、0.3μM TGEV上游引物、0.3μM TGEV下游引物和0.25μM TGEV探針、補(bǔ)足至20μL的ddH₂O。反應(yīng)參數(shù)為：95℃1min；95℃10s，60℃30s，40個(gè)循環(huán)，從60℃開(kāi)始收集熒光信號(hào)。擴(kuò)增完成后，以Ct值為縱坐標(biāo)，log10X(X為標(biāo)準(zhǔn)品系列濃度)為橫坐標(biāo)，Ct值與log10X呈線性關(guān)系，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示，呈良好的線性關(guān)系。

2)特異性試驗(yàn)

配制12份相同的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系反應(yīng)液，分別單獨(dú)加入2μL提取的PCV2、PRV核酸DNA或已反轉(zhuǎn)錄的PRRSV、CSFV、PEDV以及TGEV的cDNA為模板，即，反應(yīng)體系為10×PCR buffer2μL，2.5mΜdNTP 2μL，Ace Taq DNA聚合酶1.5U，0.3μM PEDV上游引物、0.3μM PEDV下游引物、0.2μM PEDV探針、0.3μM TGEV上游引物、0.3μM TGEV下游引物和0.25μM TGEV探針、補(bǔ)足至20μL的ddH₂O。反應(yīng)參數(shù)為：95℃1min；95℃10s，60℃30s，40個(gè)循環(huán)，從60℃開(kāi)始收集熒光信號(hào)。

結(jié)果如圖2所示，圖2中，上曲線從左到右依次為T(mén)GEV、PEDV，下曲線為PRV、CSFV、PRRSV、PCV2及陰性對(duì)照。該方法能很好地同時(shí)通過(guò)雙重TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)兩種病毒擴(kuò)增產(chǎn)物，并通過(guò)擴(kuò)增曲線及熒光集團(tuán)的不同，將兩種產(chǎn)物明顯區(qū)分開(kāi)來(lái)。

由此，我們可得以下結(jié)論：PEDV和TGEV兩種病毒可同時(shí)通過(guò)一次雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出相應(yīng)目的產(chǎn)物，并能在擴(kuò)增曲線上，通過(guò)Ct和所標(biāo)記熒光基團(tuán)的不同，將兩種病毒有效區(qū)分開(kāi)來(lái)，可以很直觀通過(guò)擴(kuò)增曲線來(lái)判定試驗(yàn)結(jié)果，證明所檢測(cè)兩種病毒正是PEDV和TGEV。

3)敏感性試驗(yàn)

以本實(shí)施例步驟1)的10倍系列稀釋的PEDV和TGEV陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(1.0×10¹～1.0×10⁶Copies/μL)作為模板，每個(gè)稀釋度設(shè)立3個(gè)重復(fù)，分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR、普通RT-PCR檢測(cè)敏感度，比較敏感性。

敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明可檢測(cè)出10Copies/μL的病毒量見(jiàn)圖3，曲線a至f分別對(duì)應(yīng)PEDV的1×10⁶,1×10⁵,1×10⁴,1×10³,1×10²和1×10¹各自的拷貝；曲線1至6分別對(duì)應(yīng)TGEV的1×10⁶,1×10⁵,1×10⁴,1×10³,1×10²和1×10¹各自的拷貝；由此可見(jiàn)本發(fā)明檢測(cè)病毒的敏感性高于常規(guī)PCR約100倍。

普通RT-PCR只能檢測(cè)到1000Copies/μL的病毒量見(jiàn)圖4，泳道1至7分別對(duì)應(yīng)PEDV的1×10⁶,1×10⁵,1×10⁴,1×10³,1×10²和1×10¹；泳道8至14分別對(duì)應(yīng)TGEV的1×10⁶,1×10⁵,1×10⁴,1×10³,1×10²和1×10¹各自的拷貝；普通RT-PCR檢測(cè)只能檢測(cè)到1×10³Copies/μL的病毒量。

4)穩(wěn)定性試驗(yàn)

取本實(shí)施例步驟1)的10倍系列稀釋的PEDV和TGEV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品溶液，取DEPC-H₂O作為陰性對(duì)照品，分別進(jìn)行批內(nèi)、批間重復(fù)試驗(yàn)。批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)是將3份樣品在同一次實(shí)時(shí)熒光定量試驗(yàn)中重復(fù)3次；批間重復(fù)試驗(yàn)是在3次不同時(shí)間的試驗(yàn)中(間隔1月)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)。穩(wěn)定性結(jié)果如下表所示顯示，本發(fā)明2種病毒批內(nèi)的變異系數(shù)分別為0.05％、0.58％、0.16％、0.09％、0.41％、0.32％；批間的變異系數(shù)分別為1.8％、2.7％、3.3％、2.4％、3.2％、3.7％，由此可見(jiàn)本發(fā)明檢測(cè)過(guò)程中具有良好的穩(wěn)定性。

表1穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)施例3：試樣檢測(cè)

一種PEDV和TGEV雙重RT-PCR檢測(cè)方法，包括以下步驟：

1)病毒總RNA提取：將含有PEDV、TGEV病毒的細(xì)胞上清各200μL置于1.5mL離心管中，用病毒RNA/DNA抽提試劑盒Axyprep Body Fluid Vial DNA/RNA Miniprep Kit(AXYGEN)從細(xì)胞株提取病毒總RNA；

2)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA：

在無(wú)RNase的0.2mL PCR管中依次加入步驟1)制備的病毒總RNA 10μL，OligodT-Adaptor primer(10pmol/L)2μL，5×Buffer 4μL，dNTP Mixture(10mM)2μL，RNase Inhibitor(40U/μL)0.5μL，M-MLV(200U/μL)1μL，不含RNase的ddH₂O補(bǔ)足至20μL。37℃60min，72℃10min。待反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束后，所得反應(yīng)液即為cDNA模板；

3)PEDV和TGEV兩種病毒雙重TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR擴(kuò)增：

qPCR反應(yīng)體系(總反應(yīng)體積20μL)：取2μL步驟2)得到的cDNA為模板進(jìn)行TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，其中10×PCR buffer2μL，2.5mΜdNTP 2μL，Ace Taq DNA聚合酶1.5U，0.3μM PEDV上游引物、0.3μM PEDV下游引物、0.2μM PEDV探針、0.3μM TGEV上游引物、0.3μM TGEV下游引物和0.25μM TGEV探針、補(bǔ)足至20μL的ddH₂O；反應(yīng)參數(shù)為：95℃1min；95℃10s，60℃30s，40個(gè)循環(huán)，從60℃開(kāi)始收集熒光信號(hào)。

4)結(jié)果判定：若擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生的Ct值≤38，則為陽(yáng)性。

實(shí)施例4：臨床檢驗(yàn)

1)樣本采集

樣本共計(jì)52份，其中在廣東地區(qū)采集血清22份，感染不同代次的細(xì)胞19份，組織病料11份。

2)總RNA小量抽提

用病毒RNA/DNA抽提試劑盒Axyprep Body Fluid Vial DNA/RNA Miniprep Kit(AXYGEN)從細(xì)胞株提取病毒總RNA；

3)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA：

同實(shí)施例3步驟2)；

4)RT-PCR檢測(cè)和雙重TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR

qPCR反應(yīng)體系(總反應(yīng)體積20μL)：取2μL已反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，其中10×PCR buffer 2μL，2.5mΜdNTP 2μL，Ace Taq DNA聚合酶1.5U，0.3μM PEDV上游引物、0.3μM PEDV下游引物、0.2μM PEDV探針、0.3μM TGEV上游引物、0.3μM TGEV下游引物和0.25μM TGEV探針、補(bǔ)足至20μL的ddH₂O；反應(yīng)參數(shù)為：95℃1min；95℃10s，60℃30s，40個(gè)循環(huán)，從60℃開(kāi)始收集熒光信號(hào)，記載Ct值。

5)定量分析

根據(jù)實(shí)施例2步驟1)的標(biāo)準(zhǔn)曲線及待測(cè)樣品Ct值，計(jì)算待測(cè)標(biāo)本病毒Copies/μL。通過(guò)結(jié)果分析得出所采集樣本中PEDV和TGRV兩種病毒的總cDNA大都在10¹～10⁹Copies/μL之間(超過(guò)以及等于10⁶拷貝/μL的樣品，均稀釋100后再次檢測(cè))，而在普通PCR檢測(cè)呈陰性通過(guò)本發(fā)明檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的樣本，其對(duì)應(yīng)拷貝數(shù)值在10³Copies/μL左右。

對(duì)比例：普通RT-PCR檢測(cè)

對(duì)比例中，樣本采集、總RNA小量抽提以及反轉(zhuǎn)錄合成cDNA步驟均于實(shí)施例4相同，后采用普通RT-PCR進(jìn)行檢測(cè)，其中RT-PCR反應(yīng)體系(總反應(yīng)體積25μL)：10×PCR buffer 2.5μL，25mM MgCl22μL，2.5mM dNTP 2.5μL，Ace Taq DNA聚合酶2U，以cDNA2μL為模板，0.3μM PEDV上游引物、0.3μM PEDV下游引物、0.3μM TGEV上游引物、0.3μM TGEV下游引物，加ddH₂O至反應(yīng)體系總體積為25μL，分別進(jìn)行普通RT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)在Bio-Rad S1000PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行反應(yīng)參數(shù)為：95℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，35個(gè)循環(huán)，72℃10min。

5)結(jié)果檢測(cè)：通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

實(shí)施例4與對(duì)比例相比，對(duì)于同一批待測(cè)樣品，實(shí)施例4檢測(cè)出21份PEDV陽(yáng)性，9份TGEV陽(yáng)性，其中PEDV和TGEV混合感染3份；對(duì)比例檢測(cè)出19份PEDV陽(yáng)性，8份TGEV陽(yáng)性，其中PEDV和TGEV混合感染3份。

由上述結(jié)果可知，采用本發(fā)明提供的PEDV和TGEV雙重RT-PCR檢測(cè)方法的實(shí)施例4，其檢測(cè)效果明顯好于采用普通RT-PCR方法的對(duì)比例，可以減少假陰性的發(fā)生，同時(shí)一次可以檢測(cè)出混合感染，減少二次RT-PCR驗(yàn)證及不需要RT-PCR擴(kuò)增后續(xù)處理，大大節(jié)約時(shí)間，提高工作效率。

本發(fā)明的提供的PEDV和TGEV雙重RT-PCR檢測(cè)試劑盒，包括a)熒光定量RT-PCR反應(yīng)液、b)陽(yáng)性對(duì)照品、c)陰性對(duì)照品和d)定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)品；

其中，所述a)熒光定量RT-PCR反應(yīng)液包含RT-PCR緩沖液、DNA聚合酶、PEDV上游引物SEQ ID No.1、PEDV下游引物SEQ ID No:2、PEDV探針SEQ ID No.3、TGEV上游引物SEQ ID No.4、TGEV下游引物SEQ ID No.5、TGEV探針SEQ ID No.6；

所述RT-PCR緩沖液為氯化鎂和三磷酸脫氧核糖核苷酸混合物；

所述b)陽(yáng)性對(duì)照品為含有PEDV和TGEV兩種病毒的陽(yáng)性質(zhì)?；旌衔铮?/p>

所述c)陰性對(duì)照品為滅菌后焦碳酸二乙酯處理水；

所述d)定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)品為PEDV陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和TGEV陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

所述PEDV陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品序列為SEQ ID No.7：GTGGAATTTCATTAGGTTTGCTTAAGTAGCCATCGCAAGTGCTGTGCTGTCCTCTAGTTCCTGGTTGGCGTTCCGTCGCCTTCTACATACTAGACAAACAGCCTTCCTCCG；

所述TGEV陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品序列為SEQ ID No.8：GCAGGTAAAGGTGATGTGACAAGATTTTATGGAGCTAGAAGCAGTTCAGCCAATTTTGGTGACACTGACCTCGTTGCCAATGGGAGCAGTGCCAAGCATTACCCACAACTGGCTGAATGT。

上述試劑盒應(yīng)避光保存于-20℃，盡量減少反復(fù)凍融。

對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可根據(jù)以上描述的技術(shù)方案以及構(gòu)思，做出其它各種相應(yīng)的改變以及變形，而所有的這些改變以及變形都應(yīng)該屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。