本發(fā)明涉及分子診斷
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種診斷豬臍帶血偽狂犬病毒野毒株的Taqman實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒及其用途。
背景技術(shù)：
：豬偽狂犬病毒(PRV)可以引起多種家畜及野生動(dòng)物的偽狂犬病(Pesudorabies,PR)。該病對(duì)豬的危害極其嚴(yán)重，主要臨床癥狀為引起妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)生木乃伊胎、死胎及產(chǎn)弱仔等。對(duì)于哺乳仔豬及斷奶期仔豬則會(huì)有高燒、呼吸困難并伴發(fā)明顯中樞神經(jīng)障礙的癥狀，感染后死亡率可達(dá)100％。豬偽狂犬病當(dāng)前常用的診斷方法：(1)血清中和試驗(yàn)(serumneutraliza-tiontest,SN)，是目前大多數(shù)國(guó)家檢測(cè)偽狂犬病的主要方法之一。SN特異性很強(qiáng)，敏感性較低。SN的普及主要是基于其檢測(cè)能力可以給血清樣本的抗體量作一個(gè)大致的定量分析。(2)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linkedimmuno-sorbentassay,ELISA)?，F(xiàn)在已經(jīng)有商業(yè)化的ELISA診斷試劑盒在市場(chǎng)上銷售，該方法敏感性高，且操作簡(jiǎn)單快捷，目前在世界上多個(gè)國(guó)家作為基礎(chǔ)診斷方法。(3)乳膠凝集試驗(yàn)(latexagglutinationtest，LAT)。LAT的敏感性和特異性與ELISA方法一致，均可現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用，可運(yùn)用于進(jìn)行快速的血清篩選檢測(cè)，并可檢查早期感染。(4)聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction，PCR)。PCR敏感性高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)速度快(24h出結(jié)果)，現(xiàn)在已經(jīng)作為偽狂犬病原檢測(cè)的常用方法之一。上述4種方法中，血清中和試驗(yàn)的特異性和敏感性均高于其他檢測(cè)方法，但由于其要求高、周期長(zhǎng)，故在大批量的樣品檢測(cè)上不如ELISA試驗(yàn)和乳膠凝集試驗(yàn)的操作簡(jiǎn)單快捷。同時(shí)血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)(SN、LAT和ELISA)存在以下缺點(diǎn)：(1)對(duì)豬群中存在的免疫耐受現(xiàn)象評(píng)估較難，相對(duì)不能更加有效、直觀和高精準(zhǔn)反映豬群的抗體水平。(2)血樣采集需要多人協(xié)助，且需要特殊設(shè)備，采集過(guò)程相對(duì)比較費(fèi)時(shí)。PCR技術(shù)快速敏感，但由于偽狂犬gE基因GC含量很高，相對(duì)比較難以擴(kuò)增，且一般臨床檢測(cè)樣品(臍帶血中)無(wú)法檢測(cè)到該基因，就無(wú)法使用普通PCR技術(shù)進(jìn)行疾病診斷野毒株。另外PCR檢測(cè)偽狂犬樣品存在以下缺點(diǎn)：(1)需要復(fù)雜的儀器設(shè)備：核酸提取儀器、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)和分析軟件。(2)操作復(fù)雜操作時(shí)間長(zhǎng)：需要提取核酸、PCR試劑配置、PCR反應(yīng)、電泳、凝集成像、分析結(jié)果等，做一次病原檢測(cè)需要近一天時(shí)間。(3)結(jié)果相對(duì)不可靠：非常容易污染，即使是國(guó)內(nèi)權(quán)威的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果都存在假陽(yáng)性結(jié)果。(4)環(huán)境要求高：很難在基層推廣，豬場(chǎng)配備了設(shè)備但是沒(méi)有人和時(shí)間使用。(5)每個(gè)實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立設(shè)計(jì)引物，檢測(cè)靈敏性不一致，質(zhì)量控制不到位，標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，難以標(biāo)準(zhǔn)化和數(shù)據(jù)分析。(6)病毒的組織嗜性不同采樣難度較大。目前常用血清學(xué)(ELISA)方法診斷偽狂犬病毒野毒株，但是血清學(xué)檢測(cè)方法是抗原和抗體反應(yīng)，僅檢測(cè)1次無(wú)法準(zhǔn)確判斷豬群的感染狀況和排毒狀況；血清學(xué)檢測(cè)抗體，檢測(cè)的抗體水平高低無(wú)法定量檢測(cè)分析，血清學(xué)僅能評(píng)價(jià)機(jī)體體液免疫產(chǎn)生的水平；血清學(xué)評(píng)估豬群健康度、對(duì)無(wú)癥狀帶毒和免疫耐受的豬群評(píng)估存在技術(shù)上的瓶頸；血清學(xué)需要采集前腔靜脈血，血樣采集相對(duì)費(fèi)力、費(fèi)時(shí)、且需要特殊設(shè)備輔助，多人協(xié)助。胎盤(Placenta)通常是指尿膜絨毛膜與子宮黏膜發(fā)生聯(lián)系所形成的結(jié)構(gòu)，包括兩部分，即尿膜絨毛膜的絨毛部分為胎兒胎盤，子宮黏膜部分為母體胎盤。胎兒的血管和子宮血管各自分布到自己的胎盤部分上去，但并不直接相通。臍帶血通常是指胎兒娩出、臍帶結(jié)扎并離斷后殘留在胎盤和臍帶中的血液。在實(shí)際生產(chǎn)中，快速精準(zhǔn)檢測(cè)臍帶血中的偽狂犬病毒野毒株難度相對(duì)很大，急需建立一種快速的臍帶血偽狂犬病毒野毒株的診斷方法，不僅可以對(duì)母豬疫苗株的安全評(píng)價(jià)及仔豬疾病的快速準(zhǔn)確診斷，及時(shí)制定防控計(jì)劃，具有十分重要的臨床意義，而且可根據(jù)臍帶血檢測(cè)結(jié)果評(píng)估豬群PRV野毒感染狀況，開(kāi)展偽狂犬疾病的凈化，達(dá)到規(guī)?；i場(chǎng)偽狂犬野毒感染為陰性。因此，亟待建立一種可以精準(zhǔn)診斷豬臍帶血偽狂犬病毒野毒株的方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提出一種診斷豬臍帶血偽狂犬病毒野毒株的Taqman實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒及其用途。該試劑盒具有靈敏度高、特異性好、重復(fù)性優(yōu)、檢測(cè)結(jié)果快速客觀準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，能同時(shí)反映母、仔豬豬偽狂犬病毒帶毒和排毒狀況，評(píng)估母豬豬偽狂犬疫苗的免疫效果，側(cè)面反映母豬的健康狀況水平，有益于對(duì)群體豬偽狂犬病毒感染的凈化和免疫情況的早期預(yù)警評(píng)判，進(jìn)一步有助于豬場(chǎng)做好該疾病的預(yù)警、防控工作。基于上述目的，本發(fā)明提供的一種診斷豬臍帶血偽狂犬病毒野毒株的Taqman實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒，包括擴(kuò)增引物和特異性熒光探針，所述擴(kuò)增引物和特異性熒光探針的序列如下所示：上游擴(kuò)增引物：5’-CTGGCTCTGCGTGCTGTGCTC-3’，其為SEQIDNO:1序列；下游擴(kuò)增引物：5’-CTCCTTCGTGATGACGTG-3’，其為SEQIDNO:2序列；特異性熒光探針：FAM-5’-CTGGCTCTGCGTGCTGTGCTC-3’-TAMARA，其為SEQIDNO:3序列，其中FAM為熒光報(bào)告基因，TAMARA為熒光淬滅基因。合理的引物設(shè)計(jì)和熒光探針設(shè)計(jì)是成功應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的關(guān)鍵。引物和探針的特異性對(duì)反應(yīng)有很大影響，如果引物和探針特異性不高，可能在擴(kuò)增構(gòu)成中產(chǎn)生非靶標(biāo)條帶，影響檢測(cè)結(jié)果的判定。利用本發(fā)明的引物和探針建立的實(shí)時(shí)熒光PCR方法能鑒別豬臍帶血中的偽狂犬病毒疫苗株和野毒株。采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法鑒別豬臍帶血中的偽狂犬病毒疫苗株和野毒株，關(guān)鍵是需要針對(duì)兩者所存在的序列差異片段，設(shè)計(jì)得到特異性的引物和探針。PRV基因組全長(zhǎng)約150kb，GC含量可以高達(dá)73％，至少含70多個(gè)基因，編碼約100種病毒蛋白。PRVgE基因是病毒增殖非必需基因。目前很多商業(yè)疫苗均缺失了PRV的gE基因，所以豬體內(nèi)的PRV疫苗毒一般不存在gE基因，而PRV野毒有g(shù)E基因。偽狂犬病毒的gE基因中GC含量很高，高達(dá)74.4％，導(dǎo)致野毒株gE基因的擴(kuò)增難度很大，且對(duì)酶和緩沖體系要求較高，設(shè)計(jì)檢測(cè)范圍更廣泛、特異性更強(qiáng)的引物和探針難度就更大。本發(fā)明引物和探針設(shè)計(jì)在PRV-gE基因上，參考NCBI已公布的212條偽狂犬gE基因設(shè)計(jì)引物和探針，該引物和探針的廣泛性和特異性強(qiáng)，用于擴(kuò)增gE2基因，檢測(cè)結(jié)果能特異性區(qū)分PRV疫苗毒和PRV野毒。另外，結(jié)合豬胎盤的生理結(jié)構(gòu)，豬屬于上皮絨毛胎盤，豬胎盤生理正常的結(jié)構(gòu)即血胎屏障，胎盤屏障的存在使正常的臍帶血內(nèi)不存在任何病原和抗體等大分子物質(zhì)，即使母源抗體(如IgG，12nm)都不能通過(guò)此胎盤屏障，所以成熟的PRV粒子的直徑為150-180nm，就很難直接穿越胎盤屏障感染胎兒，也是一道天然的保護(hù)屏障?？傊捎脧淖胸i臍帶血中檢測(cè)PRV-gE基因來(lái)評(píng)價(jià)母豬偽狂犬野毒帶毒和排毒狀況，仔豬在母體內(nèi)感染狀況和反饋母豬的健康狀況，是一種更加科學(xué)、直接和有效的診斷偽狂犬疾病、評(píng)估偽狂犬疫苗保護(hù)力水平和疾病預(yù)警方面的方法之一，在規(guī)?；i場(chǎng)的偽狂犬疾病的凈化過(guò)程中起到更加可靠的技術(shù)支撐。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述上游擴(kuò)增引物、所述下游擴(kuò)增引物和所述特異性熒光探針的摩爾比為3:3:2。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述上游擴(kuò)增引物、所述下游擴(kuò)增引物和所述特異性熒光探針在所述試劑盒中的終濃度均為0.1～5μM。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述試劑盒還包括陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、2×熒光定量Mixture。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述陰性對(duì)照為無(wú)DNA酶的ddH2O；所述陽(yáng)性對(duì)照為含有豬偽狂犬病毒gE2基因序列的克隆質(zhì)粒pEASY-T1-gE2，克隆質(zhì)粒pEASY-T1-gE2的終濃度為1.0×105copies/μl～1.0×107copies/μl。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述豬偽狂犬病毒gE2基因的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述克隆質(zhì)粒采用以下方法制備得到：利用SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物序列擴(kuò)增豬偽狂犬病毒gE2基因序列，豬偽狂犬病毒gE2基因序列酶切后與pEASY-T1載體連接，篩選陽(yáng)性克隆，測(cè)序正確的克隆質(zhì)粒命名為pEASY-T1-gE2。進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了一種所述的診斷豬臍帶血偽狂犬病毒野毒株的Taqman實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒的使用方法，包括以下步驟：(1)使用所述的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性1min；94℃變性15s，59℃退火延伸和熒光采集30s，共45個(gè)循環(huán)；然后25℃延伸10s，最后4℃保護(hù)，結(jié)束反應(yīng)；(2)結(jié)果分析：根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果判定：陰性對(duì)照擴(kuò)增無(wú)Ct值，陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增Ct值≤30時(shí)，則結(jié)果判定成立；Ct值≤40，則判斷為豬偽狂犬病毒陽(yáng)性；無(wú)Ct值顯示，則判斷為豬偽狂犬病毒陰性，豬偽狂犬病毒疫苗免疫成功。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系以20μL計(jì)為：0.3μM的SEQIDNO:1所示的上游擴(kuò)增引物：0.6μL；0.3μM的SEQIDNO:2所示的下游擴(kuò)增引物：0.6μL；0.2μM的SEQIDNO:3所示的特異性熒光探針：0.4μL；2×熒光定量Mixture：10μL；200ng/μL的DNA模板：2μL；ddH2O：補(bǔ)足至20μL。更進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了所述的試劑盒在制備診斷豬臍帶血偽狂犬病毒野毒株試劑中的用途。本發(fā)明應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR(qPCR)方法鑒別豬臍帶血中給的偽狂犬病毒疫苗株和野毒株的工作原理：PRV疫苗毒一般不存在gE基因，而PRV野毒有g(shù)E基因，針對(duì)PRVgE基因設(shè)計(jì)引物和探針序列，根據(jù)有無(wú)Ct值和Ct值的大小來(lái)鑒別仔豬臍帶血中的偽狂犬病毒疫苗株和野毒株；同時(shí)由于豬屬于上皮絨毛胎盤，母豬和胎兒獨(dú)立血液循環(huán)系統(tǒng)，之間存在血胎盤屏障的緣故，正常的“臍帶血”是不含病原體和抗體物質(zhì)的即無(wú)存在任何各種病原的相關(guān)的基因片段，因此可通過(guò)檢測(cè)“臍帶血”中是否存在豬偽狂犬病毒來(lái)判斷帶毒不發(fā)病母豬的情況，評(píng)價(jià)母豬的免疫水平及帶毒情況，評(píng)估仔豬感染豬偽狂犬病毒情況。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的試劑盒具有以下有益效果：(1)采用本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物和探針?biāo)⒌膶?shí)時(shí)熒光PCR方法可對(duì)仔豬臍帶血中的豬偽狂犬病毒野毒感染情況做診斷，從而可以評(píng)價(jià)母豬偽狂犬疫苗的保護(hù)力，而且可以預(yù)測(cè)和預(yù)警仔豬感染偽狂犬病毒野毒的狀況，為疾病防控提供有效的科學(xué)依據(jù)。(2)本發(fā)明的的實(shí)時(shí)熒光PCR方法更能直接，有效、綜合評(píng)價(jià)疫苗免疫母豬后的效果，與傳統(tǒng)的血清學(xué)抗體檢測(cè)評(píng)估相比更具有優(yōu)勢(shì)，該法也是血清學(xué)抗體評(píng)估疫苗效果的有效的補(bǔ)充，是非常好的疫苗評(píng)估質(zhì)量、免疫效果和免疫程序優(yōu)化的有力工具，可進(jìn)一步推廣和臨床應(yīng)用。(3)使用本發(fā)明的的實(shí)時(shí)熒光PCR方法進(jìn)行仔豬臍帶血檢測(cè)，即可鑒別偽狂犬病毒野毒株和偽狂犬病毒疫苗株，根據(jù)鑒別結(jié)果制定相應(yīng)的防控策略，最終達(dá)到最終凈化該病的目的。(4)本發(fā)明的實(shí)時(shí)熒光PCR方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。該方法檢測(cè)過(guò)程中需要儀器設(shè)備相對(duì)簡(jiǎn)單，不需要電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)及其分析軟件；檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)便，檢測(cè)時(shí)間短，做一次病原檢測(cè)僅需要3小時(shí)；結(jié)果相對(duì)可靠，不需要電泳，空氣中氣溶膠相對(duì)較少，不易污染；技術(shù)操作要求低，可以在基層大量推廣；可以相對(duì)容易質(zhì)量控制，易于標(biāo)準(zhǔn)化。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明診斷豬臍帶血偽狂犬病毒野毒株的流程圖；圖2為本發(fā)明gE1基因和gE2基因的熒光曲線；圖3為本發(fā)明陽(yáng)性對(duì)照10倍稀釋的梯度標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖4為本發(fā)明采用不同廠家的酶和不同退火溫度擴(kuò)增gE2基因的電泳圖；其中，1-4泳道為57℃退火，5-6泳道為59℃退火，1-6號(hào)泳道均采用天恩澤的酶；7-8泳道為57℃退火，9-10泳道為59℃退火，7-10號(hào)泳道均采用Biotools的酶；11-12泳道為59℃退火，13-14號(hào)泳道57℃退火，11-14號(hào)泳道均采用TaKaRa的酶；圖5為本發(fā)明敏感性檢測(cè)結(jié)果圖；圖6為本發(fā)明特異性檢測(cè)結(jié)果圖；圖7為本發(fā)明重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果圖。具體實(shí)施方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1本發(fā)明診斷豬臍帶血偽狂犬病毒野毒株的流程圖如圖1所示。具體包括以下步驟：(1)樣品采集；(2)樣品處理；(3)DNA提?。喊瓷虡I(yè)試劑盒說(shuō)明書操作；(4)qPCR：利用本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異性引物和探針進(jìn)行qPCR反應(yīng)；(5)判定結(jié)果。1.樣品采集(1)臍帶血樣品采集a.取干凈的青霉素瓶和瓶塞，清洗干凈，煮沸滅菌30分鐘，烘干后收集備用；b.當(dāng)仔豬出生時(shí)，將每頭母豬分娩的所有仔豬的“臍帶血”都擠到一個(gè)干凈的青霉素瓶中，每頭仔豬3-5滴即可，將其“臍帶血”擠到青霉素瓶，密封；注意事項(xiàng)：①必須要采集同窩母豬產(chǎn)的所有的仔豬，避免同窩母豬所產(chǎn)仔豬的個(gè)體差異造成漏檢；②可以雙人操作，也可以單獨(dú)操作，若仔豬臍帶血不便擠出，可以將臍帶剪成幾段再操作即可；③若母豬分娩出現(xiàn)木乃伊，死胎時(shí)，同窩仔豬臍帶血重點(diǎn)檢測(cè)；④弱仔的臍帶血可以另外單獨(dú)再收集一份，重點(diǎn)檢測(cè)；c.臍帶血收集完后蓋好瓶塞，用標(biāo)簽紙或者醫(yī)用白膠布在青霉素瓶做好標(biāo)記，注明采集時(shí)間、母豬耳號(hào)、胎次等信息；d.將收集的臍帶血的青霉素瓶放至-20°冰箱冷凍保存，送至實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，并附上采集臍帶血樣品的數(shù)量、母豬耳號(hào)、需要檢測(cè)項(xiàng)目的清單。(2)病料樣品(扁桃體、腎臟、肺臟和淋巴結(jié)等)A、剖解取內(nèi)臟：將患病豬剖解，取出完整的上述內(nèi)臟，放置在同一個(gè)干凈塑料袋內(nèi)。B、記錄：將裝有內(nèi)臟的塑料袋密封，貼標(biāo)簽并記錄發(fā)病豬的日齡、體重、品種、臨床癥狀等信息。C、將采集的病料樣品集中送至實(shí)驗(yàn)室，并附上所記錄的信息。2.樣品中模板DNA提取(1)取200μL待檢臍帶血樣品，加入0.5mL紅細(xì)胞裂解液，吹打混勻，使樣本充分裂解3-5分鐘。(2)4℃，4000-6,000rpm離心5分鐘，小心傾去上清。再短暫離心半分鐘，吸棄殘留的液體。此步有利于后面的細(xì)胞裂解，但一般可以省略。(3)向有沉淀的離心管內(nèi)加入0.5mL溶液A(溶液A有少量晶體沉淀，用前需要搖晃均勻)，用移液槍吹打使沉淀充分懸浮起來(lái)。此步目的是裂解細(xì)胞，釋放DNA，所以吹打越充分越好。(4)靜置2分鐘待溶液變清亮后，將液體轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中并靜置2-5分鐘，以使DNA與膜充分結(jié)合。(5)12,000rpm離心30秒，DNA將吸附到膜上，棄收集管中的廢液。(6)加入0.7mL的通用洗柱液，12,000rpm離心30秒，棄收集管中的廢液。(7)加入0.3mL的通用洗柱液，12,000rpm離心30秒，棄收集管中的廢液。(8)12,000rpm離心1分鐘，甩干殘留液體。此步很重要，以去除膜上殘留洗滌液，否則會(huì)影響后續(xù)反應(yīng)。(9)將離心吸附柱置于一新的1.5mL塑料離心管(自備)中，加入30μLDNA洗脫液(DNA洗脫液在56-65℃提前水浴10分鐘，可提高洗脫效率)，放置2分鐘。(10)12,000rpm離心30秒，離心管底溶液即DNA溶液?？梢粤⒓词褂没蚍胖?20℃保存。注：為監(jiān)測(cè)提取過(guò)程中的污染，建議在提取樣本的同時(shí)提取一管水作為陰性對(duì)照。3.引物和熒光探針的的篩選采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法診斷豬臍帶血偽狂犬病毒野毒株，其引物和探針設(shè)計(jì)是關(guān)鍵。PRV疫苗毒一般不存在gE基因，而PRV野毒有g(shù)E基因，可針對(duì)PRV的gE基因設(shè)計(jì)引物和探針序列，但由于gE基因的GC含量很高，高達(dá)74.4％，因此從眾多的引物和探針序列中篩選出特異性引物和特異性探針序列具有相當(dāng)大的難度。發(fā)明人根據(jù)熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果，首先從眾多設(shè)計(jì)的引物和探針序列中篩選出兩組引物和探針序列，具體序列見(jiàn)表1。表1第一組引物和探針序列用于擴(kuò)增gE1基因，第二組引物和探針序列用于擴(kuò)增gE2基因。比較兩組引物和探針序列分別擴(kuò)增gE1基因和gE2基因的熒光曲線和敏感性。具體步驟如下：3.1熒光曲線(1)采用實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系(20μL)為：0.3μM的上游擴(kuò)增引物：0.6μL；0.3μM的下游擴(kuò)增引物：0.6μL；0.2μM的特異性熒光探針：0.4μL；2×熒光定量Mixture：10μL；200ng/μL的DNA模板：2μL；ddH2O：補(bǔ)足至20μL。其中，2×熒光定量Mixture購(gòu)自湖南圣湘生物科技有限公司。(2)實(shí)時(shí)熒光PCR的反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1min；94℃變性15s，59℃退火延伸和熒光采集30s，共45個(gè)循環(huán)；然后25℃延伸10s，最后4℃保護(hù)，結(jié)束反應(yīng)。gE1基因和gE2基因的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2。3.2敏感性的檢測(cè)構(gòu)建分別包含豬偽狂犬病毒gE1和gE2基因序列的克隆質(zhì)粒，并對(duì)克隆質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，使其為：107-10-1copies/μl，具體構(gòu)建步驟參見(jiàn)“4.陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒的構(gòu)建與制備”，采用上述步驟進(jìn)行g(shù)E1和gE2基因序列敏感性的檢測(cè)。豬偽狂犬病毒gE1和gE2基因序列的敏感性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。表2豬偽狂犬病毒gE1和gE2基因序列的敏感性檢測(cè)結(jié)果由圖2和表2中可以看出，采用第二組引物和探針序列擴(kuò)增豬偽狂犬病毒gE2基因序列的熒光曲線和敏感性更佳。因此，最終篩選到的特異性引物和特異性熒光探針序列如下：上游擴(kuò)增引物：5’-CTGGCTCTGCGTGCTGTGCTC-3’(SEQIDNO:1)；下游擴(kuò)增引物：5’-CTCCTTCGTGATGACGTG-3’(SEQIDNO:2)；特異性熒光探針：FAM-5’-CTGGCTCTGCGTGCTGTGCTC-3’-TAMARA(SEQIDNO:3)，其中FAM為熒光報(bào)告基因，TAMARA為熒光淬滅基因。上述引物和特異性熒光探針由華大基因合成并進(jìn)行標(biāo)記，用于擴(kuò)增豬偽狂犬病毒gE2基因，目的片段為152bp左右，豬偽狂犬病毒gE2基因的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。4.陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒的構(gòu)建與制備(1)按照天恩澤柱式血液DNAout試劑盒操作說(shuō)明書提取豬偽狂犬病毒基因組DNA；以SEQIDNO:1和SEQIDNO:2作為特異性引物擴(kuò)增豬偽狂犬病毒gE2基因序列，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，共30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10min，4℃保溫5min。PCR產(chǎn)物于2％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定；(2)PCR產(chǎn)物的純化、克隆及序列分析：PCR產(chǎn)物用AXYGEN公司的AxyPrepDNAGelExcractionKit膠回收試劑盒回收，然后酶切后與同樣酶切的pEASY-T1克隆載體進(jìn)行連接，連接后轉(zhuǎn)化Trans1-T1PhageResistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含IPTG和X-gal的LB培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)12h-18h。經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，用OMEGA公司的PlasmidMiniKit1質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，然后用引物進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，測(cè)序后比對(duì)成功的克隆質(zhì)粒命名pEASY-T1-gE2?？寺≠|(zhì)粒用質(zhì)粒小提試劑盒進(jìn)行提純，獲得定量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。根據(jù)紫外分光光度計(jì)測(cè)定0D260和OD280值計(jì)算質(zhì)粒濃度，并換算為質(zhì)粒拷貝數(shù)，克隆質(zhì)粒終濃度為1.0×105copies/μl～1.0×107copies/μl。5.本發(fā)明試劑盒的成分上游擴(kuò)增引物：5’-CTGGCTCTGCGTGCTGTGCTC-3’(SEQIDNO:1)；下游擴(kuò)增引物：5’-CTCCTTCGTGATGACGTG-3’(SEQIDNO:2)；特異性熒光探針：FAM-5’-CTGGCTCTGCGTGCTGTGCTC-3’-TAMARA(SEQIDNO:3)，其中FAM為熒光報(bào)告基因，TAMARA為熒光淬滅基因；陽(yáng)性對(duì)照：含有豬偽狂犬病毒gE2基因序列的克隆質(zhì)粒pEASY-T1-gE2；陰性對(duì)照：無(wú)DNA酶的ddH2O；2×熒光定量Mixture。6.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作對(duì)克隆質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，使其為：108-101copies/μl，每個(gè)梯度重復(fù)三次進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖3為本發(fā)明陽(yáng)性對(duì)照10倍稀釋的梯度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，其中該標(biāo)準(zhǔn)曲線的參數(shù)如下：斜率：-3.39593，截距：40.82791，相關(guān)系數(shù)：-0.99879，擴(kuò)增效率：0.97002。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2大于0.99，斜率位于-3.9－-4.0之間，PCR擴(kuò)增效率E位于0.9－1.1之間。7.診斷豬臍帶血偽狂犬病毒野毒株本發(fā)明對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系中的酶和實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件中的退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化條件如下：擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖4，退火溫度在59℃時(shí)，使用Biotools的酶能消除陰性的非特異性擴(kuò)增，天恩澤的次之。本發(fā)明最終確定的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系和實(shí)時(shí)熒光PCR的反應(yīng)條件如下：(1)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系以20μL計(jì)為：0.3μM的SEQIDNO:1所示的上游擴(kuò)增引物：0.6μL；0.3μM的SEQIDNO:2所示的下游擴(kuò)增引物：0.6μL；0.2μM的SEQIDNO:3所示的特異性熒光探針：0.4μL；2×熒光定量Mixture：10μL；200ng/μL的DNA模板：2μL；ddH2O：補(bǔ)足至20μL。2×熒光定量Mixture中包括Biotools的酶。同時(shí)設(shè)有陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照克隆質(zhì)粒：2μL，其余組分相同；陰性對(duì)照無(wú)DNA酶的ddH2O：2μL，其余組分相同。(2)實(shí)時(shí)熒光PCR的反應(yīng)條件95℃預(yù)變性1min；94℃變性15s，59℃退火延伸和熒光采集30s，共45個(gè)循環(huán)；然后25℃延伸10s，最后4℃保護(hù)，結(jié)束反應(yīng)。8.結(jié)果分析：根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果判定：每次試驗(yàn)的過(guò)程都要加入陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照。在陰性對(duì)照擴(kuò)增無(wú)Ct值，陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增Ct值≤30時(shí)，則結(jié)果判定成立，即陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線；并且制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示，相關(guān)系數(shù)R2大于0.99，斜率位于-3.9－-4.0之間，PCR擴(kuò)增效率E位于0.9－1.1之間。若Ct值≤40，則判斷為豬偽狂犬病毒陽(yáng)性，即仔豬臍帶血中感染豬偽狂犬病毒野毒，表明母豬存在排毒現(xiàn)象，疫苗保護(hù)力存在一定不足，建議加強(qiáng)免疫接種或調(diào)整免疫程序；若無(wú)Ct值顯示，則判斷為豬偽狂犬病毒陰性，即仔豬臍帶血中沒(méi)有感染豬偽狂犬病毒野毒，表明豬偽狂犬疫苗免疫母豬保護(hù)力很好，且仔豬無(wú)感染豬偽狂犬病毒，疫苗免疫效果和免疫程序很到位。若陽(yáng)性對(duì)照Ct值>30或無(wú)顯示，則該樣本的檢測(cè)結(jié)果無(wú)效，應(yīng)查找并排除原因，并對(duì)此樣本進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例2靈敏度研究以陽(yáng)性對(duì)照克隆質(zhì)粒評(píng)價(jià)本發(fā)明的試劑盒的靈敏度，將克隆質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，檢測(cè)范圍為108-101copies/μl。結(jié)果表明，該方法的檢測(cè)范圍為108-101copies/μl，在此范圍的豬偽狂犬病毒含量可以得到可靠的結(jié)果，即該方法的靈敏度可以檢測(cè)到10個(gè)拷貝的豬偽狂犬病毒病毒含量的樣品。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5。實(shí)施例3特異性研究為了檢測(cè)本發(fā)明試劑盒的特異性，利用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)藍(lán)耳經(jīng)典株，豬細(xì)小病毒，豬輪狀病毒，豬傳染性胃腸炎病毒，豬圓環(huán)病毒，豬流行性腹瀉，乙型腦炎，豬瘟病毒等8種病毒。檢測(cè)結(jié)果表明：本發(fā)明的試劑盒僅對(duì)仔豬臍帶血中豬偽狂犬病毒進(jìn)行擴(kuò)增，表明本發(fā)明試劑盒能特異性擴(kuò)增豬偽狂犬病毒，而不與其它核酸發(fā)生交叉反應(yīng)。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖6。實(shí)施例4重復(fù)性研究選用陽(yáng)性對(duì)照克隆質(zhì)粒106、105、104個(gè)copies/μl,對(duì)每個(gè)濃度的樣本做3個(gè)重復(fù)，結(jié)果不同核酸濃度的檢測(cè)Ct值標(biāo)準(zhǔn)差≤0.10和≤0.06，變異系數(shù)≤10％，具有較好的重復(fù)性。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3和圖7。表3實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)豬偽狂犬病毒的重復(fù)性試驗(yàn)質(zhì)粒拷貝數(shù)(copies/μl)106105104Ct120.1223.6926.9Ct220.1523.5927.1Ct320.2623.6827.03Ctmean20.1823.6527.01SD0.070.060.10CV0.37％0.23％0.38％實(shí)施例5準(zhǔn)確性研究同時(shí)采用本發(fā)明的試劑盒以及普通PCR對(duì)各10份已知陽(yáng)性和陰性樣品進(jìn)行檢測(cè)以及對(duì)未知的臨床48份仔豬臍帶血進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4和表5。(1)已知陽(yáng)性和陰性樣品各10份的臨床驗(yàn)證表4采用本發(fā)明試劑盒以及普通PCR對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果的比較方法本發(fā)明試劑盒普通PCR10份陽(yáng)性樣品10份陽(yáng)性10份陽(yáng)性10份陰性樣品10份陰性10份陰性(2)未知的臨床48份臍帶血檢測(cè)結(jié)果表5采用本發(fā)明試劑盒以及普通PCR對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果的比較從表4和表5中可以看出：本發(fā)明實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)陽(yáng)性樣品與普通PCR檢測(cè)陽(yáng)性樣品的結(jié)果100％符合，但實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)比普通PCR檢測(cè)更敏感，且臨床癥狀表現(xiàn)是一致的。綜上可見(jiàn)，本發(fā)明設(shè)計(jì)的一對(duì)特異性引物和一條熒光探針以及構(gòu)成的試劑盒可以快速診斷豬臍帶血偽狂犬病毒野毒株，并能鑒別偽狂犬病毒疫苗株和野毒株，而且該檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、快速、特異性好、靈敏度高、可重復(fù)性好，檢測(cè)結(jié)果真實(shí)可靠。所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：以上任何實(shí)施例的討論僅為示例性的，并非旨在暗示本公開(kāi)的范圍(包括權(quán)利要求)被限于這些例子；在本發(fā)明的思路下，以上實(shí)施例或者不同實(shí)施例中的技術(shù)特征之間也可以進(jìn)行組合，并存在如上所述的本發(fā)明的不同方面的許多其它變化，為了簡(jiǎn)明它們沒(méi)有在細(xì)節(jié)中提供。因此，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何省略、修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3