本發(fā)明屬于疫苗生產技術領域，具體涉及一種無血清懸浮培養(yǎng)偽狂犬病毒的方法。

背景技術：

1951年earle等成功開發(fā)出能促進動物細胞體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基。1957年graff用灌注培養(yǎng)法懸浮培養(yǎng)細胞，數量達到1×10¹⁰-2×10¹⁰cell/l。1962年capstick成功地大規(guī)模懸浮培養(yǎng)小鼠腎細胞，標志著動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術的起步。1967年，vanwezel開發(fā)了微載體，并實現(xiàn)在生物反應器中大規(guī)模培養(yǎng)貼壁細胞。懸浮培養(yǎng)與微載體培養(yǎng)標志著大規(guī)模培養(yǎng)技術的開始，細胞生產病毒疫苗也成為細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術生產生物制品的第一次浪潮。從20世紀八十年代起，國內、外研究機構開發(fā)出了低血清、無血清細胞及懸浮培養(yǎng)技術，并應用到口蹄疫疫苗生產中，規(guī)模從2000l-8000l生物反應器。2000年以后，隨著流加培養(yǎng)、灌注培養(yǎng)、個性化細胞培養(yǎng)基等技術的發(fā)展，做為大規(guī)模培養(yǎng)主要設備的生物反應器規(guī)模也趨向大型化和簡單化。國際上懸浮培養(yǎng)技術發(fā)展較快，已趨向成熟，是疫苗、抗體等生物制品生產的普遍生產工藝模式。

當今生物制藥的主流技術是在大型機械攪拌式生物反應器中，用無血清培養(yǎng)基和低血清培養(yǎng)工藝懸浮培養(yǎng)細胞進行生產。

偽狂犬病又稱aujeszky病是由偽狂犬病毒(pseudrabiesvirus,prv)所引起的多種家畜及野生動物以發(fā)熱、奇癢及腦脊髓炎為主要特征的急性傳染病，尤其是危害全球養(yǎng)豬業(yè)的重大傳染病之一。隨著中國規(guī)?；图s化養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，從國外引進的種豬相應增多，偽狂犬病隨之傳入并不斷蔓延擴大，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失，中國將其列為二類傳染病。由于被感染的動物種類極多，病毒可在自然界反復循環(huán)存在，屬于典型的自然疫源性疾病，因此也是極難防制的傳染病之一。由于prv目前尚無有效的藥物治療方法，主要依靠疫苗接種、隔離感染豬群、淘汰隱性感染動物得到控制。

目前，國內生產偽狂犬疫苗主要依靠轉瓶培養(yǎng)方法，與轉瓶培養(yǎng)工藝相比，懸浮培養(yǎng)最大的技術優(yōu)勢在于：第一，單位體積內有效工作細胞數量增加；第二、全密閉、管道化系統(tǒng)生產流程及過程自動化監(jiān)控、控制技術，不僅減少了污染細胞的機會，而且在減輕勞動力強度的同時減少人為操作因素影響；第三、生物反應器容積的擴大，提升了終端產品的均一性，結合后期純化工藝，不但產品產量明顯提高，產品的質量獲得提高；第四、生產疫苗所用勞動力和車間、水、點、原材料、能源等成本遠低于傳統(tǒng)培養(yǎng)工藝，綜合成本大大降低。與貼壁細胞微載體培養(yǎng)相比，更節(jié)約成本、易于規(guī)?；糯笊a，提高產品的安全性和穩(wěn)定性，但是目前暫無生產偽狂犬弱毒活疫苗的懸浮培養(yǎng)工藝及其應用的相關報道。

如何通過無血清培養(yǎng)和生物反應器懸浮培養(yǎng)工藝進一步提高獸用偽狂犬疫苗的質量和產量，是目前本領域研究的重點和難點。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術中存在的上述問題，本發(fā)明提供一種無血清懸浮培養(yǎng)偽狂犬病毒的方法，可實現(xiàn)偽狂犬病毒的大規(guī)模擴增，能有效降低生產成本，顯著提高產品質量。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是：

一種無血清懸浮培養(yǎng)偽狂犬病毒的方法，包括以下步驟：

(1)種子細胞活化

將液氮凍存的種子細胞先用血清含量為8％的低血清懸浮培養(yǎng)基(bbsmmd910)活化，培養(yǎng)3代后，然后用血清含量為5％的低血清懸浮培養(yǎng)基培養(yǎng)3代，再用血清含量為2％的低血清懸浮培養(yǎng)基培養(yǎng)3代；

(2)種子細胞的無血清馴化

將低血清懸浮培養(yǎng)基中血清含量從2％降低至1％，培養(yǎng)至連續(xù)3天種子細胞活力均高于90％，將血清含量降低至0.5％，培養(yǎng)至連續(xù)3天種子細胞活力均高于90％，將血清含量降低至0.2％，培養(yǎng)至連續(xù)3天種子細胞活力均高于90％，將血清含量降低至0，采用無血清懸浮培養(yǎng)基bsfm連續(xù)傳代培養(yǎng)，每代培養(yǎng)72h，至培養(yǎng)至連續(xù)3天種子細胞活力均高于90％，停止馴化；

(3)在生物反應器中培養(yǎng)

將馴化后的種子細胞置于生物反應器中培養(yǎng)，培養(yǎng)3-6天，觀察細胞密度及活力的變化；

(4)偽狂犬病毒的增殖

將偽狂犬凍干種毒接種于生長良好的st單層細胞中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時間為24-48h，待病變達到80％以上時，收獲偽狂犬病毒液；因懸浮細胞對病毒的敏感性比貼壁細胞要低，因此將偽狂犬病毒在貼壁繁殖一代，再接懸浮細胞才能獲得高滴度的病毒含量；

(5)接種病毒

當生物反應器中種子細胞密度達到7.0×10⁶cell/ml以上時，按moi＝0.5-2接種步驟(4)獲得的偽狂犬病毒液；當moi偏低時，產生的病毒含量就會偏低，當moi偏高時，病毒含量雖有所升高，但培養(yǎng)及收毒時間都要延長4-8h，且代謝副產物增多，影響病毒質量；

(6)病毒規(guī)?；囵B(yǎng)

將步驟(5)所得混合物置于生物反應器中培養(yǎng)，培養(yǎng)至細胞病變≥60％且溶氧曲線保持穩(wěn)定狀態(tài)時，收獲病毒液，于-80℃保存。

進一步地，種子細胞為bhk21。

進一步地，步驟(2)馴化得到的種子細胞活力高于90％。

進一步地，步驟(3)中馴化后的種子細胞初始密度為6×10⁵cell/ml。

進一步地，步驟(3)中培養(yǎng)溫度為37℃，轉速為40r/min，溶氧為40-50％，ph值為7.1-7.3。

進一步地，步驟(5)中按moi＝1接種步驟(4)獲得的偽狂犬病毒液。

進一步地，步驟(6)中培養(yǎng)溫度為36±0.5℃，轉速為15r/min，溶氧為40-50％，ph值為7.2-7.4。

本發(fā)明提供的一種無血清懸浮培養(yǎng)偽狂犬病毒的方法，具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明通過先快速降低血清含量，再慢速降低血清含量，該方式有利于維持細胞密度及活率，當血清從1％降低至0時，由于細胞要耐受一個無血清的過程，通過緩慢降低血清比例，bhk21細胞有一個適應過程，不至于突然進入無血清環(huán)境產生不適應而影響細胞狀態(tài)，通過這種降低血清的比例方式對bhk21細胞的生長更有利，使獲得的bhk21種子細胞活力高于96％，密度達到7.5×10⁶cell/ml，該細胞可較好的使偽狂犬病毒增殖，使偽狂犬病毒滴度大于10^8.0tcid50/0.1ml，可將其用于偽狂犬病毒疫苗的生產，可避免動物血清帶來的風險。

(2)制備工藝穩(wěn)定，重復性好，病毒滴度高，能有效降低生產成本，易規(guī)?；糯笈囵B(yǎng)，可顯著提高產品質量，提高批次間同一性。

附圖說明

圖1為種子細胞bhk21的無血清馴化圖。

圖2為將馴化完成的bhk21細胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的生長曲線圖。

圖3為將馴化完成的bhk21細胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞活力變化圖。

具體實施方式

實施例1

一種無血清懸浮培養(yǎng)偽狂犬病毒的方法，包括以下步驟：

(1)種子細胞的活化

向500ml搖瓶中添加100ml細胞基本培養(yǎng)基(bbsmmd910)，按8％(v/v)比例加入新生牛血清(購于內蒙古金源康生物工程有限公司)，然后接入液氮凍存的種子細胞bhk21，培養(yǎng)培養(yǎng)3代后，然后將新生牛血清含量降低為5％的培養(yǎng)基培養(yǎng)3代，所得種子細胞bhk21密度為6×10⁵cell/ml，再新生牛血清含量降低為2％的培養(yǎng)基培養(yǎng)3代，制得bhk21懸浮細胞株；

(2)種子細胞的無血清馴化

將bhk21懸浮細胞株接入新生牛血清含量為1％的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)至連續(xù)3天種子細胞活力均高于90％，將血清含量降低至0.5％，培養(yǎng)至連續(xù)3天種子細胞活力均高于90％，將血清含量降低至0.2％，培養(yǎng)至連續(xù)3天種子細胞活力均高于90％，將血清含量降低至0，采用無血清懸浮培養(yǎng)基bsfm連續(xù)傳代培養(yǎng)，每代培養(yǎng)72h，至培養(yǎng)至連續(xù)3天種子細胞活力均高于90％，停止馴化；

種子細胞bhk21的無血清馴化圖見圖1，其中圖1-1為細胞馴化期間的生長情況，圖1-2為細胞馴化期間的比生長速率。由圖1可知，將bhk21貼壁細胞脫離轉入無血清培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)時，初期細胞表現(xiàn)出不適應的情況，平均比生長速率從初始的化0.66d^-1跌至化0.09d^-1；經過5代左右的馴化，細胞的平均比生長速率逐漸増加至0.88d^-1左右，但波動較大；馴化至7-8代時，bhk21懸浮細胞的平均比生長速率穩(wěn)定在化0.90d^-1；整個馴化過程中bhk細胞的活力始終維持在90％以上。

將馴化完成的bhk21細胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其生長曲線見圖2，細胞活力變化情況見圖3。

由圖2可知，將馴化完成的bhk21細胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，初始接種密度為0.6×10⁶/ml，培養(yǎng)24h后進入對數生長期，培養(yǎng)至72h，細胞密度達到高峰，為7.5×10⁶/ml，隨后，細胞密度逐漸降低至144h的0.8×10⁶/ml。

由圖3可知，初始細胞活率在98.4％，培養(yǎng)24h、48h后活率基本保持不變，培養(yǎng)至72h時，細胞活率降低至97.5％，隨著代謝副產物的增加及營養(yǎng)物質的不斷消耗，若繼續(xù)培養(yǎng)細胞則不能滿足細胞的生長需求，導致細胞活率逐漸降低。

(3)在生物反應器中培養(yǎng)bhk21細胞

將馴化后的種子細胞按初始密度為6×10⁵cell/ml接入7l攪拌罐生物反應器中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37℃，轉速為40r/min，溶氧為40-50％，ph值為7.1-7.3，培養(yǎng)時間為72h；

(4)偽狂犬病毒的增殖

將偽狂犬凍干種毒1支接種于生長良好的st單層細胞中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時間為48-72h，待病變達到80％以上時，收獲偽狂犬病毒液，測定病毒滴度；因懸浮細胞對病毒的敏感性比貼壁細胞要低，因此將偽狂犬病毒在貼壁繁殖一代，再接懸浮細胞才能獲得高滴度的病毒含量；

(5)接種病毒

當生物反應器中種子細胞密度達到7.0×10⁶cell/ml以上時，按moi＝1接種步驟(4)獲得的偽狂犬病毒液；當moi偏低時，產生的病毒含量就會偏低，當moi偏高時，病毒含量雖有所升高，但培養(yǎng)及收毒時間都要延長4-8h，且代謝副產物增多，影響病毒質量；moi對病毒滴度的影響結果見表1。

(6)病毒規(guī)?；囵B(yǎng)

將步驟(5)所得混合物置于75l生物反應器中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為36±0.5℃，轉速為15r/min，溶氧為40-50％，ph值為7.2-7.4，培養(yǎng)30h后，細胞病變≥60％且溶氧曲線保持穩(wěn)定狀態(tài)時，收獲病毒液，于-80℃保存，在培養(yǎng)期間，最大細胞密度可達7.0×10⁶cell/ml以上，病毒滴度峰值達到10^8.6tcid50/0.1ml。

傳統(tǒng)方法采用轉瓶培養(yǎng)方式培養(yǎng)，培養(yǎng)基為血清含量為8％的低血清培養(yǎng)基，轉瓶培養(yǎng)和反應器全懸浮培養(yǎng)，其bhk21細胞毒價見表2；反應器無血清培養(yǎng)與轉瓶培養(yǎng)經濟效益對比結果見表3。

表1接毒量(moi)對病毒滴度的影響結果

由表1可知，當接種量偏低時，病毒滴度偏低，在一定范圍內隨著接種量的增加，病毒滴度隨之增加，但當接種量超過1時，病毒滴度降低，因此當moi＝1時，病毒滴度較高，副產物也少，病毒質量較好。

表2轉瓶培養(yǎng)和反應器全懸浮培養(yǎng)的病毒毒價對比

表3反應器無血清培養(yǎng)與轉瓶培養(yǎng)經濟效益對比

綜上所述，本發(fā)明通過先快速降低血清含量，再慢速降低血清含量，最終馴化得到無血清培養(yǎng)的種子細胞，該種子細胞活力高，密度大，能夠很好的培養(yǎng)偽狂犬病毒，在特定的接種量情況下，使偽狂犬病毒迅速增殖，提高其滴度，再結合生物反應器的培養(yǎng)，能夠控制其產品效力，提高批次間同一性，節(jié)約勞動力，降低對車間條件的要求。