專利名稱：利用ix蛋白展示狂犬病病毒保護性抗原的犬ii型腺病毒活載體重組疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用犬Ii型腺病毒不同結(jié)構(gòu)蛋白的特性，分別展示狂犬病病毒保護性抗原或抗原表位的重組疫苗，可用于新型動物狂犬病疫苗的研制和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
狂犬病是由狂犬病病毒引起的以非化膿性腦脊髓炎為主要特征的一種重要人畜共患傳染病，感染人和動物后，一旦發(fā)病，死亡率幾乎是100%。我國是狂犬病的多發(fā)地，每年有上千人死于狂犬病，主要是由帶病毒的犬咬傷引起。盡管目前人用商品疫苗安全有效， 但大量帶毒動物的存在仍然對人類生命安全構(gòu)成了直接威脅。特別是近年來，死于狂犬病的人數(shù)呈逐年上升的趨勢。因此，減少或控制狂犬病病毒在家養(yǎng)動物中的貯集是有效控制人狂犬病發(fā)生的重要途徑。目前用于動物狂犬病預(yù)防的疫苗主要是滅活疫苗和弱毒疫苗，二者對預(yù)防狂犬病的發(fā)生起到了積極重要的作用。但是滅活疫苗免疫周期短，接種方式單一，不適于動物的田間免疫，而且在我國還沒有實現(xiàn)國產(chǎn)化，進口滅活疫苗制備工藝復(fù)雜，成本昂貴，比較適用于發(fā)達國家。弱毒疫苗在敏感動物體內(nèi)有毒力返祖的危險，不能從根本上消除狂犬病，因此，難以在我國得到推廣。隨著對狂犬病病毒分子生物學特性的不斷研究，已證明糖蛋白是唯一可以誘導機體產(chǎn)生中和抗體的狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白。國際上許多實驗室都開展了以糖蛋白為保護性抗原的亞單位疫苗、基因工程亞單位疫苗、DNA疫苗等新型狂犬病疫苗的研究。雖然這些疫苗可以誘導特異性中和抗體的產(chǎn)生，并具有一定的免疫保護力，但由于免疫原性較弱，未得到實際應(yīng)用。以痘病毒和人5型腺病毒為載體表達狂犬病病毒糖蛋白的活載體重組疫苗研究取得了一定進展，在歐洲和北美洲的免疫試驗證明，具有良好的免疫原性。但由于存在再次免疫排斥或安全性問題，而未得到正式批準使用。為提高重組腺病毒疫苗的實際應(yīng)用價值， 目前，以人5型腺病毒為載體的展示疫苗已有研究，而以犬II型腺病毒為載體的展示疫苗技術(shù)在國內(nèi)外尚未見報道。以犬II型腺病毒為載體的重組疫苗對犬科動物易感，也可在貓、牛和豬等家畜動物體內(nèi)有效復(fù)制，而且遺傳特性穩(wěn)定，安全性好，在新型狂犬病疫苗的研究中具有較大的開發(fā)潛力。本實驗室構(gòu)建的表達狂犬病病毒糖蛋白的犬II型腺病毒活載體重組疫苗，已獲得國家發(fā)明專利，并完成了在生產(chǎn)性試驗階段的生物安全評價，證明具有良好的免疫效果和安全性。在此基礎(chǔ)上，為進一步提高犬II型腺病毒重組疫苗的免疫效力和實際應(yīng)用價值， 本發(fā)明提供了一系列以犬II型腺病毒結(jié)構(gòu)蛋白展示表達狂犬病病毒保護性抗原或抗原表位的重組疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供利用IX蛋白展示狂犬病病毒保護性抗原的犬II型腺病毒活載體重組疫苗。本發(fā)明的技術(shù)方案是以犬II型腺病毒為載體，在其結(jié)構(gòu)蛋白基因的疏水性位點插入狂犬病病毒保護性抗原基因或表達抗原表位的核苷酸序列，使外源抗原或表位在腺病毒表面與其結(jié)構(gòu)蛋白融合表達。進一步講，以犬II型腺病毒疫苗株為載體，在其結(jié)構(gòu)蛋白六鄰粒、纖突或IX蛋白上，利用這些結(jié)構(gòu)蛋白基因自身的轉(zhuǎn)錄原件，融合表達狂犬病病毒保護性抗原或抗原表位， 使其在犬II型腺病毒顆粒表面得以展示，從而達到增強重組疫苗免疫效力的目的。免疫試驗證明，該系列重組疫苗均可誘導產(chǎn)生高滴度的針對狂犬病病毒和犬腺病毒的中和抗體， 并能抵抗狂犬病病毒標準強毒株和犬腺病毒強毒株的攻擊。首先，在不發(fā)生堿基缺失和不影響結(jié)構(gòu)蛋白轉(zhuǎn)錄的前提下，對犬II型腺病毒全基因組中六鄰粒、纖突或IX蛋白基因進行改造1、過重疊PCR分別在犬II型腺病毒全基因組六鄰?；虺儏^(qū)的4個位點，按六鄰粒的轉(zhuǎn)錄閱讀框分別插入狂犬病病毒糖蛋白中和抗原表位，使其與六鄰粒在腺病毒顆粒外表面融合表達；2、在犬II型腺病毒全基因組^106bp處引入一段人工合成的核酸序列(含Xma I 酶切位點)，在Xma I酶切位點處，按纖突的轉(zhuǎn)錄閱讀框插入狂犬病病毒糖蛋白中和抗原表位，使其與纖突在腺病毒顆粒外表面融合表達；3、利用犬II型腺病毒IX蛋白基因內(nèi)的限制性內(nèi)切酶Ase I位點，在IX蛋白轉(zhuǎn)錄終止密碼子處插入狂犬病病毒糖蛋白膜外區(qū)基因和SV40病毒多聚A轉(zhuǎn)錄終止信號，使IX 蛋白與外源抗原表位利用同一轉(zhuǎn)錄閱讀框在腺病毒顆粒外表面融合表達。其次，狂犬病病毒保護性抗原或抗原表位能隨重組犬II型腺病毒結(jié)構(gòu)蛋白一起轉(zhuǎn)錄，在病毒顆粒表面產(chǎn)生多個拷貝，其免疫效力好于單一拷貝的重組疫苗；第三，重組疫苗的增殖、擴大培養(yǎng)以及免疫接種的方式均與載體病毒疫苗株犬II型腺病毒一致；第四， 動物接種重組疫苗后，將同時獲得針對犬腺病毒感染和狂犬病病毒感染的免疫力，并能抵抗正常致死劑量強毒株的攻擊。展示狂犬病病毒保護性抗原的重組犬II型腺病毒的構(gòu)建過程1、利用實驗室前期構(gòu)建的含犬II型腺病毒全基因組質(zhì)粒PP0LYII-CAV2中兩個單一酶切位點得到含六鄰?；虻拇笃?，將其克隆入pET-28a載體，獲得重組質(zhì)粒pET-LH。 再利用PET-LH中大片段的兩個單一酶切位點得到含六鄰?；虻男∑?，將其克隆入 pET-28a載體，獲得重組質(zhì)粒pET-SH。通過重疊PCR將狂犬病病毒中和抗原表位分別插入六鄰體超變區(qū)內(nèi)的4個不同位點(分別在犬II型腺病毒全基因組的17378bp、17450bp、 17623bp和18084bp處)，并將PCR產(chǎn)物克隆入pMD18_T載體，進行序列測定。測序正確后， 利用六鄰粒中兩個單一酶切位點將改造后的六鄰?；蚩寺∪隤ET-SH。最后，按照上述路線返向克隆，獲得重組犬II型腺病毒全基因組。2、利用pBluescriptll KS (+/-)中的酶切位點&ic I和Kpn I，插入人工合成序列 Linker SK(依次含Sal I,Xma I,Spe I和Pac I多個酶切位點)，獲得重組質(zhì)粒pBS-SKI。 按纖突基因序列，人工合成犬II型腺病毒全基因組序列^050bp ^106bp區(qū)段，并插入 Linker SK中Ml I Xma I之間，利用PCR獲得犬II型腺病毒全基因組中30182bp 29358bp序列，將兩片段插入Linker SK中Spe I Pac I之間，獲得重組質(zhì)粒pBS—SKII。
4再將狂犬病病毒中和抗原表位按纖突基因的轉(zhuǎn)錄閱讀框插入PBS-SKII的Linker SK中Xma I和Spe I位點之間，獲得改造后的纖突基因。最后，通過Linker SK中兩端的酶切位點Ml I和I^ac I，將改造的纖突基因插入pP0LYII-CAV2中，得到重組犬II型腺病毒全基因組。3、利用pP0LYII-CAV2中兩個單一酶切位點得到含IX蛋白基因的大片段，將其克隆入pBluescriptll KS (+/-)載體，獲得重組質(zhì)粒pBS_LIX。再利用pBS_LIX中大片段的兩個單一酶切位點得到含IX蛋白基因的小片段，將其克隆入PEGFP-Cl載體，獲得重組質(zhì)粒 PEGFP-SIXo然后，在IX蛋白終止密碼子處，利用其自身的酶切位點插入狂犬病病毒糖蛋白膜外區(qū)基因與SV40多聚A轉(zhuǎn)錄終止序列，實現(xiàn)IX蛋白與糖蛋白膜外區(qū)融合表達。最后，按照上述路線，返向克隆獲得重組犬II型腺病毒全基因組。4、堿裂解法大量制備各種重組犬II型腺病毒基因組質(zhì)粒，分別經(jīng)Asc I和Riie I 雙酶切游離全基因組后，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染5 μ g基因組DNA于犬腎傳代細胞系MDCK，隔天傳代1次，直至出現(xiàn)典型的犬腺病毒病變(葡萄串狀)。展示狂犬病病毒保護性抗原的犬II型腺病毒活載體重組疫苗免疫原性1、利用MDCK細胞大量制備重組疫苗，并測定疫苗的TCID5tl (均不低于 106-5TCID50/0. 1ml)。取無狂犬病免疫史的家犬為試驗動物，分別兩側(cè)股內(nèi)側(cè)肌肉注射和口服接種。2、免疫時每條犬肌肉注射Iml或口服2ml —種重組疫苗，免疫一次，免疫前及免疫后每周采血并分離血清。3、采用熒光抗體狂犬病病毒中和試驗(FAVN)法，檢測免疫犬血清中和抗體效價， 結(jié)果顯示，重組疫苗誘導的平均中和抗體水平在免疫后第3周時，均能達到國際最低保護水平(0. 5IU/ml)以上，第4 5周達到最高(4. 62 6. 43IU/ml)。通過血凝抑制試驗， 檢測試驗犬體內(nèi)腺病毒抗體效價，結(jié)果顯示，重組疫苗誘導的腺病毒抗體水平在免疫后第4 周時最高，均為1 21(1。展示狂犬病病毒保護性抗原的犬II型腺病毒活載體重組疫苗的免疫保護作用免疫6周后，對各試驗組動物進行攻毒，每組分別用IOOLD5tl的狂犬病病毒標準強毒CVS-M和犬腺病毒強毒進行攻毒。攻毒后對試驗動物進行封閉隔離飼養(yǎng)，相互之間不接觸，每天觀察并記錄試驗動物的采食和發(fā)病情況，觀察40天。結(jié)果顯示，口服和肌肉注射任何一種重組疫苗的犬均可抵抗強毒的攻擊，存活率在90%以上。
具體實施方案下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明做進一步描述實施例1 以六鄰粒展示狂犬病病毒保護性抗原的重組疫苗全基因組的克隆Eco52I和SnaB I雙酶切pP0LYII_CAV2，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收12516bp片段，克隆入pET-28a載體，獲得重組質(zhì)粒pET-LH。再用Nde I和Mlu I雙酶切pET_LH，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收4325bp片段，克隆至pET-28a載體，獲得重組質(zhì)粒pET_SH。通過重疊PCR將狂犬病病毒中和抗原表位分別插入六鄰體內(nèi)4個不同位點，并將PCR產(chǎn)物克隆至pMDIS-T 載體，進行序列測定。測序正確后，利用六鄰粒Kpn I和Dra I兩個自然酶切位點將改造后的六鄰?；蚩寺∪雙ET-SH。最后，按照上述路線，返向克隆獲得4種重組犬II型腺病毒全基因組質(zhì)粒 pPolyII-CAV2/HVRl-GAP、pPolyII-CAV2/HVR2-GAP、pPolyII-CAV2/HVR3-GAP和 pPolyII-CAV2/HVR4-GAP。重疊PCR引物序列HV (forward)5’ -ATATCAGGGGTACCCTAGACAGAG-3，；HV(reverse)5， -GGTGTGTATTTAAAGGCATCAGGC-3‘；HVR I-GAP (forward)5’ -CTCGGATCCTGGAGCCCTATTGACATACTAGGTTCAGCTGTCACAAACAATACCTACCA-3’ ；HVRl-GAP(reverse)5' -TGAACCTAGTATGTCAATAGGGCTCCAGGATCCGAGCACAGTTATGGCACCTGCAGAGG-3'；HVR2-GAP(forward)5’ -CTCGGATCCTGGAGCCCTATTGACATACTAGGTTCAGAGCTGGGGGATGCGTCTGGCCG-3，；HVR2-GAP(reverse)5’ -TGAACCTAGTATGTCAATAGGGCTCCAGGATCCGAGATCGACCCAGCTTTCAGGGCCCA-3’ ；HVR3-GAP(forward)5’ -CTCGGATCCTGGAGCCCTATTGACATACTAGGTTCAGCCATGCTAT ACACTGAAGATGT-3，；HVR3-GAP(reverse)5’ -TGAACCTAGTATGTCAATAGGGCTCCAGGATCCGAGGGTGGTCACCTTATAAAATCTGG-3，；HVR4-GAP(forward)5’ -CTCGGATCCTGGAGCCCTATTGACATACTAGGTTCATTTCAGGCAGAAAATACCAATGT-3，；HVR4-GAP(reverse)5’ -TGAACCTAGTATGTCAATAGGGCTCCAGGATCCGAGAACCTTCATGGTGGTCATGTTTG-3，。其中，在犬II型腺病毒全基因組17378bp處插入外源基因時，用引物HV和 HVRl-GAP,最終得到重組犬II型腺病毒全基因組質(zhì)粒pPolyII-CAV2/HVRl-GAP ；在 17450bp處插入時，用引物HV和HVR2-GAP，最終得到重組犬II型腺病毒全基因組質(zhì)粒 pPolyII-CAV2/HVR2-GAP ；在17623bp處插入時，用引物HV和HVR3-GAP，最終得到重組犬 II型腺病毒全基因組質(zhì)粒pPolyII-CAV2/HVR3-GAP ；在18084bp處插入時，用引物HV和 HVR4-GAP，最終得到重組犬II型腺病毒全基因組質(zhì)粒pPolyII-CAV2/HVR4-GAP?？袢〔《咎堑鞍字泻涂乖砦籇NA序列 5’ -TGAACCTAGTATGTCAATAGGGCTCCAGGATCCGAG-3’。PCR反應(yīng)條件以在犬II型腺病毒全基因組17378bp處插入外源基因為例，質(zhì)粒pET_SH為模板， HVR(reverse)和 HVR1-GAP (forward)為引物，在 TaKaRa Ex Taq DNA 聚合酶作用下，95°C 預(yù)變性5min，94°C變性45s，59°C退火45s，72°C延伸lmin，共30個循環(huán)，得到突變位點左側(cè)片段(2L)。以 pET-SH 為模板，HVRl-GAP(reverse)和 HV(forward)為引物，在 TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶作用下，95°C預(yù)變性5min，94°C變性45s，56°C退火45s，72°C延伸lmin, 共30個循環(huán)，72°C延伸IOmin擴增突變位點右側(cè)片段QR)。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收純化。然后，進行第二步PCR，分別取25-50ng 2L和2R片段充分混勻作為模板， 以HV (forward)和HV (reverse)為引物，在TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶作用下，95°C預(yù)變性5min, 94°C變性45s，56°C退火45s，72°C延伸lmin，共30個循環(huán)，擴增得到HVRl-GAP突變片段。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收純化，連接到PMD18-T Vector，進行測序。在其他位置插入時以相同方法，利用各自引物進行重疊PCR擴增。實施例2 以纖突展示狂犬病病毒保護性抗原的重組疫苗全基因組的克隆利用pBluescriptll KS(+/-)中的酶切位點&ic I和Kpn I，插入人工合成序列 Linker SK(依次含Sal I,Xma I,Spe I和Pac I多個酶切位點)，獲得重組質(zhì)粒pBS-SKI。 按纖突基因序列，人工合成犬II型腺病毒全基因組序列^050bp ^106bp區(qū)段，并插入 Linker SK中Ml I Xma I之間，利用PCR獲得犬II型腺病毒全基因組中30182bp 29358bp序列，將兩片段插入Linker SK中Spe I Pac I之間，獲得重組質(zhì)粒pBS-SKII。 再將狂犬病病毒中和抗原表位按纖突基因的轉(zhuǎn)錄閱讀框插入PBS-SKII的Linker SK中Xma I和Spe I位點之間，獲得改造后的纖突基因。最后，通過Linker SK中兩端的酶切位點Ml I和he I，將改造的纖突基因插入pP0LYII-CAV2中，得到重組犬II型腺病毒全基因組質(zhì)粒 pP0LYII-CAV2/Fiber-GAP。Linker SK 序歹ljSense sequence 5’ -CGTCGACAGTCCCGGGAGTGGCGCCAGTGGGCCCAGTACTAGTGCCTTAATTAAGGTAC-3，；Antisense sequence 5’ -CTTAATTAAGGCACTAGTACTGGGCCCACTGGCGCCACTCCCGGGACTGTCGACGAGCT-3，。人工合成犬II型腺病毒全基因組^050bp ^106bp區(qū)段序列Sense sequence 5’ -TCGACGGTGCCCCCAGCAGAAGTATCGACTGCATGCTAATTATTAACAAACCAAAAC-3，；Antisense sequence 5’ -CCGGGTTTTGGTTTGTTAATAATTAGCATGCAGTCGATACTTCTGCTGGGGGCACCG-3，。PCR引物序列Forward 5' -TGATCACCGCAACGGTGAATG-3’Reverse :5’ -TGAGTATGATGATGCTCTTGCAC-3，PCR反應(yīng)條件在TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶作用下，95°C預(yù)變性5min，94°C變性45s，55°C退火 45s，72°C延伸lmin，共30個循環(huán)，72°C延伸lOmin。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收純化， 連接到PMD18-T Vector，進行測序。實施例3 以IX蛋白展示狂犬病病毒保護性抗原的重組疫苗全基因組的克隆EcoR I和Cla I雙酶切pP0LYII_CAV2，瓊脂糖凝膠電泳回收3610bp片段，克隆入 pBluescriptll KS (+/-)，獲得重組質(zhì)粒 pBS-LIX。Mlu I 與 EcoR I 雙酶切 pBS-LIX，瓊脂糖凝膠電泳回收340bp片段，克隆入pEGFP-Cl，獲得重組質(zhì)粒pEGFP-SIX。在IX蛋白終止密碼子處，利用單一酶切位點Ase I插入狂犬病病毒糖蛋白膜外區(qū)基因(G’)與SV40多聚 A轉(zhuǎn)錄終止信號序列，實現(xiàn)IX蛋白與糖蛋白膜外區(qū)融合表達。最后，按照上述路線，返向克隆獲得重組犬II型腺病毒全基因組質(zhì)粒PP0LYII-CAV2/IX-G’。實施例4 重組疫苗的包裝與鑒定1、重組疫苗的包裝
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取改造的犬二型腺病毒質(zhì)粒pPolyII-CAV2/HVRl_GAP、pPolyII-CAV2/HVR2_GAP、 pPolyII-CAV2/HVR3-GAP、 pPolylI-CAV2/HVR4-GAP, pPOLYII-CAV2/Fiber-GAP 禾口 PP0LYII-CAV2/IX-G’各5 μ g，分別以Asc I和Riie I雙酶切釋放重組的全基因組，利用 Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染至MDCK細胞系，直到細胞出現(xiàn)病變。酶切條件限制性內(nèi)切酶Asc I和Pme I各10U，IOXBuffer 5 μ 1，質(zhì)粒5 μ g，加水補至 50μ 1。37°C水浴反應(yīng)Ih后，氯仿異戊醇04 1)抽提1次，2倍體積無水乙醇沉淀，滅菌四餾水溶解沉淀，-20°C保存?zhèn)溆谩?、重組疫苗的鑒定重組疫苗基因組鑒定取50ml培養(yǎng)瓶內(nèi)已呈葡萄串狀病變的單層MDCK細胞，傾棄培養(yǎng)基，以PBS洗滌2 次，加入800 μ 1新鮮配制的細胞裂解液(0.6% SDS, IOmM EDTA，100 μ g/ml蛋白酶K)，37°C 溫育lh，加入200 μ 1 5Μ NaCl，輕輕混勻后，冰水浴lh。將全部混合物移入離心管，于4°C， 12000rpm離心40min，上清移入加一離心管，以等體積酚氯仿抽提2次，加入終濃度0. 25M 醋酸鈉和2倍體積無水乙醇，12000rpm離心lOmin，DNA沉淀以70%乙醇洗滌1次，無菌風干后，溶于50 μ 1去離子水。以基因組為模板，PCR擴增外源基因，測序鑒定。鑒定用PCR引物序列①CAV2/HVR 1-GAP、CAV2/HVR2-GAP、CAV2/HVR3-GAP 和 CAV2/HVR4-GAP 鑒定用弓丨物序列Forward 5' -GGTGTGTATTTAAAGGCATCAGGC-3，；Reverse :5’ -ATATCAGGGGTACCCTAGACAGAG-3，。②CAV2/Fiber_GAP鑒定用引物序列Forward 5' -AGCAGAAGTATCGACTGCAT-3，；Reverse :5’ -TGAGTATGATGATGCTCTTGCAC-3，。③CAV2/IX-G’鑒定用引物序列Forward 5' -AGCTGAAGATCCAGGTGGCT-3，；Reverse :5’ -ACGCTGGACACGGTATTATC-3，。PCR反應(yīng)條件同上。TCID50 的測定將IX IO7MDCK細胞傳入96孔細胞培養(yǎng)板，每孔內(nèi)細胞約1X106，補加培養(yǎng)基至 100μ1ο次日，接入待測病毒樣品。在1 11孔內(nèi)，進行KT1 10_"稀釋，A H列為同濃度重復(fù)。7天后，以Karber法計算待測重組疫苗的TCID5(1。免疫原性鑒定(Westernblotting)取含狂犬病病毒SRV9株的細胞裂解液50 μ 1，加等量2 X SDS-PAGE上樣緩沖液，沸水浴lOmin，冷卻至室溫，短暫離心后進行SDS-PAGE電泳。電泳完畢，將膠上蛋白樣品電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，分別與犬抗重組疫苗的多抗及陽性和陰性對照多抗、HR標記兔抗犬二抗反應(yīng)，最后以DAB/H2A顯色，根據(jù)顯色帶出現(xiàn)與否及其位置判定重組疫苗是否表達狂犬病病毒抗原。
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毒力鑒定取4 5月齡犬腺病毒和狂犬病病毒抗體陰性犬60條，按接種重組疫苗不同分為 6組，每組10條，分別用含IO8TCID5tl和IO7TCID5tl的重組疫苗細胞培養(yǎng)液各肌肉注射5條犬。注射后，觀察注射犬的飲食、精神狀態(tài)等表現(xiàn)，測量體溫、計數(shù)白細胞數(shù)量和其它臨床表現(xiàn)等，并在4周后解剖注射犬，觀察犬體病理變化，并進行肝等主要臟器的組織切片觀察。穩(wěn)定性鑒定1 X IO6MDCK細胞傳入25cm2細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，細胞長成單層后，按培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基體積的0. 5%接入重組疫苗，接種后3 4天收毒，對各種重組疫苗分別連續(xù)傳代40次，標記并保存每次的培養(yǎng)液，同時每隔5代，提取感染細胞中的腺病毒基因組，通過PCR和DNA測序鑒定外源基因的大小、方向和位置。結(jié)果1.各重組疫苗基因組內(nèi)均正確插入了狂犬病病毒保護性抗原，轉(zhuǎn)錄方向與病毒基因組轉(zhuǎn)錄方向一致；2. 0. Iml各重組疫苗的TCID50無明顯差別，為IO6.5 IO7 ；3.各重組疫苗均表達了狂犬病病毒糖蛋白中和表位，抗體可以與狂犬病病毒糖蛋白特異性結(jié)合；4.毒力檢測結(jié)果顯示，注射犬未出現(xiàn)飲食和精神表現(xiàn)等異常，體溫在正常范圍內(nèi) (37.5 38.5°C)。體內(nèi)白細胞計數(shù)顯示，白細胞總數(shù)(7.5 16.0X109/L)分類計數(shù)均在正常范圍內(nèi)，注射犬未出現(xiàn)藍眼或厭食等臨床表現(xiàn)。解剖未見主要組織器官出現(xiàn)異常變化， 重組疫苗注射犬肺、肝和腎等組織切片與健康犬的組織切片無明顯區(qū)別。5.穩(wěn)定性鑒定結(jié)果表明，各重組疫苗經(jīng)過40代傳代，其基因組(包括外源基因的大小、方向和位置)均保持不變，外源基因序列均未發(fā)生改變。實施例5 以六鄰粒展示狂犬病病毒保護性抗原的犬II型腺病毒活載體重組疫苗的免疫效果實驗動物狂犬病病毒和腺病毒抗體陰性的4 5月齡犬80條，隨機分為8組，每組10條。動物免疫分別以TCID5tl 為 106·5 的重組疫苗 CAV2/HVR1-GAP、CAV2/HVR2-GAP、CAV2/HVR3-GAP 和CAV2/HVR4-GAP對8組犬進行免疫。每種重組疫苗各免疫20條犬，其中肌肉注射10條， Iml/條；口服 10 條，2ml/條。免疫檢測免疫前及免疫后每周分別采集少量靜脈血，分離血清，以FAVN檢測受試犬狂犬病病毒中和抗體水平。攻毒試驗免疫6周后，每組隨機抽取5條犬，以IOOLD5tl狂犬病標準強毒株CVS-M接種；其余犬以IOOLD5tl犬I型和II型腺病毒強毒混合物接種。隔離觀察各犬至接種后40天，詳細記錄各組犬的發(fā)病及死亡情況。結(jié)果1.所有受試犬的免疫前血清內(nèi)檢不出抗犬腺病毒及狂犬病病毒的特異性抗體；
2.所有犬免疫后2 3周，其血清中均可檢出抗腺病毒抗體，至6周時，抗體仍維持在較高水平；3.所有受試犬免疫后3 4周時，其血清中均可檢出狂犬病中和抗體，抗體消長規(guī)律與腺病毒抗體一致；4.受試犬能抵抗犬I型與II型腺病毒強毒的攻擊，存活率為95% ；5.受試犬能抵抗狂犬病強毒的攻擊，存活率為90% ；結(jié)論4株不同重組疫苗均可誘導機體產(chǎn)生針對犬腺病毒和狂犬病病毒的特異性中和抗體，對犬腺病毒和狂犬病病毒感染具有保護作用。實施例6 以纖突展示狂犬病病毒保護性抗原的犬II型腺病毒活載體重組疫苗的免疫效果實驗動物狂犬病病毒和腺病毒抗體陰性的4 5月齡犬20條，隨機分為2組，每組10條。動物免疫分別以TCID5tl為IO6 5的重組疫苗CAV2/Fiber_GAP對2組犬進行免疫。其中肌肉注射10條，Iml/條；口服10條，2ml/條。免疫檢測免疫前及免疫后每周分別采集少量靜脈血，分離血清，以FAVN檢測受試犬狂犬病病毒中和抗體水平。攻毒試驗免疫6周后，每組隨機抽取5條犬，以IOOLD5tl狂犬病標準強毒株CVS44接種；其余犬以IOOLD5tl犬I型和II型腺病毒強毒混合物接種。隔離觀察各犬至接種后40天，詳細記錄各組犬的發(fā)病及死亡情況。結(jié)果1.所有受試犬的免疫前血清內(nèi)檢不出抗犬腺病毒及狂犬病病毒的特異性抗體；2.所有犬免疫后2 3周，其血清中均可檢出抗腺病毒抗體，至6周時，抗體仍維持在較高水平；3.所有受試犬免疫后3 4周時，其血清中均可檢出狂犬病中和抗體，抗體消長規(guī)律與腺病毒抗體一致；4.受試犬能抵抗犬I型與II型腺病毒強毒的攻擊，存活率為95% ；5.受試犬能抵抗狂犬病強毒的攻擊，存活率為90% ；結(jié)論重組疫苗CAV2/Fiber_GAP可誘導機體產(chǎn)生針對犬腺病毒和狂犬病病毒的特異性中和抗體，對犬腺病毒和狂犬病病毒感染有保護作用。實施例7 以IX蛋白展示狂犬病病毒保護性抗原的犬II型腺病毒活載體重組疫苗的免疫效果實驗動物狂犬病病毒和腺病毒抗體陰性的4 5月齡犬20條，隨機分為2組，每組10條。動物免疫
10
分別以TCID5tl為IO6 5的重組疫苗CAV2/IX-G’對2組犬進行免疫。其中肌肉注射 10 條，Iml/ 條；口服 10 條，2ml/ 條。免疫檢測免疫前及免疫后每周分別采集少量靜脈血，分離血清，以FAVN檢測受試犬狂犬病病毒中和抗體水平。攻毒試驗免疫6周后，每組隨機抽取5條犬，以IOOLD5tl狂犬病標準強毒株CVS44接種；其余犬以IOOLD5tl犬I型和II型腺病毒強毒混合物接種。隔離觀察各犬至接種后40天，詳細記錄各組犬的發(fā)病及死亡情況。結(jié)果1.所有受試犬的免疫前血清內(nèi)檢不出抗犬腺病毒及狂犬病病毒的特異性抗體；2.所有犬免疫后2 3周，其血清中均可檢出抗腺病毒抗體，至6周時，抗體仍維持在較高水平；3.所有受試犬免疫后3 4周時，其血清中均可檢出狂犬病中和抗體，抗體消長規(guī)律與腺病毒抗體一致；4.受試犬能抵抗犬I型與II型腺病毒強毒的攻擊，存活率為95% ；5.受試犬能抵抗狂犬病強毒的攻擊，存活率為90% ；結(jié)論重組疫苗CAV2/IX-G’可誘導機體產(chǎn)生針對犬腺病毒和狂犬病病毒的特異性中和抗體，對犬腺病毒和狂犬病病毒感染有保護作用。附改造后犬II型腺病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因序列1.改造后犬II型腺病毒結(jié)構(gòu)蛋白六鄰?；蛐蛄兄亟M疫苗CAV2/HVR1-GAP中六鄰?；蛐蛄蠥TGGCAACCCCGTCGATGCTGCCACAATGGTCTTACATGCACATTGCTGGCCAGGACGCCGCCGAATA CTTGTCTCCCGCCCTGGTTCAGTTTGCCCAAGCAACCAGTTCTTACTTTAAGTTGGACAACAAGTTCAGAAACCCC ACTGTGGCCCCCACCCACGATGTGACCACTGAGAGGTCGCAGCGCTTGCAGCTGCGCTTTGTGCCAGTCATGCAA GAGGATGGCCAGTACACTTACAAAACCCGCTTCCAGCTTGCGGTGGGAGACAACAGGGTGCTGGACATGGCCAGT ACTTACTTCGATATCAGGGGTACCCTAGACAGAGGCCCCTCCTTCAAGCCTTACAGCGGCACCGCCTACAATGCC CTCGCCCCCAAGGCCGGGGCTAACAACTGTCTTTTTAATGGACAGGGTGCCAATATTAACACTTTAGCCCAGGTG
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12tggggcccattcaaaagattggttttggaaatgttgaggccatggaaatcaacctcaatgccaacctcttcaaaagc ttcctttactccaatgtggccttatacttgcctgatgcctttaaatacacacctgaaaacattgtggcccctgccaa tgtgaatacctatgcttacat gaatgttagattacccgccgccaaccttatagatacctttgtaaatattggcgcc agatggtcaccagatgtaatggacactgttaatcctttcaaccaccacagaaatgcaggactccgctaccgttcaca actgcttggcaatggccgctattgctcgttccatattcaggtccctcaaaaattttttgcaatcaaaaatctcctcc tactgcctggaacgtacacgtacgagtggtctttcagaaaggatgtaaacatgatccttcaaagcagcttgggcaat gacctccgagtggatggggccaccatcaacattcagagcatcaacctatatgcaagctttttcccaatggcacacaa cactgcctccactctggaagccatgctgcgcaacgatgtaaatgaccagtcctttgcagactacctgtcttctgcca acatgctttatcccatccctgccaacactactaacctgccaatctccattcccgccagaaactgggcgggatttaga gggtggagctttaccagaattaagcaacgagaaactcctgccctgggctcgccttatgatccctacttcacttattc gggcagtattccatatctggatgcaactttttacctcagccacacctttagaagagtttccatcatgtttgactctt ccgtgtcttggcctggcaatgacaggctgcttacccccaatgagtttgagattaaaaggtatgtagacggtgaaggt tacaatgtggcccagtccaacatgacaaaagactggttcatggttcaaatgctagcccactacaacatcggctacca aggctaccacctgccagaaagctacaaggacagaatgtactccttcctaagaaactttgagcccatgtgcagacagt tggtggacgtggccaactatgctgcctaccagccggttaccgtgggccaccagcataacaattctggttatgctagc gccctttcggcctttaacccgcgtgaggggcacccatacccagcaaactggccttacccactcattggagccaatgc agtacccactgtcacccagaaaaagttcctctgcgacaggtccctgtggcgcatcccattctcctccaactttatgt ctatgggaaccctcactgacctgggccaaaacctgctgtactctaactccgcccacgcccttgacatgacttttgag gttgatgccatgaatgagcccactctgttgtacgttttgtttgaagtgttcgacgtggcacgcgtccatcagcccca ccggggggtgattgaggtagtgtacctcagaactcccttctccgccggcaacgccaccacctaa_■序列為狂犬病病毒糖蛋白中和抗原表位基因序列重組疫苗cav2/hvr3-gap中六鄰粒基因序列atggcaaccccgtcgatgctgccacaatggtcttacatgcacattgctggccaggacgccgccgaata cttgtctcccgccctggttcagtttgcccaagcaaccagttcttactttaagttggacaacaagttcagaaacccc actgtggcccccacccacgatgtgaccactgagaggtcgcagcgcttgcagctgcgctttgtgccagtcatgcaa gaggatggccagtacacttacaaaacccgcttccagcttgcggtgggagacaacagggtgctggacatggccagt acttacttc gatatcaggggtaccctagacagaggcccctccttcaagccttacagcggcaccgcctacaatgccc tcgcccccaaggccggggctaacaactgtctttttaatggacagggtgccaatattaacactttagcccaggtgccc tctgcaggtactgtggctgtcacaaacaatacctaccagccagagccccagctgggccctgaaagctgggtcgatg gcagcctagcagagctgggggatgcgtctggccgtgcccttaaggcttcaaccccgcgcatgccttgctatggttc
ctatgctccccccaccaacgaaaatggaggt |ctcggatcctggagccctattgacatac |taggttc^1 actggtccagtggaatccagattttataaggtgaccaccaacaataacaatgaagcagatgcc
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icccgggI1 TGGAGCCCGATCGATATAGGCGCCTCTCTAAAAGGCGCATGCAAACTCAAGTTATGTGGAGTTCTTG GACTTAGACTTATGGACGGAACATGGGGGCCCAGTAATGAGACCAAATGGTGTCCTCCCGATCAGTTGGTTAATCTG CACGACTTTCGCTCAGACGAAATTGAGCATCTTGTTGTAGAGGAGGCTAGTGGCGTTGCCACTTACACCCTTACCTT TAGGTTTTTAAACTTTAACAGACTAAGCGGAGGTACCCTGTTTAAAACTGATGTCTTAACCTTTACCTATGTAGGCG AAAATCAATAAAACCAGAAAAAAATAAGTTTAAAAGCTTTATTTTTCATACACGCGAGCGGTAAGGCTGCCGCCTTC AGGAAAAGTTACTCTGTAAACAGTTCTTTCACAACAGCACAAAACATAGGTATTAGTTAACAGTTCATTTGGGCTAT AATAATATACATTTTCTTGGGTGGCAAAGCAAGGGTCGGTAATCTCAACAAAACCATCAACTGGAATGCAAGAATAG TCCAGCACGGTGGGTTCAATCTAAAAATGAAGAAACGCGTTGAGGTTCACTAAGCACAGGTTTTGAATCTGTCGGCA GCGTCCATGCATCATAGCTTGTCTCAAAGCAGATTGTCTTCTTTCCTCTGCCTTGGAAGTGGTTTGGTGAAGCACTA CAGGTGTCTTTTCAACCTCTTTCAGCACCCGCACTATTACAGATCTCACCCACACAGCACAGTTTTTAAGAGAACAA TAGTTTTGAAGGCTACAAGATTTACACTTAAGCACCAGCCAGTAATTATAAGTGCTTTTAAGAACTACCCCTAGCTC AGGGTTAATGCACCTTTTAATGGCCTCCATGCAGGCTTTATGGACAGTTCTAAAAAAAGACAGTCTAAAATAAATGT AGTGAGTGTTTCTAAATATAATACTCCCCACATAGTTAATTTCATCAGGCCTGCTAGAATTTACAAACTCTCGGTAC CACATATACTTTTTATTCATAGCCCCACCCTTAATAAAGTCCTCAATCACTTTCTGAACCACATGCTTGCTAGCCAT GCATTGTAAAGACAAGCTGTTAGAGCAGTGACAGTGTACTCGCCACGTTTGAGCCTCTGCCAGGCAGCAGTGCTTAG
15TTACTATCAACTCAATACCCGCATTGCATGTAAACCCCCCAAAGAGCAGTTTTTCATGCCTGTGTAGCACATCATCC CACAAAATAGGAATTTCATAGCATAAAGCAAAGCAATTACAATATTTAGGAACTCTCACCACAGCAGTCACGTGACA TGTTGTCTCAGCAGTGCAGTTGCCTTCCATCCTACAATTATGAACAAAAACTAAACACTTCTAACAAAGATACAGTG
ACAATCTCCCTTCCTCTAAAAGCATTGTTTACATTAGGGTGATTATTAACAACGTCAGAAATTTCTT ΙΤΑΑΤΤΑ,
AAGTGCCTTTAAAATGTGCAAGAGCATCATCATACTCAI加框I序列分別為Ml I、Xma I和I^ac I位點，下劃線部分是狂犬病病毒中和抗原表位序列。3.重組疫苗CAV2/IX-G’中IX蛋白序列
atggaccctcaacagaaggggcttgtgaacacgtgttttgtgactacgcg
TATTCCGTCTTGGGCAGGAGCAAGACAGAATGTCACCGGGTCAGATTTAG
AAGGAAAGCCCGTGCCCTCAGATGTGCTGGAAAGTGGACGCCCGCTTGCl
AGCCCCGCGCATCAGAACTTTGTATGAGGAGCAGCAGCTGAACATGCTTG
CGGTGAATGTTCTTTTGGATGAGCTGAAGATCCAGGTGGCTGCCATGCA^
AACTCTGTGACTGCTATTCAGCGAGAAGTAAATGATCTAAAGCAACGAATl
CGCCCGAGAT丨 GGCCCAAATTCCCTATTTACACGATACCAGACACACTTGGTCCCTGGAGACCGATCGATA TACATCATCTCAGTTGCCCAAACAATTTGGTTGTGGAGGATGAAGGATGCACCAACCTGTCAGGGTTCTCCTACATG GAACTTAAAGTTGGACACATCTCAGCCATAAAGGTGAACGGGTTCACTTGCACAGGCGTTGTGACAGAGGCAGAAAC GTACACTAACTTTGTTGGTTATGTCACCACCACGTTCAAAAGAAAGCATTTCCGCCCAACACCAGATGCATGTAGAG CCGCGTACAACTGGAAGATGGCCGGTGACCCCAGATATGAAGAGTCTCTACACAGTCCGTACCCTGACTACCATTGG CTTCGAACCGTAAAAACCACAAAGGAGTCTATCGTTATCATATCTCCAAGTGTGGCAAATTTGGACCCATATGATAA CTCCCTTCACTTGAGGGTCTTCCCTAGCGGAAAGTGCTCAGGAATAACGGTGCCTTCTGTCTACTGCTCAACTAAC CACGATTACACCGTTTGGATGCCTGAAATCCTGAGACTAGGGACATCTTGTGATATTTTTACTAATAGTAGAGGGAA GAGAGCATCCAAGGGGAGCAAGACCTGTGGCTTTGTAGATGAAAGGGGCCTATATAAGTCTCTAAAAGGCGCATGCA AACTCAAGTTATGTGGAGTTCCTGGACTTAGACTTATGGACGGAACATGGGTCTCGATGCAGACATCAAATGAGACC AAATGGTGTCCTCCCGGTCAGTTGGTTAATCTGCACGACCTTCACTCAGACGAAATTGAGCATCTTGTTGTAGAGGA GTTGGTCAAGAAAAGAGAGGAGTGTCTGGATGCACTAGAGTCCATCATAACCACCAAGTCAGTGAGTTTCAGACGTC TCAGTCATTTAAGAAAACTTGTCCCCGGGTTCGGAAAGGCATATACCATATTCAACAAGACCTTGATGGAGGCTGAA GCTCACTACAAGTCAGTCAGGACTTGGAATGAGATCATCCCCTCAAAAGGGTGTTTGAGAGTTGGAGGGCATGTTTT AATCCCAGAGATGCAATCATCCCTCCTCCAGCAACATATAGAGTTATTGGAATCCTCAGTTATTCCCCTGATGCACC CCCTTGCAGACCCGTTCACAGTTTTCAAGGACGGCGATGAGATTGAGGATTTTGTGGAAGTTCACCTTCCCGATGTG CACGAACAGGTCTCAGGGGTTGACCTGGGTCTCCCGAACTGGGGGAAG
gttaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcat cacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttg
tccaaactcatcaatgtatcttaacgcg|taat|分是犬II型腺病毒IX蛋白序列，下劃線部分是狂犬病病毒糖蛋白膜外區(qū)
16序列，陰影部分是SV40poly(A)序列。
權(quán)利要求
1.一種利用IX蛋白展示狂犬病病毒保護性抗原的犬II型腺病毒活載體重組疫苗，其特征在于以犬II型腺病毒為載體，在其結(jié)構(gòu)蛋白基因的疏水性位點插入狂犬病病毒保護性抗原基因或表達抗原表位的核苷酸序列，使外源抗原或表位在腺病毒表面與其結(jié)構(gòu)蛋白融合表達，所述的疏水性位點位于犬II型腺病毒結(jié)構(gòu)蛋白IX蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組疫苗，其特征在于利用犬II型腺病毒IX蛋白基因內(nèi)的限制性內(nèi)切酶Ase I位點，在IX蛋白轉(zhuǎn)錄終止密碼子處插入狂犬病病毒糖蛋白膜外區(qū)基因和SV40病毒多聚A轉(zhuǎn)錄終止信號，使IX蛋白與外源抗原利用同一轉(zhuǎn)錄閱讀框在腺病毒顆粒外表面融合表達。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組疫苗，其特征在于利用PP0LYII-CAV2中兩個單一酶切位點得到含IX蛋白基因的大片段，將其克隆入pBluescriptn KS(+/_)載體，獲得重組質(zhì)粒pBS-LIX，再利用pBS-LIX中大片段的兩個單一酶切位點得到含IX蛋白基因的小片段，將其克隆入PEGFP-Cl載體，獲得重組質(zhì)粒pEGFP-SIX，然后，在IX蛋白終止密碼子處，利用其自身的酶切位點插入狂犬病病毒糖蛋白膜外區(qū)基因與SV40多聚A轉(zhuǎn)錄終止序列，實現(xiàn)IX 蛋白與糖蛋白膜外區(qū)融合表達，最后，按照上述路線，返向克隆獲得重組犬II型腺病毒全基因組。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組疫苗，其特征在于所述的狂犬病病毒保護性抗原基因為狂犬病病毒糖蛋白膜外區(qū)序列為GGCCCAAATTCCCTATTTACACGATACCAGACACACTTGGTCCCTGGAGACCGATCGATATACATCATCTCA GTTGCCCAAACAATTTGGTTGTGGAGGATGAAGGATGCACCAACCTGTCAGGGTTCTCCTACATGGAACTTAAAGTT GGACACATCTCAGCCATAAAGGTGAACGGGTTCACTTGCACAGGCGTTGTGACAGAGGCAGAAACGTACACTAACTT TGTTGGTTATGTCACCACCACGTTCAAAAGAAAGCATTTCCGCCCAACACCAGATGCATGTAGAGCCGCGTACAACT GGAAGATGGCCGGTGACCCCAGATATGAAGAGTCTCTACACAGTCCGTACCCTGACTACCATTGGCTTCGAACCGTA AAAACCACAAAGGAGTCTATCGTTATCATATCTCCAAGTGTGGCAAATTTGGACCCATATGATAACTCCCTTCACTT GAGGGTCTTCCCTAGCGGAAAGTGCTCAGGAATAACGGTGCCTTCTGTCTACTGCTCAACTAACCACGATTACACCG TTTGGATGCCTGAAATCCTGAGACTAGGGACATCTTGTGATATTTTTACTAATAGTAGAGGGAAGAGAGCATCCAAG GGGAGCAAGACCTGTGGCTTTGTAGATGAAAGGGGCCTATATAAGTCTCTAAAAGGCGCATGCAAACTCAAGTTATG TGGAGTTCCTGGACTTAGACTTATGGACGGAACATGGGTCTCGATGCAGACATCAAATGAGACCAAATGGTGTCCTC CCGGTCAGTTGGTTAATCTGCACGACCTTCACTCAGACGAAATTGAGCATCTTGTTGTAGAGGAGTTGGTCAAGAAA AGAGAGGAGTGTCTGGATGCACTAGAGTCCATCATAACCACCAAGTCAGTGAGTTTCAGACGTCTCAGTCATTTAAG AAAACTTGTCCCCGGGTTCGGAAAGGCATATACCATATTCAACAAGACCTTGATGGAGGCTGAAGCTCACTACAAGT CAGTCAGGACTTGGAATGAGATCATCCCCTCAAAAGGGTGTTTGAGAGTTGGAGGGCATGTTTTAATCCCAGAGATG CAATCATCCCTCCTCCAGCAACATATAGAGTTATTGGAATCCTCAGTTATTCCCCTGATGCACCCCCTTGCAGACCC GTTCACAGTTTTCAAGGACGGCGATGAGATTGAGGATTTTGTGGAAGTTCACCTTCCCGATGTGCACGAACAGGTCT CAGGGGTTGACCTGGGTCTCCCGAACTGGGGGAAG。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組疫苗，其特征在于所述的表達抗原表位的核苷酸序列為TGAACCTAGTATGTCAATAGGGCTCCAGGATCCGAG 或 CCCGGGTGGAGCCCGATCGATATAGGCGCCTCTCTAAAAGGCGCATGCAAACTCAAGTTATGTGGAGTTCTTGGACTTAGACTTATGGACGGAACATGGGGGCCCAGTAAT GAGACCAAATGGTGTCCTCCCGATCAGTTGGTTAATCTGCACGACTTTCGCTCAGACGAAATTGAGCATCTTGTTGT AGAGGAGGCTAGC。
全文摘要
一種利用IX蛋白展示狂犬病病毒保護性抗原的犬II型腺病毒活載體重組疫苗，涉及利用犬II型腺病毒不同結(jié)構(gòu)蛋白的特性，分別展示狂犬病病毒保護性抗原或抗原表位的重組疫苗，在其結(jié)構(gòu)蛋白基因的疏水性位點利用IX蛋白插入狂犬病病毒保護性抗原基因或表達抗原表位的核苷酸序列，使外源抗原或表位在腺病毒表面與其結(jié)構(gòu)蛋白融合表達。本發(fā)明重組疫苗攻毒后對試驗動物進行封閉隔離飼養(yǎng)，觀察并記錄試驗動物的采食和發(fā)病情況，結(jié)果顯示，口服和肌肉注射任何一種重組疫苗的犬均可抵抗強毒的攻擊，存活率在90％以上。
文檔編號C12N15/66GK102335424SQ20111027391
公開日2012年2月1日 申請日期2007年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月22日
發(fā)明者劉曄, 張守峰, 扈榮良, 李忠 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所