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一種PEDV和TGEV雙重RT?PCR檢測方法及其探針引物組合與試劑盒與流程

文檔序號:12457599閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種PEDV和TGEV雙重RT-PCR探針引物組合,其特征在于,包括以下引物對和探針:

PEDV上游引物:CGTGGAATTTCATTAGGTTTGCTTA

PEDV下游引物:CAAGTGCTGTGCTGTCCTCTAGT

PEDV探針:CAAGTGCTGTGCTGTCCTCTAGT

TGEV上游引物:GCAGGTAAAGGTGATGTGACAAGAT

TGEV下游引物:ACATTCAGCCAGTTGTGGGTAAT

TGEV探針:CTTGGCACTGCTCCCATTGGCAAC。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的探針引物組合,其特征在于,所述PEDV探針和TGEV探針序列的3’端結(jié)合相同的熒光淬滅基團;所述PEDV探針和TGEV探針序列的5’端結(jié)合不同的熒光報告基團。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的探針引物組合,其特征在于,所述熒光淬滅基團為BHQ1;所述PEDV探針的熒光報告基團為HEX;所述TGEV探針的熒光報告基團為FAM。

4.一種PEDV和TGEV雙重RT-PCR檢測方法,其特征在于,包括以下步驟:

1)病毒總RNA提??;

2)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;

3)RT-PCR擴增:利用權(quán)利要求1-3任一項所述的探針引物組合,以cDNA為模板進行RT-PCR擴增,收集熒光信號;

4)結(jié)果判定:若擴增產(chǎn)物產(chǎn)生的Ct值≤38,則為陽性。

5.如權(quán)利要求4所述的方法,其特征在于,步驟3)中,RT-PCR擴增的反應(yīng)體系如下:2μL 10×PCR buffer、2μL 2.5mΜdNTP、1U Ace Taq DNA聚合酶、0.3μM PEDV上游引物、0.3μM PEDV下游引物、0.2μM PEDV探針、0.3μM TGEV上游引物、0.3μM TGEV下游引物和0.25μM TGEV探針、補足至20μL的ddH2O。

6.如權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于,步驟3)中,RT-PCR擴增的反應(yīng)程序如下:95℃1min;95℃10s,60℃30s,40個循環(huán),從60℃開始收集熒光信號。

7.一種PEDV和TGEV雙重RT-PCR檢測試劑盒,包括如權(quán)利要求1-3任一項所述的探針引物組合。

8.如權(quán)利要求7所述的檢測試劑盒,其特征在于,還包括RT-PCR緩沖液、DNA聚合酶、酶混合物、陽性對照品、陰性對照品;所述陰性對照為滅菌后焦碳酸二乙酯處理水。

9.如權(quán)利要求8所述的檢測試劑盒,其特征在于,所述RT-PCR緩沖液為氯化鎂和三磷酸脫氧核糖核苷酸的混合物;所述酶混合物包括RNA酶抑制劑,M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和Ace Taq DNA聚合酶。

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