本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)對(duì)網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒進(jìn)行快速檢測(cè)的通用PCR引物、通用RT-PCR方法及其檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)：

網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒(Reticuloendotheliosis virus，REV)屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科、禽類C型反轉(zhuǎn)錄病毒屬中的網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒群。本病為免疫抑制性疾病，能侵害機(jī)體的免疫系統(tǒng)，可導(dǎo)致機(jī)體免疫機(jī)能下降，易于繼發(fā)其它疾病?；疾〖仪菔潜静〉闹饕獋魅驹矗赏ㄟ^口、眼分泌物及糞便水平傳播，亦可通過種蛋垂直傳播，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)以及相關(guān)產(chǎn)業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。REV病毒粒子呈球形，直徑為100nm，有囊膜，外表面突起。REV病毒群可分為完全復(fù)制型(A株)和不完全復(fù)制型(T株)。通過REV特異性單抗介導(dǎo)的IFA實(shí)驗(yàn)，REV被分為三種不同亞型：I、II和III型，各型代表分別是：170A、SNV和CSV。

REV全基因組有兩個(gè)開放閱讀框，編碼3個(gè)蛋白(gag、pol和env)，兩側(cè)是長(zhǎng)末端序列(long terminal region，LTR)。其中env蛋白是囊膜蛋白，能被進(jìn)一步裂解為gp90和gp20，較小的gp20貫穿病毒的囊膜，稱為穿膜蛋白(TM)，較大的gp90通過二硫鍵和氫鍵與TM相連，暴露于囊膜之外，稱之為表面蛋白，TM和SU是env基因編碼的前體蛋白經(jīng)水解后產(chǎn)生的，其中g(shù)p90具有型特異性抗原，是REV的免疫顯性蛋白。

傳統(tǒng)的REV抗體檢測(cè)方法包括瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、間接免疫熒光試驗(yàn)、間接ELISA等方法。但是當(dāng)抗體水平較低時(shí)，容易造成假陰性，因此需進(jìn)行病原檢測(cè)確診。最經(jīng)典、最準(zhǔn)確的病原檢測(cè)方法是采集病料接種雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)，多次消化傳代后用REV特異性抗血清通過間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)、免疫過氧化物酶染色、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)或ELISA來檢測(cè)REV進(jìn)行驗(yàn)證，但是這一過程至少需要數(shù)天的時(shí)間，耗時(shí)較長(zhǎng)。也可通過病理組織學(xué)觀察來診斷REV，將病理切片與IFA以及免疫組化等技術(shù)相結(jié)合，可作為區(qū)分REV、MDV和ALV的有效方法。此方法雖能清晰地顯現(xiàn)REV抗原的存在位置及組織病理變化，但是操作繁瑣，不適合大批量樣本檢測(cè)分析。

近幾年隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，REV的診斷技術(shù)也有了很大進(jìn)步。PCR技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、特異和敏感的特點(diǎn)，可以作為REV檢測(cè)的一種方法，其應(yīng)用范圍廣，同時(shí)可以進(jìn)行REV的確診。該方法基于REV前病毒DNA可插入到宿主DNA中這個(gè)特點(diǎn)，直接使用組織DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。REV的基因組較為穩(wěn)定，LTR、env、pol、gag等基因均可作為PCR擴(kuò)增的靶點(diǎn)，RT-PCR診斷方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，適合于基層使用，有利于REV快速診斷。

公開于該背景技術(shù)部分的信息僅僅旨在增加對(duì)本發(fā)明的總體背景的理解，而不應(yīng)當(dāng)被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒的通用PCR引物，以及使用了該引物的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系、RT-PCR檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒，該P(yáng)CR擴(kuò)增反應(yīng)體系、RT-PCR檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒操作簡(jiǎn)便，通用性好，特異性強(qiáng)，靈敏度高，成本低，可以同時(shí)進(jìn)行大批量樣本分析。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一對(duì)檢測(cè)網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒的PCR引物，包括上游引物5’-GAAGAATGGACTGTCTCACC-3’(如序列表SEQ ID No.1所示)和下游引物5’-CGTCTTCATACGARCCTGGC-3’(如序列表SEQ ID No.2所示)。其中下游引物中的R為簡(jiǎn)并引物，R＝A/G。

本發(fā)明還提供了一種包含上游引物：5’-GAAGAATGGACTGTCTCACC-3’和下游引物：5’-CGTCTTCATACGARCCTGGC-3’的檢測(cè)試劑盒。

本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系，包括以下組分：

其中：上游引物：5’-GAAGAATGGACTGTCTCACC-3’，下游引物：5’-CGTCTTCATACGARCCTGGC-3’。20μM的上下游引物是指引物自身的濃度，而非其在PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中的終濃度。

在上述反應(yīng)體系另外一種可能的實(shí)現(xiàn)方式中，所述反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性94℃5min；30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為94℃45s，57℃45s，72℃30s；最后經(jīng)過72℃10min延伸。

在上述反應(yīng)體系另外一種可能的實(shí)現(xiàn)方式中，所述樣本取自待測(cè)菌懸液或家禽臨床病料，如：雞、鴨、鵝的臨床病料。

在上述反應(yīng)體系另外一種可能的實(shí)現(xiàn)方式中，當(dāng)樣本取自家禽臨床病料時(shí)，樣本總RNA提取前還包括樣本預(yù)處理的步驟，所述樣本預(yù)處理的方式為：取臟器組織樣本、泄殖腔拭子樣本或口咽拭子樣本，將樣本在滅菌生理鹽水中研磨均勻并混懸，離心取上清。

在上述反應(yīng)體系另外一種可能的實(shí)現(xiàn)方式中，樣本總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的方式為：加入總RNA 4μl和隨機(jī)引物1μl輕輕混勻，70℃水浴5min，冰浴2min，然后依次加入下列成分：5×反應(yīng)緩沖液4μl，dNTP混合物2μl，核酸酶抑制劑1μl，反轉(zhuǎn)錄酶0.5μl和DEPC處理水7.5μl，之后輕輕混勻，在37℃作用1h，得到樣本總RNA對(duì)應(yīng)的cDNA。

本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒的RT-PCR方法，包括如下步驟：

1)樣本總RNA的提?。?/p>

2)對(duì)步驟1)的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到樣本cDNA；

3)利用上游引物5’-GAAGAATGGACTGTCTCACC-3’和下游引物：5’-CGTCTTCATACGARCCTGGC-3’，對(duì)步驟2)所得cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

4)分析步驟3)所得PCR產(chǎn)物，如果擴(kuò)增產(chǎn)物包含474bp的片段，則樣本為網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒檢測(cè)陽性，否則為檢測(cè)陰性。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，根據(jù)電泳結(jié)果確定樣本中能否擴(kuò)增出目的條帶，目的條帶即為474bp。

以NCBI數(shù)據(jù)庫中REV-HLJR0901(GenBank登錄號(hào)為GQ415646)基因組序列作為參考，設(shè)計(jì)和篩選新型引物，上游引物在env基因的5947nt-5966nt之間，下游引物在6401nt-6420nt之間。以該新型引物擴(kuò)增REV的env基因的保守區(qū)序列，長(zhǎng)度約474bp，整體思路為：提取樣本總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(RT)合成cDNA后，利用上述引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，采用下列反應(yīng)程序：預(yù)變性94℃5min，30個(gè)循環(huán)(94℃45s，57℃45s，72℃30s)，最后經(jīng)過72℃10min延伸，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，利用紫外凝膠成像儀檢測(cè)目的條帶，如果擴(kuò)增出目的條帶則證明為REV檢測(cè)陽性，否則為檢測(cè)陰性。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

1)擴(kuò)增的目的片段位于REV的envelope蛋白的高度保守區(qū)，目的片段長(zhǎng)度為474bp，敏感性好、操作方便、對(duì)不同REV分離株均有較好檢出，即通用性好；

2)將REV病毒樣本cDNA進(jìn)行10倍系列稀釋后，發(fā)現(xiàn)10000倍稀釋后利用本方法仍能檢測(cè)到REV特異性條帶，表明使用本申請(qǐng)引物的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系、RT-PCR檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒具有較高的靈敏度；

3)該方法對(duì)其它常見禽病病原，如禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊病毒、禽呼腸孤病毒、禽腺病毒、傳染性喉氣管炎病毒、禽白血病A/B/J亞群、馬立克氏病病毒及禽傳染性貧血病病毒的檢測(cè)結(jié)果皆為陰性，沒有交叉反應(yīng)，表明該方法亦具有良好的特異性；

4)本發(fā)明適用于對(duì)REV進(jìn)行快速檢測(cè)，適合大批量臨床樣本的檢測(cè)與分析。臨床試驗(yàn)證明此方法具有高特異性、高靈敏度、高效率、低成本的特點(diǎn)，可在5h內(nèi)對(duì)臨床病料進(jìn)行快速鑒別診斷，克服了傳統(tǒng)檢測(cè)方法耗時(shí)較長(zhǎng)、操作繁瑣等缺點(diǎn)，為REV的早期快速診斷提供可靠技術(shù)手段。

附圖說明

圖1是對(duì)網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒進(jìn)行檢測(cè)的電泳結(jié)果。點(diǎn)樣順序?yàn)镸：DNA Maker II；P：陽性對(duì)照；N：陰性對(duì)照；1：樣本(2015年河北分離株)；2：樣本(2016年山東分離株)；3：樣本(2015年河北分離株)；4：樣本(2016遼寧分離株)；

圖2是對(duì)該引物檢測(cè)網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒的靈敏度電泳結(jié)果。點(diǎn)樣順序?yàn)镸：DNA maker II；P：陽性對(duì)照；N：陰性對(duì)照；1：cDNA稀釋10倍；2：cDNA稀釋10²倍；3：cDNA稀釋10³倍；4：cDNA稀釋10⁴倍；5：cDNA稀釋10⁵倍；

圖3是對(duì)其它常見禽病病原進(jìn)行檢測(cè)的電泳結(jié)果。其中M：DNA Maker II；P：陽性對(duì)照；N：陰性對(duì)照；1：H5亞型禽流感病毒；2：H7亞型禽流感病毒；3：H9亞型禽流感病毒；4：新城疫病毒(NDV)；5：傳染性支氣管炎病毒(IBV)；6：傳染性法氏囊病毒(IBDV)；7：禽呼腸孤病毒(REOV)；8：禽腺病毒(FAdV)；9：傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)；10：禽白血病A亞群(ALV-A)；11：禽白血病B亞群(ALV-B)；12：禽白血病J亞群(ALV-J)；13：馬立克氏病毒(MDV)；14：禽傳染性貧血病病毒(CAV)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受具體實(shí)施方式的限制。

下列實(shí)施例中常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法，參見Sambrook等編寫的分子克隆。儀器的使用參照儀器操作說明。本申請(qǐng)中實(shí)施例中所使用的各個(gè)毒株和菌株均由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜禽疫病診斷中心保藏和提供。

實(shí)施例1家禽臨床病料樣本的預(yù)處理

1、實(shí)驗(yàn)試劑和主要儀器

主要試劑：滅菌生理鹽水

主要儀器：LEGEND MICRO 17R低溫臺(tái)式離心機(jī)，為Thermo公司產(chǎn)品；VS-1渦旋振蕩器購自鼎昊源科技有限公司；TL-2010S組織研磨震蕩器購自鼎昊源科技有限公司。

2、實(shí)驗(yàn)步驟

(1)組織樣本處理：取100mg臟器組織樣本加入0.5ml滅菌生理鹽水并用研磨器進(jìn)行研磨混懸，組織懸液3000rpm離心30min后取上清用于檢測(cè)。

(2)泄殖腔或口咽拭子樣本處理：將拭子樣本加入0.5ml滅菌生理鹽水并用渦旋振蕩器振蕩混懸，樣本懸液3000rpm離心30min后取上清用于檢測(cè)。

實(shí)施例2樣本總RNA的提取

1、實(shí)驗(yàn)試劑和主要儀器

主要試劑：Trizol RNA提取試劑，為Invitrogen產(chǎn)品，購北京索萊寶科技有限公司；DEPC處理水，購自北京明豪至遠(yuǎn)有限公司；氯仿、異丙醇、無水乙醇和75％乙醇購自北京華美智博科技有限公司；Rnase-free的離心管與槍頭北京購自華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司。

主要儀器：LEGEND MICRO 17R低溫臺(tái)式離心機(jī)，為Thermo公司產(chǎn)品；1300SEVIES A2生物安全柜，為Thermo公司產(chǎn)品。

2、實(shí)驗(yàn)步驟

(1)取實(shí)施例1預(yù)處理所得家禽臨床病料樣本懸液250μl，加入750μl Trizol，加入200μl氯仿，手動(dòng)顛倒混勻30s，室溫靜置5min；

(3)混合液以12000rpm，4℃離心15min，混合液分為三相，即上層水相，中間相和下層有機(jī)相。

(4)吸取上層水相加入另一離心管內(nèi)，加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫放置10min；

(5)混合液13500rpm，4℃離心10min，沉淀RNA；

(6)小心盡棄上清，用DEPC水配制的75％乙醇1ml輕輕漂洗沉淀，輕輕顛倒混勻1次；

(7)將混合液13500rpm，4℃離心5min,棄去上清，再用200μl槍頭吸取剩余液體底層沉淀即為洗凈的RNA；

(8)將RNA沉淀置超凈臺(tái)內(nèi)風(fēng)干，約10min；

(9)用DEPC水處理的滅菌水9μl溶解沉淀，再加入1μl RNasin；

(10)提取的RNA直接用于cDNA的合成或分裝后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例3反轉(zhuǎn)錄生成cDNA

1、實(shí)驗(yàn)試劑和主要儀器

主要試劑：反轉(zhuǎn)錄酶(Reverse Transcriptase)200U/μl(Promega)、核酸酶抑制劑(Rnase Inhibitor)50U/μl(Takara)、5倍體積的反應(yīng)緩沖液(5×Reaction Buffer)、dNTP混合物2.5mM和隨機(jī)引物(Random Primer)500μg/ml(Promega)，購自北京愛普銳晟科技有限公司；DEPC處理水，購自北京明豪至遠(yuǎn)有限公司。

主要儀器：Veriti 96-Well Thermal Cycler PCR擴(kuò)增儀為Applied Biosystems公司產(chǎn)品，購自北京誠茂興業(yè)科技發(fā)展有限公司；MINI-Smart小型臺(tái)式離心機(jī)為HERO公司產(chǎn)品；HW·SYII-KP3型電熱恒溫水槽(北京長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司)。

2、實(shí)驗(yàn)步驟

(1)在0.2ml離心管內(nèi)加入下列成分：

RNA溶液 4μl

隨機(jī)引物 1μl

輕輕混勻，70℃水浴5min，冰浴2min，然后依次加入下列成分：

輕輕混勻，37℃作用1h，得到樣本cDNA。

實(shí)施例4目的片段的PCR擴(kuò)增

1、實(shí)驗(yàn)試劑和主要儀器

主要試劑：cDNA溶液；2×Taq PCR master mix，購自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司；dd H2O；特異性引物(上游引物5’-GAAGAATGGACTGTCTCACC-3’和下游引物：5’-CGTCTTCATACGARCCTGGC-3’。)；Marker II DNA Ladder購自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司。

主要儀器：Veriti 96-Well Thermal Cycler PCR擴(kuò)增儀為Applied Biosystems公司產(chǎn)品，購自北京誠茂興業(yè)科技發(fā)展有限公司；MINI-Smart小型臺(tái)式離心機(jī)為HERO公司產(chǎn)品；DYY-8C電泳儀購自北京市六一儀器廠；α凝膠成像儀購自鼎昊源科技有限公司。

2、實(shí)驗(yàn)步驟

在0.2ml離心管中加入下列成分：

輕輕混勻后，進(jìn)行如下反應(yīng)：94℃預(yù)變性5min；94℃45s，57℃45s，72℃30s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束72℃延伸10min。

PCR反應(yīng)結(jié)束后，用1×TAE電泳緩沖液制備1％瓊脂糖凝膠并按照參考比例混入熒光染料Gelsafe。取7μl PCR產(chǎn)物加入凝膠孔中，選擇合適的電壓(4V/cm-10V/cm)進(jìn)行電泳，電泳時(shí)間為20-30min，電泳結(jié)束后將凝膠塊置于凝膠成像儀上觀察并拍照，根據(jù)電泳結(jié)果確定樣本中能否擴(kuò)增出目的條帶，如果擴(kuò)增出目的條帶則證明為REV檢測(cè)陽性，否則為檢測(cè)陰性。

利用上述方法分別對(duì)分離自不同地點(diǎn)和時(shí)間的REV進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均有較好的檢出，電泳結(jié)果如圖1所示，表明本方法具有良好的通用性。

實(shí)施例5敏感性檢測(cè)

1、實(shí)驗(yàn)試劑和主要儀器

主要試劑：cDNA溶液；2×Taq PCR master mix，購自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司；dd H2O；特異性引物(上游引物5’-GAAGAATGGACTGTCTCACC-3’和下游引物：5’-CGTCTTCATACGARCCTGGC-3’)；Marker II DNA Ladder購自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司。

主要儀器：Veriti 96-Well Thermal Cycler PCR擴(kuò)增儀為Applied Biosystems公司產(chǎn)品，購自北京誠茂興業(yè)科技發(fā)展有限公司；MINI-Smart小型臺(tái)式離心機(jī)為HERO公司產(chǎn)品；DYY-8C電泳儀購自北京市六一儀器廠；α凝膠成像儀購自鼎昊源科技有限公司。

2、實(shí)驗(yàn)步驟

將cDNA溶液進(jìn)行10倍系列稀釋，稀釋度為10、10²、10³、10⁴和10⁵倍，分別以稀釋后的模板按如下體系進(jìn)行PCR反應(yīng)。

在0.2ml離心管中加入下列成分：

輕輕混勻后，進(jìn)行如下反應(yīng)：94℃預(yù)變性5min；94℃45s，57℃45s，72℃30s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束72℃延伸10min。

PCR反應(yīng)結(jié)束后，用1×TAE電泳緩沖液制備1％瓊脂糖凝膠并按照參考比例混入熒光染料Gelsafe。取7μl PCR產(chǎn)物加入凝膠孔中，選擇合適的電壓(4V/cm-10V/cm)進(jìn)行電泳，電泳時(shí)間為25-35min，電泳結(jié)束后將凝膠塊置于凝膠成像儀上觀察并拍照，根據(jù)電泳結(jié)果確定樣本中能否擴(kuò)增出目的條帶，如果擴(kuò)增出目的條帶則證明為REV檢測(cè)陽性，否則為陰性。

利用上述方法對(duì)REV進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)反轉(zhuǎn)錄的REV cDNA稀釋10⁴后，仍能檢測(cè)到病毒cDNA，如圖2所示，表明本方法具有良好的敏感性。

實(shí)施例6特異性檢測(cè)

1、實(shí)驗(yàn)試劑和主要儀器

主要試劑：cDNA溶液；2×Taq PCR master mix，購自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司；dd H2O；特異性引物(上游引物5’-GAAGAATGGACTGTCTCACC-3’和下游引物：5’-CGTCTTCATACGARCCTGGC-3’)；Marker II DNA Ladder購自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司。

主要儀器：Veriti 96-Well Thermal Cycler PCR擴(kuò)增儀為Applied Biosystems公司產(chǎn)品，購自北京誠茂興業(yè)科技發(fā)展有限公司；MINI-Smart型臺(tái)式離心機(jī)為HERO公司產(chǎn)品；DYY-8C電泳儀購自北京市六一儀器廠；α凝膠成像儀購自鼎昊源科技有限公司。

2、實(shí)驗(yàn)步驟

在0.2ml離心管中加入下列成分：

輕輕混勻后，進(jìn)行如下反應(yīng)：94℃預(yù)變性5min；94℃45s，57℃45s，72℃30s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束72℃延伸10min。

PCR反應(yīng)結(jié)束后，用1×TAE電泳緩沖液制備1％瓊脂糖凝膠并按照參考比例混入熒光染料Gelsafe。取7μl PCR產(chǎn)物加入凝膠孔中，選擇合適的電壓(4V/cm-10V/cm)進(jìn)行電泳，電泳時(shí)間為25-35min，電泳結(jié)束后將凝膠塊置于凝膠成像儀上觀察并拍照，根據(jù)電泳結(jié)果確定樣本中能否擴(kuò)增出目的條帶，如果擴(kuò)增出目的條帶則證明為REV檢測(cè)陽性，否則為陰性。

利用上述方法對(duì)其它常見的禽病病原，如禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊病毒、禽呼腸孤病毒、禽腺病毒、傳染性喉氣管炎病毒、禽白血病A/B/J亞群、馬立克氏病病毒及禽傳染性貧血病病毒進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果如圖3所示，結(jié)果皆為陰性，表明本方法具有良好的特異性。

實(shí)施例7對(duì)臨床樣本的檢測(cè)

表1RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)臨床病料檢測(cè)的應(yīng)用

由表1可以看出，本申請(qǐng)建立網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒的PCR方法與病毒分離結(jié)果或測(cè)序結(jié)果均符合，準(zhǔn)確性高，同時(shí)對(duì)來自不同采樣時(shí)間和地點(diǎn)的病料樣本均適用。

前述對(duì)本發(fā)明的具體示例性實(shí)施方案的描述是為了說明和例證的目的。這些描述并非想將本發(fā)明限定為所公開的精確形式，并且很顯然，根據(jù)上述教導(dǎo)，可以進(jìn)行很多改變和變化。對(duì)示例性實(shí)施例進(jìn)行選擇和描述的目的在于解釋本發(fā)明的特定原理及其實(shí)際應(yīng)用，從而使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)并利用本發(fā)明的各種不同的示例性實(shí)施方案以及各種不同的選擇和改變。本發(fā)明的范圍意在由權(quán)利要求書及其等同形式所限定。