識別和測量網狀細胞的制作方法
【專利摘要】識別沉積在襯底上的血液樣品中的網狀細胞的方法和系統(tǒng)包括：在兩個不同波長上用入射光照射樣品，獲取與第一個波長相對應的樣品的二維圖像，以及獲取與第二個波長相對應的樣品的二維圖像；分析圖像以識別一組代表性紅血細胞；確定該組中的每個紅血細胞的面積；確定該組中的每個紅血細胞的色值；以及對于該組中的每個紅血細胞，如果紅血細胞的面積超過面積截止值以及紅血細胞的色值小于顏色截止值，則將該紅血細胞識別成網狀細胞。
【專利說明】識別和測量網狀細胞
[0001]交叉引用相關申請
[0002]本申請要求如下美國臨時專利申請基于35U.S.C.§ 119(e)的優(yōu)先權:2011年7月22日提交的第61/510，614號；以及2011年7月22日提交的第61/510，710號。在此通過引用并入前述申請每一個的全部內容。
【技術領域】
[0003]本公開涉及識別、計數和測量包括血液的生物樣品以及指定成模擬血液的質量控制復合物中的網狀細胞的性質。
【背景技術】
[0004]網狀細胞是與成熟紅血細胞相比通常通過水平升高的RNA (核糖核酸)表征的未成熟紅血細胞。對血液樣品進行的網狀細胞計數可以提供有關患者的骨髓正在多快地產生紅血細胞的重要信息。因此，患者的血液中網狀細胞的數量用作重要診斷指標，通常是全血計數的一個參數。例如，高網狀細胞計數可以表示可能內部創(chuàng)傷、失血、或某些類型的貧血。低網狀細胞計數可能表示某種營養(yǎng)素缺乏(例如，鐵不足)或像癌癥那樣影響骨髓的疾病。本文所公開的是自動測量細胞樣品，包括識別，定量和成分測量包括血液的生物樣品以及指定成模擬血液的質量控制復合物中的網狀細胞的方法和系統(tǒng)。

【發(fā)明內容】

[0005]本文公開的方法和系統(tǒng)允許使用光譜成像自動識別和定量血液樣品中的網狀細胞。這種識別和定量基于一個或多個細胞的圖像，該圖像在不同光波長上獲得。尤其，公開的方法和系統(tǒng)可以用于識別和測量從患者身上抽取的血液樣品中的網狀細胞的性質。該性質可以包括與網狀細胞的形狀和外觀有關的`多種參數，包括面積、周長、圓形度、光密度、和在不同波長的譜性質?？梢杂羞x擇地向技術人員顯示網狀細胞(例如，強調成與成熟紅血細胞區(qū)分開)。也可以向技術人員顯示從網狀細胞中獲取的診斷信息以便作進一步考慮(例如，確定患者可能正遇到的狀況，以及選擇適當的治療過程)和/或可以將其傳送給其它自動設備，存儲在電子病歷中，以及發(fā)送給其它健康護理專家。
[0006]總的來說，在第一方面，本公開的特征是識別沉積在襯底上的血液樣品中的網狀細胞的方法，該方法包括:用在兩個不同波長上的入射光照射樣品，獲取與第一個波長相對應的樣品的二維圖像，以及獲取與第二個波長相對應的樣品的二維圖像；分析圖像以識別一組代表性紅血細胞；確定該組中的每個紅血細胞的面積；確定該組中的每個紅血細胞的色值；以及對于該組中的每個紅血細胞，如果紅血細胞的面積超過面積截止值以及紅血細胞的色值小于顏色截止值，則將該紅血細胞識別成網狀細胞，其中每個紅血細胞的色值包括紅血細胞在兩個照射波長上的光密度值之間的差值。
[0007]該方法的實施例可以包括本文公開的特征的任何一個或多個。
[0008]波長之一可以在400nm (納米)與457nm之間，另一個波長可以在575nm與600nm之間。
[0009]確定每個所識別紅血細胞的色值可以包括，對于每個紅血細胞:確定與該細胞相聯系的一組像素；對于該組像素的每一個，確定與第一波長相對應的光密度；對于該組像素的每一個，確定與第二波長相對應的光密度；對于該組像素，確定與第一波長相對應的平均光密度；對于該組像素，確定與第二波長相對應的平均光密度；以及計算平均光密度之間的差值以確定該細胞的色值。
[0010]確定該組中的每個紅血細胞的面積可以包括，對于每個紅血細胞，確定與該細胞相聯系的一組像素，以及通過計數該組中的像素的數量確定該細胞的面積。確定該組中的每個紅血細胞的面積可以包括，對于每個紅血細胞，確定與該細胞相聯系的一組像素，確定圍繞該組像素的多邊形，以及通過計算多邊形的面積確定該細胞的面積。
[0011]該顏色截止值可以基于紅血細胞的色值分布的百分位。該百分位可以對應于紅血細胞的色值分布內的70%。該顏色截止值可以對應于百分位與顏色偏移值之和。該方法可以包括根據已知網狀細胞的數量的一組訓練數據確定百分位和顏色偏移值。該面積截止值可以基于紅血細胞的面積分布的百分位。該百分位可以對應于紅血細胞的面積分布的20%。該面積截止值可以對應于百分位與面積偏移值之和。該方法可以包括根據已知網狀細胞的數量的一組訓練數據確定百分位和面積偏移值。
[0012]該方法可以包括如果與紅血細胞相聯系的像素在兩個波長之一上的光密度的標準偏差大于截止值，則從該代表組中排除該紅血細胞。該方法可以包括如果與紅血細胞相聯系的像素在不同于該兩個波長的波長上的光密度的標準偏差大于截止值，則從該代表組中排除該紅血細胞。
[0013]該方法可以包括，對于識別為網狀細胞的每個紅血細胞，確定網狀細胞的體積。該方法可以包括根據與多個照射波長相對應的網狀細胞的綜合光密度確定網狀細胞的體積。該方法可以包括為樣品確定平均網狀細胞體積參數。
[0014]該方法可以包括，對于識別為網狀細胞的每個紅血細胞，確定網狀細胞的血紅蛋白含量。該方法可以包括根據網狀細胞的面積、與多個照射波長相對應的網狀細胞的體積、和與多個照射波長相對應的網狀細胞的綜合光密度的加權組合確定網狀細胞的血紅蛋白含量。該方法可以包括為樣品確定平均網狀細胞血紅蛋白值。
[0015]該方法的實施例還可以酌情地以任何組合包括本文公開的其它特征或步驟的任何一個。
[0016]在另一個方面，本公開的特征是識別沉積在襯底上的血液樣品中的網狀細胞的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括光源，配置成用在兩個不同波長上的入射光照射樣品；檢測器，配置成獲取與第一個波長相對應的樣品的二維圖像和獲取與第二個波長相對應的樣品的二維圖像；以及電子處理器，配置成分析圖像以識別一組代表性紅血細胞；確定該組中的每個紅血細胞的面積；確定該組中的每個紅血細胞的色值；以及對于該組中的每個紅血細胞，如果紅血細胞的面積超過面積截止值以及紅血細胞的色值小于顏色截止值，則將該紅血細胞識別成網狀細胞，其中該電子處理器被配置成根據紅血細胞在兩個照射波長上的光密度值之間的差值確定每個紅血細胞的色值。
[0017]該系統(tǒng)的實施例可以包括如下特征的任何一個或多個。
[0018]第一波長可以在400nm與457nm之間，第二波長可以在575nm與600nm之間。[0019]對于每個紅血細胞，該電子處理器可以配置成通過如下步驟確定該細胞的色值:確定與該細胞相聯系的一組像素；對于該組像素的每一個，確定與第一波長相對應的光密度；對于該組像素的每一個，確定與第二波長相對應的光密度；對于該組像素，確定與第一波長相對應的平均光密度；對于該組像素，確定與第二波長相對應的平均光密度；以及計算平均光密度之間的差值以確定該細胞的色值。
[0020]對于該組中的每個紅血細胞，該電子處理器可以配置成通過如下步驟確定該細胞的面積:確定與該細胞相聯系的一組像素，以及通過計數該組中的像素的數量確定該細胞的面積。對于每個紅血細胞，該電子處理器可以配置成通過如下步驟確定該細胞的面積:確定與該細胞相聯系的一組像素，確定圍繞該組像素的多邊形，以及通過計算多邊形的面積確定該細胞的面積。
[0021]該電子處理器可以配置成根據紅血細胞的色值分布的百分位確定顏色截止值。該百分位可以對應于紅血細胞的色值分布內的70%。該電子處理器可以配置成將該顏色截止值確定為百分位與顏色偏移值之和。該電子處理器可以配置成根據已知網狀細胞的數量的一組訓練數據確定百分位和顏色偏移值。該電子處理器可以配置成根據紅血細胞的面積分布的百分位確定面積截止值。該百分位可以對應于紅血細胞的面積分布的20%。該電子處理器可以配置成將該面積截止值確定為百分位與面積偏移值之和。該電子處理器可以配置成根據已知網狀細胞的數量的一組訓練數據確定百分位和面積偏移值。
[0022]該電子處理器可以配置成如果與紅血細胞相聯系的像素在兩個波長之一上的光密度的標準偏差大于截止值，則從該代表組中排除該紅血細胞。該電子處理器可以配置成如果與紅血細胞相聯系的像素在不同于該兩個波長的波長上的光密度的標準偏差大于截止值，則從該代表組中排除該紅血細胞。
[0023]對于識別為網狀細胞的每個紅血細胞，該電子處理器可以配置成確定網狀細胞的體積。該電子處理器可以配置成根據與多個照射波長相對應的網狀細胞的綜合光密度確定網狀細胞的體積。該電子處理器可以配置成為樣品確定平均網狀細胞體積參數。
[0024]對于識別為網狀細胞的每個紅血細胞，該電子處理器可以配置成確定網狀細胞的血紅蛋白含量。該電子處理器可以配置成根據網狀細胞的面積、與多個照射波長相對應的網狀細胞的體積、和與多個照射波長相對應的網狀細胞的綜合光密度的加權組合確定網狀細胞的血紅蛋白含量。該電子處理器可以配置成為樣品確定平均網狀細胞血紅蛋白值。
[0025]該系統(tǒng)的實施例還可以酌情地以任何組合包括本文公開的其它特征或步驟的任何一個。
[0026]除非另有定義，本文使用的所有科學和技術術語都具有與本公開所屬的領域的普通技術人員通常所理解相同的含義。盡管與本文所述的那些相似或等效的方法和材料可以用在本發(fā)明的實踐或測試中，但下面將描述適當方法和材料。本文提及的所有公告、專利申請、專利和其它參考文獻通過引用全文并入。在發(fā)生沖突的情況下，將以本說明書為準，包括定義。另外，材料、方法和例子都只是例示性的而無意成為限制。
[0027]在附圖和下面的描述中展示了一個或多個實施例的細節(jié)。其它特征和優(yōu)點將從該描述、附圖和權利要求書中明顯看出。
【專利附圖】

【附圖說明】[0028]圖1是識別，定量和測量生物樣品中的網狀細胞的特征的系統(tǒng)的示意圖；
[0029]圖2是示出識別樣品中的網狀細胞的一系列步驟的流程圖；
[0030]圖3A是示出用于樣品中的紅血細胞當中的網狀細胞識別的顏色截止值的曲線圖；
[0031 ]圖3B是示出用于樣品中的紅血細胞當中的網狀細胞識別的面積截止值的曲線圖；
[0032]圖4是示出從樣品的一個或多個圖像中選擇一組代表性紅血細胞的一系列步驟的不意圖；
[0033]圖5是示出細胞邊界的細胞的示意圖；
[0034]圖6是示出兩個細胞和針對每個細胞確定的凸包的示意圖；
[0035]圖7是示出細胞像素當中光密度的變化的細胞的示意圖；
[0036]圖8是自動樣品處理系統(tǒng)的不意圖；以及
[0037]圖9是測量網狀細胞的體積、成分和其它特征的計算系統(tǒng)的示意圖。
[0038]在各種圖形中的相同標號都指相同元件。
【具體實施方式】
[0039]網狀細胞是與成熟紅血細胞相比通常通過水平升高的RNA表征的未成熟紅血細胞。對血液樣品進行的網狀細胞計數可以提供有關患者的骨髓正在多快地產生紅血細胞的重要信息。因此，患者的血液中網狀細胞的數量用作重要診斷指標，通常是全血計數的一個參數。例如，高網狀細胞計數可以表示可能內部創(chuàng)傷、失血、或某些類型的貧血。低網狀細胞計數可能表示某種營養(yǎng)素缺乏(例如，鐵不足)或像癌癥那樣影響骨髓的疾病。本文所公開的是自動測量細胞樣品，包括識別，定量和成分測量樣品中的網狀細胞的方法和系統(tǒng)。尤其，本文公開的方法和系統(tǒng)可以用于測量樣品和以自動方式識別旨在用在自動實驗室分析儀上的質量控制復合物中或包括從動物身上提取的樣品的多種不同其它樣品中的網狀細胞。本文公開的方法和系統(tǒng)允許高吞吐量，完全自動地分析從患者身上抽取的多種生物樣品，而無需專門為網狀細胞識別而設計的特殊染色劑或其它造影劑。
[0040]下面更詳細地描述為分析制備樣品的自動系統(tǒng)。一旦制備好樣品，就將它輸送給自動測量系統(tǒng)。該測量系統(tǒng)獲取樣品中的細胞的一個或多個二維圖像，并使用圖像來識別紅血細胞當中的網狀細胞和圖像中血液的其它形成元素，以及在一些實施例中，測量像網狀細胞體積、面積、周長、光密度、和/或所識別網狀細胞中的一種或多種成分(例如，血紅蛋白)的數量那樣，與所識別網狀細胞有關的量值。這些量值從源自網狀細胞的圖像的信息中確定，網狀細胞的圖像通過將入射光引到網狀細胞上，然后檢測入射光透過網狀細胞或從網狀細胞反射的部分獲得。每個圖像都是二維圖像，其中圖像內的各個像素強度值對應于出自網狀細胞上與像素相對應的空間地點的透射或反射光的數量。
[0041]一般性考慮
[0042]網狀細胞通常包括以比包括成熟紅血細胞的其它類型細胞大的濃度存在于網狀細胞中的核糖體RNA的網絡。當將像天藍B和亞甲基藍那樣的某些染色劑施加于網狀細胞時，該染色劑與RNA結合。在顯微鏡下檢查時，可容易看見染色RNA，而網狀細胞表現得稍偏藍一點，并大于成熟紅血細胞。染色RNA的數量是可以用于將網狀細胞與其它細胞類型區(qū)分開的一條準則。
[0043]自動樣品制備系統(tǒng)可以將多種不同染色劑施加于血液樣品。雖然識別網狀細胞的某些傳統(tǒng)技術依靠專用于結合細胞RNA的染色劑或專門打算用于網狀細胞的其它機制，但本文公開的方法和系統(tǒng)有利地依靠包括羅曼諾夫斯基(Romanowsky)染色劑在內的能夠自動檢測和測量全血計數的所有其它參數的染色劑。因此，可以將以細胞RNA和DNA兩者為目標的染色劑施加于網狀細胞，由于上述的核糖體RNA的染色網絡，可以將網狀細胞與其它細胞類型區(qū)分開。更一般地說，包括紅血細胞(例如，成熟紅細胞、網狀細胞)的細胞通常將一種或多種染色劑施加于血液樣品來制備(作為血液樣品的一部分)。染色劑與細胞質結合，用作細胞圖像中的細胞質的標記。當將入射光照射在細胞上時，染色劑吸收入射光的一部分；樣品中的特定地點上的吸收量取決于存在于那個地點中的染色劑的數量。
[0044]除了識別網狀細胞之外，本文公開的方法和系統(tǒng)可以用于確定所識別網狀細胞的各種性質。例如，通過將細胞厚度的估計值與細胞成分(例如，血紅蛋白)和各種施加染色劑的局部變化濃度的吸收效應解耦，可以根據源自二維網狀細胞圖像的信息確定網狀細胞體積。為了實現這樣的解耦，按照每個細胞的最大像素強度縮放像素強度。如下面進一步所述，網狀細胞體積計算可以基于用于獲取網狀細胞圖像的照射光的每種顏色的光密度值與網狀細胞面積的加權組合?？梢葬槍轶w積測量選擇的一組網狀細胞的每個成員重復本文所述的過程，將結果用于計算樣品的平均網狀細胞體積。如下面進一步所述，像網狀細胞的血紅蛋白含量那樣網狀細胞成分的數量也可以從基于用于獲取網狀細胞圖像的照射光的每種顏色的光密度值的計算中確定。
[0045]為了如下討論的目的，假設將至少兩種染色劑施加于樣品:曙紅色和天藍色。但是，本文公開的方法和系統(tǒng)不局限于只施加兩種染色劑或只有曙紅色和天藍色。相反，該方法和系統(tǒng)能夠對施加了更少種染色劑(例如，一種染色劑)或更多種染色劑(例如，包含曙紅色的紅色染色劑和包含天藍色和亞甲基藍的染色劑，三種或更多種染色劑、四種或更多種染色劑、五種或更多種染色劑)的樣品進行測量。
[0046]圖1示出了對血液樣品中的網狀細胞進行自動識別和測量的系統(tǒng)100 (可以是較大樣品處理和分析系統(tǒng)的一部分)的示意圖。子系統(tǒng)100包括照射源102、檢測器106、和電子控制系統(tǒng)108。電子控制系統(tǒng)108可以包括顯示器110、人機界面單元112、和電子處理器114。電子控制系統(tǒng)108分別經由控制線120和122與照射源100和檢測器106連接。
[0047]假設已經為分析制備好樣品(如下面進一步所討論)，制備好樣品104 (例如，沉積在顯微鏡載玻片上，隨后固定，染色，清洗和干燥的血液樣品)被自動放置在源102的附近。源102把入射光116引向樣品104。入射光的一部分通過樣品104成為透射光118,被檢測器106檢測。透射光118在檢測器106的有效表面上形成樣品104的圖像；檢測器106捕獲該圖像，然后將圖像信息發(fā)送給電子控制系統(tǒng)108。一般說來，電子控制系統(tǒng)108指示源102產生入射光116，以及指示檢測器106檢測樣品104的圖像。當檢測器106從透射光118中獲取樣品104的圖像時，控制系統(tǒng)108可以指令源102使用不同照射波長。
[0048]如果需要的話，可以對樣品104的多個圖像重復上面討論的過程。在獲取新圖像之前，電子控制系統(tǒng)108可以調整源102產生的入射光116的波長。這樣，樣品104的每個圖像可以對應于入射光116的不同波長，因此對應于透射光118的不同波長。重復該過程直到至少獲得足夠的信息來進行包括網狀細胞候選者的紅血細胞的精確識別和/或確定與所識別紅血細胞和/或網狀細胞相聯系的性質。
[0049]通常，產生精確識別和/或定量網狀細胞的信息量在校準過程期間確定。例如，校準過程可以用于確定當獲得的樣品圖像的數量大于等于成為分析樣品的因素的譜貢獻者(例如，吸收者)的數量時，可以實現精確的網狀細胞識別和定量。作為一個例子，對于包含包括作為天然存在吸收者的網狀細胞、和作為施加染色劑的曙紅色和天藍色的紅血細胞的制備好樣品(對于總共三種譜貢獻者)，系統(tǒng)100可以繼續(xù)獲取樣品圖像直到在最少三種不同波長上獲得圖像。在網狀細胞識別和定量中也可以獲得和使用與進一步不同波長相對應的另外圖像。
[0050]照射源102可以包括一個源或多個相同或不同源，以便將入射光引到樣品上。在一些實施例中，源102可以包括像如下那樣的多個發(fā)光元件:二極管(LED)、激光二極管、熒光燈、白熾燈和/或閃光燈。例如，源102可以包括分別具有在電磁譜的紅色、黃色、綠色和藍色區(qū)域中的輸出波長(例如，635、598、525和415nm)，或更一般地說，大約620到750nm(紅色)、大約575到600nm (黃色)、大約525到570nm (綠色)、和大約400到475nm (藍色)的四個LED。在某些實施例中，源102可以包括一個或多個激光源。取代擁有多個發(fā)光源，在其它實施例中，源102可以包括可以配置成變更其輸出波長(例如，在電子控制系統(tǒng)108的控制下)的單個寬帶發(fā)光源。例如，源102可以包括與在系統(tǒng)108的控制下產生可變輸出譜的可配置濾波系統(tǒng)(例如，多個可機械調整濾波器、和/或基于液晶的可電子調整濾波器)耦合的寬帶源(例如，白熾燈)。一般說來，源102不在單個波長上，而是在圍繞中心波長(例如，波段中的最大強度的波長)的一個波段上輸出照射光116。當本文的討論提及照射光116的波長時，這種提及指的是照射波段的中心波長。
[0051]檢測器106可以包括多種不同類型的檢測器。在一些實施例中，檢測器106包括電荷耦合器件(CXD)。在某些實施例中，檢測器106可以包括光電二極管(例如，二維光電二極管陣列)。在一些實施例中，檢測器106可以包括像基于CMOS的傳感器和/或光電倍增器那樣的其它光敏元件。如上面結合源102所述，檢測器106還可以包括一個或多個濾波元件。在一些實施例中，與不同波形相對應的樣品圖像通過如下步驟獲得:將具有相對較寬分布的波長的照射光116照射在樣品104上，然后濾波透射光118以便只選擇透射光與小波段的波長相對應的部分。濾波可以在激發(fā)側(例如，在源102中)和檢測側(例如，在檢測器106中)之一或兩者上進行，以保證使用檢測器106獲得的圖像的每一個與具有特定中心波長的光波長的特定分布相對應。
[0052]一般性網狀細胞識別方法
[0053]本文公開的系統(tǒng)和方法獲取樣品(例如，沉積在顯微鏡載玻片上，隨后利用固定劑和染色劑為自動顯微鏡成像制備的血液樣品)中的細胞的圖像，并從細胞圖像當中識別和定量網狀細胞。圖2示出了包括在這樣的圖像中的識別網狀細胞的各種步驟的流程圖200。在第一步驟202中，從一個或多個所獲樣品圖像中的所有白血細胞、紅血細胞、血小板、和細胞和非細胞假像當中識別一組代表性紅血細胞。在下一個步驟204中，在該組代表性紅血細胞當中識別網狀細胞。然后，在可選步驟206中，可以根據在步驟204中定位的網狀細胞確定像網狀細胞體積、像血紅蛋白那樣的網狀細胞成分的數量、和網狀細胞幾何參數那樣的網狀細胞特征和度量。該過程終止在步驟208上。下面更詳細地描述流程圖200中的每個步驟。[0054](i)網狀細朐識別
[0055]如上所討論，在血液樣品中識別網狀細胞的第一步驟是在一個或多個所獲樣品圖像中的所有白血細胞、紅血細胞、血小板、和細胞和非細胞假像當中識別一組代表性紅血細胞(其中的網狀細胞形成一個子集)。這個過程將在副標題“(ii)識別一組代表性紅血細胞”下作更詳細討論，并且可以包括從包含紅血細胞、白血細胞、和血小板的樣品的圖像中識別紅血細胞的一種或多種特征測量和假像排除技術。在識別出該組代表性紅血細胞之后，通過進一步分析該組紅血細胞的每個成員在代表性紅血細胞當中識別網狀細胞。因為網狀細胞是非成熟紅血細胞，所以將樣品中的紅血細胞與其它類型的細胞(例如，白血細胞、血小板)區(qū)分開的方法可以將網狀細胞和成熟紅血細胞兩者一起識別成該組代表性紅血細胞。定位網狀細胞牽涉到在該代表組中區(qū)分網狀細胞和其它更成熟紅血細胞。
[0056]在一些實施例中，可以根據它們的吸收譜，有時借助于著色劑或染色劑(例如，使用公開在如下參考文獻中的固定劑、染色劑、和清洗劑的組合:2012年6月18日提交的美國專利申請第13/526，164號，在此通過引用并入其全部內容)，在該代表組中定位網狀細胞。例如，因為網狀細胞包含核糖體RNA的網絡，所以與核酸結合的染色劑可以用于識別網狀細胞，因為RNA —般以升高的濃度存在于網狀細胞之中。
[0057]在該組代表性紅血細胞當中識別網狀細胞可以根據該組中的各個細胞的光密度從在電磁譜的一個或多個波長區(qū)域中獲得的圖像中確定。例如，在一些實施例中，可以通過檢查在光譜的黃色區(qū)域中獲得的樣品圖像中的每個代表性紅血細胞的光密度定位網狀細胞。網狀細胞在黃色區(qū)域中通常具有比成熟紅血細胞強的吸收，因為施加于紅血細胞的核酸染色劑在光譜的黃色區(qū)域中具有吸收峰。例如，羅曼諾夫斯基染色劑往往被用于標記樣品中的紅血細胞(包括網狀細胞)的RNA。
[0058]在某些實施例中，可以通過檢查在光譜的藍色區(qū)域中獲得的樣品圖像中的每個代表性紅血細胞的光密度定位網狀細胞。通常，為了標識網狀細胞的目的，光譜的藍色區(qū)域從400nm到470nm。網狀細胞在藍色區(qū)域中一般具有比成熟紅血細胞弱的吸收，因為網狀細胞中的血紅蛋白還未完全形成。通過將每個代表性紅血細胞在藍色區(qū)域中的綜合光密度與已知與網狀細胞有關(例如，根據標準化樣品的流式細胞儀分析)的光密度值的范圍相比較，可以將每個代表性紅血細胞分類成網狀細胞或成熟紅血細胞。
[0059]在某些實施例中，可以使用多個光譜區(qū)域中的紅血細胞的光密度來識別網狀細胞。例如，可以通過比較分別在光譜的藍色和黃色區(qū)域中獲得的圖像中的每個代表性紅血細胞的光密度(例如，源自利用藍色和黃色照射波長獲得的細胞的圖像)識別網狀細胞。網狀細胞識別可以借助于用于排除成像假像的統(tǒng)計分析。
[0060]確定特定代表性紅血細胞是否是網狀細胞的第一步驟是確定細胞的顏色(C)。例如，可以將細胞的顏色定義成:
[0061 ] C=ODmean(b) - ODmean(y)(O
[0062]其中0Dm_(b)是使用光譜的藍色區(qū)域中的照射波長的與紅血細胞相對應的整個像素組的平均光密度，以及0Dm_(y)是使用光譜的黃色區(qū)域中的照射波長的與紅血細胞相對應的整個像素組的平均光密度。確定與紅血細胞相對應的像素組在在樣品圖像中分別識別紅血細胞時進行，將在后面加以討論。
[0063]確定特定代表性紅血細胞是否是網狀細胞的第二步驟是根據與紅血細胞相對應的像素組確定細胞的面積(A)。如下面進一步討論，可以以多種方式確定基于一組像素的細胞面積。在一些實施例中，在識別該組像素時自動確定細胞面積。
[0064]然后可以將細胞的顏色C和面積A用于通過根據整個代表性紅血細胞群落當中這些參數的數值的統(tǒng)計分布將這些參數的數值與截止值相比較確定該細胞是否是網狀細胞。如果下式成立，則可以將特定細胞識別網狀細胞:
[0065]C〈Ccut 以及 A>Acut(2)
[0066]其中Ceut是顏色截止值，以及Aeut是面積截止值。顏色和面積截止值兩者通常對應于代表性紅血細胞當中顏色和面積的分布內的特定百分位標記。因為網狀細胞在光譜的藍色區(qū)域中一般沒有成熟紅血細胞那么強地吸收，所以顏色C小于顏色截止值Crat的細胞有可能是網狀細胞。此外，因為網狀細胞大于成熟紅血細胞，所以面積A大于面積截止值Arat的細胞有可能是網狀細胞。通過只將滿足兩個條件的細胞識別成網狀細胞，可以高精度地在較大代表性紅血細胞組內定位網狀細胞。
[0067]在一些實施例中，可以只使用方程(2)中的條件之一來識別網狀細胞。例如，可以將色值小于顏色截止值的細胞識別成網狀細胞(即，(XCrat),而不考慮細胞的面積。作為另一個例子，可以將面積大于面積截止值的細胞識別成網狀細胞(即，Α>Α_)，而不考慮細胞的色值。
[0068]如上所討論，顏色和面積截止值通常對應于代表性紅血細胞當中顏色和面積的分布內的特定百分位。通過使用百分位(例如，而不是絕對值)，本文公開的方法可以用在染色方案變化的樣品中和/或用在細胞大小從預期細胞大小開始自然變化(例如，如在細胞大小通常隨患者而變中看到)的樣品中。例如，該方法可以用于在平均而言比來自其他患者的紅血細胞大的一組代表 性當中定位網狀細胞。
[0069]在一些實施例中，使用偏移值調整分布百分位以得出顏色和面積截止值。例如，可以將顏色和面積截止值表達成:
[0070]Ccut=C%+Coffset(3)
[0071]Acut=A%+Aoffset(4)
[0072]其中Cst和Ast分別是顏色和面積百分位，以及Ctjffsrt和Atxffsrt分別是顏色和面積偏移值。圖3A是示出用于在該組代表性紅血細胞中定位網狀細胞的顏色截止值Crat的直方圖。在圖3A中，示出了所有代表性紅血細胞當中顏色參數C的數值的分布390。在該分布內還示出了顏色百分位標記Q。因為網狀細胞具有通常小于成熟紅血細胞的色值，所以顏色偏移值Ctjffsrt是負值，得出小于顏色百分位標記的顏色截止值(；ut。該分布的陰影區(qū)392對應于根據顏色截止值識別為網狀細胞的紅血細胞。
[0073]圖3B是示出用于在該組代表性紅血細胞中定位網狀細胞的面積截止值Aeut的直方圖。在圖3B中，示出了所有代表性紅血細胞當中面積的分布395。在該分布內還示出了面積百分位標記Ap因為網狀細胞具有通常大于成熟紅血細胞的面積，所以面積偏移值Atjffsrt是正值，得出大于面積百分位標記的面積截止值Aeut。該分布的陰影區(qū)397對應于根據面積截止值識別為網狀細胞的紅血細胞。
[0074]顏色和面積百分位和偏移的特定值可以通過分析訓練數據組來確定，該訓練數據組包含成熟紅血細胞和網狀細胞群落已知的樣品。該訓練數據組通常包括數百個或數千個樣品；可以由實驗室技術人員人工地或使用適當校準流式細胞儀系統(tǒng)在這些樣品中測量成熟紅血細胞和網狀細胞群落。然后，使用本文公開的方法和系統(tǒng)分析該訓練組，將百分位和偏移值選擇成使實驗分析結果與來自訓練數據組的已知測量值最佳地匹配。
[0075]作為一個例子，在一些實施例中，顏色百分位標記是70%，顏色偏移值是-0.09。更一般地說,顏色百分位標記是80%或更小(例如，60%或更小，50%或更小，40%或更小)。通常，但并不總是，如果顏色百分位標記小于70%，則顏色偏移值大于-0.09。
[0076]作為另一個例子,在一些實施例中，顏色百分位標記是20%，顏色偏移值是12.4。更一般地說，顏色百分位標記是10%或更大(例如，30%或更大，40%或更大，50%或更大，60%或更大)。通常，但并不總是，如果顏色百分位標記大于20%，則顏色偏移值小于12.4。
[0077]在一些實施例中，可選地執(zhí)行一個或多個假像排除步驟，以便進一步細化從該組代表性紅血細胞當中識別網狀細胞。這些假像排除步驟可以在上面針對顏色和面積截止值所述的比較之前，在比較之后，或既在之前又在之后執(zhí)行。作為一個例子，基于與特定代表性細胞相對應的像素在不同波長上的光密度的統(tǒng)計分析的假像排除步驟可以用于排除作為假像的細胞而不是細胞。在多種波長(例如，照射波長)上的光密度可以用于假像排除。作為一個例子，已經發(fā)現藍色、黃色、和綠色波長可用于這個目的。
[0078]一般說來，可以將具有像素的光密度的標準偏差大的一組相關像素的細胞分類成假像而不是細胞，因為高標準偏差可以指示非尋常細胞形態(tài)、重疊細胞、和/或不良細胞保存。這樣的細胞一般不適合作進一步分析。作為一個例子，如果下式成立，則可以作為假像排除一組相關像素的細胞:
[0079]σ QD (y) > σ y 或 σ QD (g) > σ g 或 σ QD (b) > σ b (5)
[0080]其中0m(y)、o0D (g)和0ffl(b)分別是與利用黃色、綠色和藍色照射波長獲取的圖像相對應的該組像素的光密度的標準偏差，以及oy、\和Ob是標準偏差截止值。一般說來，可以從如上所述的訓練數據的分析中和/或從歷史數據(例如，來自以前分析細胞圖像的數據)中確定適當標準偏差截止值。在一些實施例中，例如，適當標準偏差截止值是O y=0.1，O g=0.099，以及O b=0.058?？梢园凑諛悠返男再|、訓練方案、和成像條件改變這些數值。作為一個例子，在某些實施例中，適當標準偏差截止值是Gy=0.079，og=0.085，以及ο b=0.060。
[0081]上述的網狀細胞識別實施例也可以用于識別旨在用在像本文公開的系統(tǒng)那樣的自動樣品測量系統(tǒng)上的質量控制復合物中的網狀細胞。質量控制復合物通常包括多種類型的保存哺乳動物血液細胞，被設計成當在自動系統(tǒng)上處理時模擬全血樣品。反過來，這些樣品的分析結果可以用于評估自動系統(tǒng)的性能，例如，識別網狀細胞的系統(tǒng)精度和可再現性。在某些質量控制復合物中，與患者的血液樣品中的網狀細胞相比，保存過程顯著降低了控制樣品中的網狀細胞的大?。辉谀承┣闆r下，這樣復合物中的網狀細胞小于成熟紅血細胞成分。因此，不使用面積分析地依靠上述的顏色分析的網狀細胞識別實施例可以用于精確檢測某些質量控制復合物內的網狀細胞。
[0082](ii)識別一纟目代表件紅血細朐
[0083]返回到圖2，流程圖200中的第一步驟202牽涉到從使用本文所述的系統(tǒng)和方法獲得的樣品的圖像中的細胞當中識別一組代表性紅血細胞。步驟204中的網狀細胞識別出現在已經從樣品的圖像中識別了該組代表性紅血細胞之后；因此，該組代表性紅血細胞通常包括成熟紅細胞和網狀細胞。然后，在可選步驟206中，像,例如，網狀細胞血紅蛋白測量值那樣，確定一個或多個特征和度量。就本公開而言，網狀細胞特征和度量的確定被顯示成單獨步驟206。但是，在一些實施例中，像面積、周長、和形狀那樣的某些網狀細胞特征和度量作為步驟202 (例如，識別一組代表性紅血細胞)的一部分來測量?，F在更詳細地描述這個識別一組代表性紅血細胞的步驟202。
[0084]利用經由檢測器106獲得的圖像，可以將樣品圖像中的每個像素的強度值與用在選擇一組代表性細胞中，以及隨后假像排除、特征測量和網狀細胞識別中的光密度值相關聯。給定圖像像素(x，y)上的透射光強度T (x，y)與通過樣品與那個像素相對應的部分的入射光的吸收系數α和路徑長度ε (x，y)有關:
[0085]T(x，y)=l(ra.E(x’y)(6)
[0086]對于圖像中的每個像素，像素強度與最大可能像素強度的比值(例如，在8位分辨率上，像素強度/255)代表在像素的空間地點上透射的光的比例。透射光的比例可以通過采用方程(6)的對數，以光密度(OD)為單位表達:
[0087]OD(x, y) =-log(T) = a.ε (χ, y)(7)
[0088]可以對樣品圖像中的每個像素重復這個過程。這樣,每個圖像中的每個像素上的光密度對應于與該像素相對應的地點上樣品中的吸收材料的總量(例如，吸收系數與厚度的乘積)。
[0089]圖4示出了包括從血液的制備好樣品的圖像中選擇一組代表性紅血細胞的一系列步驟的流程圖420。在獲取樣品的圖像之后，電子控制系統(tǒng)108，尤其電子處理器114處理圖像信息，以便將包括在該組代表性紅血細胞中的細胞與存在于樣品中的其它細胞類型(例如，白血細胞和血小板)、細胞團、和假像區(qū)分開。
[0090]首先，在圖4中的步驟422中，系統(tǒng)100定位一個或多個樣品圖像中的紅血細胞(例如，成熟紅血細胞和網狀 細胞)以便作進一步處理。紅血細胞通常由于在細胞中存在血紅蛋白而吸收藍光(例如，415nm)。但是，白血細胞不包含血紅蛋白，因此不會以與紅血細胞相同的方式吸收藍光。在藍光下獲得的樣品的圖像可以用于識別紅血細胞；在這樣的圖像中，白血細胞表現得較淡和失真，因為這些細胞最低程度地吸收藍光，從而降低對圖像的貢獻，通常使它們變得不可識別。
[0091]在一些實施例中，可以使用加閾(thresholding)步驟來保證系統(tǒng)100只識別紅血細胞作進一步分析。例如，系統(tǒng)100可以只利用強度(或灰度)值低于160的圖像像素(對于以8位分辨率捕獲的圖像)。范圍從100到180的其它強度值閾值可以用于從圖像中識別紅血細胞，而將白血細胞排除在進一步考慮之外。
[0092]接著，在步驟424中，系統(tǒng)100為樣品圖像中的每個紅血細胞識別一組像素。多種不同方法可以用于識別與細胞相聯系的像素組。例如，在一些實施例中，系統(tǒng)100使用相連成分標記過程執(zhí)行識別步驟。這個過程將來自樣品圖像的各個像素與圖像中的對象相關聯。例如，將不被指定為背景的像素分開的任何兩個像素指定給相同細胞。
[0093]另外，系統(tǒng)100可以排除位于細胞的邊界區(qū)域內的像素作與，例如，細胞體積或成分分析有關的某些測量。尤其，紅血細胞由于這些細胞折射照射光的方式而往往具有又厚又暗的邊界。由于這種折射，這些像素的光密度通常是不可靠的。在完成了相連成分標記過程之后，系統(tǒng)100可以將像素模糊層腐蝕應用于所識別細胞，以除去像素的最外面η個層(例如，與折射最大的邊界區(qū)相對應的像素)。一般說來，取決于圖像的放大倍數，像素模糊層腐蝕可以被選成除去任何數量η的像素層(例如，一個像素層或更多像素層、兩個像素層或更多像素層、三個像素層或更多像素層、四個像素層或更多像素層、五個像素層或更多像素層、六個像素層或更多像素層、八個像素層或更多像素層、十個像素層或更多像素層)。例如，已經通過實驗確定，對于每個像素對應于細胞等于0.148ymX0.148 μ m的部分的紅血細胞，包含紅血細胞周圍的最外面0.5μπι的像素模糊層腐蝕一般適合顯著降低對細胞體積和血紅蛋白含量的測量值的錯誤貢獻。利用通過模糊層腐蝕校正的像素組，可以測量各種細胞特征，譬如，對細胞體積和成分分析有貢獻的每個細胞的平均和最大光密度。
[0094]在步驟426中，系統(tǒng)100繼續(xù)執(zhí)行通過確認該組只包含完整和正常形狀和大小的紅血細胞，從樣品圖像中識別一組代表性紅血細胞的過程。一般說來，步驟426起在該組代表性紅血細胞中丟棄殘缺細胞、重疊細胞、細胞團、血小板、和來自夾雜物的非細胞假像的作用。例如，可以將被圖像幀的邊緣切割或與圖像幀的邊緣接觸的細胞排除在進一步分析之外，從而防止不精確測量。另外，可以將在確定的細胞體積中可以呈現與它們的非標準形狀有關的變化的畸形細胞排除在該分析之外。并且，可以將用于計算細胞體積或成分含量時可能不可靠的、從重疊細胞中獲得的測量結果排除在該組代表性細胞之外。由于這些原因，在步驟426中檢驗每個所識別細胞的形狀，并將畸形和/或重疊細胞排除在進一步分析之外。
[0095]多種不同方法可以用于檢驗所識別細胞的形狀。例如，在一些實施例中，可以通過比較細胞的周長和面積檢驗每個細胞的形狀。圖5示出了這樣比較的示意圖。在圖5中，細胞500被識別成樣品圖像中的一組像素。與細胞500的邊界相對應的像素為了示范的目的，在圖5中被加上比內部像素淺的陰影，但在實際圖像中它們未必表現為這樣。細胞500的面積可以計數該組中的像素的數量來確定。
[0096]像素周長通過使用與細胞500相對應的該組像素從邊界像素中確定。這可以通過連接通過每個周圍像素的中心的線以便在圖像中形成多邊形，并測量該多邊形的周長來完成。確定這個細胞周長值的平方與細胞面積值(即，多邊形的面積)的比率來檢驗細胞的形狀。對于理想的、完美的圓形細胞，這個比率的數值是4π。該比率的數值隨著細胞形狀偏離圓形輪廓而增大。使用這條準則，將周長的平方與面積的比率超過4 π的最小值達到閾值或更大的細胞排除在進一步分析之外。通常，該閾值是4π的最小值的百分之幾(例如，5%或更大、10%或更大、15%或更大、20%或更大、25%或更大)。
[0097]除了將單獨畸形細胞排除在進一步分析之外以外，上面討論的過程也可以排除重疊細胞。在樣品圖像中，重疊細胞通常表現為較大、單獨畸形細胞(透射光強度的變化由入射光傳過的材料的厚度增加引起)。當將分析算法應用于這樣的圖像時，重疊細胞一般被識別成單個較大細胞。這樣，當進行細胞周長和面積的比較時，其比率遠遠落在相對于理想值的允許偏差的閾值之外，并且排除了重疊細胞。
[0098]檢驗所識別細胞的形狀的另一種方法利用上述的細胞輪廓的多邊形表示的凸包，并將凸包圍住的面積與從圖像像素中確定的細胞面積相比較。凸包面積與細胞面積的高比率可以用于識別不規(guī)則形狀細胞，并將這樣的細胞排除在進一步分析之外。圖6是包括兩個細胞600Α和600Β的示意圖。細胞600Α和600Β的周線在圖6中被分別標記成602Α和602Β。圍繞細胞600Α畫出凸包604Α，圍繞細胞600Β畫出凸包604Β。如圖6所示，凸包面積與細胞面積之間的差異對于細胞600Α來說大于細胞600Β。鑒于細胞600Α的高度不規(guī)則性，可以將細胞600A排除在該組代表性紅血細胞之外。
[0099]在一些實施例中，細胞面積測量值可以用在步驟426中將假像和重疊細胞排除在該組代表性紅血細胞之外。例如，對于包括網狀細胞識別的紅血細胞測量來說，可以只考慮面積范圍從35平方微米到65平方微米的細胞。面積小于35平方微米的成像物體通常不是紅血細胞，而是像樣品中的一?；覊m那樣的假像。類似地，面積大于65平方微米的成像物體通常也不是紅血細胞；這樣的物體可能對應于一滴染色劑或幾個重疊細胞。雖然前面的例子描述了 36到65平方微米的范圍，但其它范圍也可以用于選擇要測量的紅血細胞(例如，20平方微米到80平方微米)。并且該范圍可以根據樣品中的平均細胞大小來縮放，從而計及隨患者的變化性。已經通過實驗確定，雖然35到65平方微米范圍可以排除一些紅血細胞，但這樣的范圍與20到80平方微米范圍相比，在從樣品圖像中消除假像方面更加有效。
[0100]光密度值可以用于選擇樣品中的該組代表性紅血細胞。例如，如果在藍光下成像的物體的平均光密度值太低，則該物體可能是白血細胞核而不是紅血細胞?？梢詫⑵骄饷芏乳撝?例如，平均光密度小于等于0.33)用于使用藍光獲取的圖像，將白血細胞排除在該樣品的該組代表性紅血細胞之外(例如，平均光密度小于等于0.33的細胞有可能是白血細胞)。對于在藍光或黃光照射下獲得的圖像，物體超過某個閾值的平均光密度值(例如，大于等于0.66的平均光密度值)可以用于識別可以排除在進一步分析之外的堆疊、重疊、和/或成團紅血細胞(例如，平均光密度值大于等于0.66的紅血細胞有可能與另一個紅血細胞重疊)。
[0101]在步驟428中以最終確定了要作進一步分析的一組代表性細胞而終止顯示在圖4中的過程。如上所述，然后可以使用該代表組內的細胞的測量特征進行網狀細胞識別。
[0102](iii)確定網 狀細胞度暈和特征
[0103]回到圖2，在步驟202中識別了該組代表性紅血細胞，以及在步驟204中在紅血細胞當中定位(以及可選地計數)了網狀細胞之后，可以在步驟206中可選地確定一個或多個網狀細胞度量和特征。如上所討論，可以在步驟202期間在識別該組代表性紅血細胞的同時確定包括網狀細胞面積、形狀、周長、大小、和光密度的一些網狀細胞特征。這些特征也可以在步驟206中確定。另外，可以在步驟206中確定與網狀細胞相聯系的其它特征和度量。例如，本文公開的系統(tǒng)和方法可以使用網狀細胞圖像特征的組合來計算像體積那樣的網狀細胞度量和像血紅蛋白含量那樣的成分值。該組合通常包括(但不限于)本發(fā)明人已經發(fā)現為多種多樣樣品產生精確、可再現結果的這樣網狀細胞特征的組合。
[0104]一旦如上所述在該組代表性紅血細胞當中定位了網狀細胞，可以根據系統(tǒng)100獲得的細胞的一個或多個圖像為每個網狀細胞計算本文公開的一些或所有特征?？梢詾榫W狀細胞計算的第一組特征是可以按如下確定的特定顏色綜合光密度IOD(C):
[0105]IOD(C)=A.0Dmean(C)(8)
[0106]其中A是網狀細胞的面積，以及0D_n(c)是用顏色c的光照射網狀細胞時網狀細胞的圖像中的平均光密度。如果在不同照射波長上獲取網狀細胞的圖像，則可以在每個照射波長上為網狀細胞計算IOD(C)的數值。圖7示出了通過結合流程圖420所述的過程識別的代表性網狀細胞700的、利用顏色c的光照射獲得的示意性圖像。網狀細胞700的圖像包括多個像素。網狀細胞700中的像素的平均光密度ODnrean(C)對應于圖7中的像素強度的總和除以圖像中的像素數量。
[0107]可以為每個網狀細胞計算的第二組特征是網狀細胞的特定顏色體積Vol (C)。圖7中的網狀細胞700的體積通過對與網狀細胞700相對應的每個像素求和光密度值來計算。首先，可以按如下估計每個像素上的網狀細胞700的“高度”:
【權利要求】
1.一種識別沉積在襯底上的血液樣品中的網狀細胞的方法，該方法包含: 用在兩個不同波長上的入射光照射樣品，獲取與第一個波長相對應的樣品的二維圖像，以及獲取與第二個波長相對應的樣品的二維圖像； 分析圖像以識別一組代表性紅血細胞； 確定該組中的每個紅血細胞的面積； 確定該組中的每個紅血細胞的色值；以及 對于該組中的每個紅血細胞，如果紅血細胞的面積超過面積截止值以及紅血細胞的色值小于顏色截止值，則將該紅血細胞識別成網狀細胞， 其中每個紅血細胞的色值包含紅血細胞在兩個照射波長上的光密度值之間的差值。
2.如權利要求1所述的方法，其中波長之一在400nm與457nm之間，以及另一個波長在575nm 與 600nm 之間。
3.如權利要求1所述的方法，其中確定每個所識別紅血細胞的色值包含，對于每個紅血細胞: 確定與該細胞相聯系的一組像素； 對于該組像素的每一個，確定與第一波長相對應的光密度； 對于該組像素的每一個，確定與第二波長相對應的光密度； 對于該組像素，確定與第一波長相對應的平均光密度；· 對于該組像素，確定與第二波長相對應的平均光密度；以及 計算平均光密度之間的差值以確定該細胞的色值。
4.如權利要求1所述的方法，其中確定該組中的每個紅血細胞的面積包含，對于每個紅血細胞: 確定與該細胞相聯系的一組像素；以及 通過計數該組中的像素的數量確定該細胞的面積。
5.如權利要求1所述的方法，其中確定該組中的每個紅血細胞的面積包含，對于每個紅血細胞: 確定與該細胞相聯系的一組像素； 確定圍繞該組像素的多邊形；以及 通過計算多邊形的面積確定該細胞的面積。
6.如權利要求1所述的方法，其中該顏色截止值基于紅血細胞的色值分布的百分位。
7.如權利要求6所述的方法，其中該百分位對應于紅血細胞的色值分布內的70%。
8.如權利要求6所述的方法，其中該顏色截止值對應于百分位與顏色偏移值之和。
9.如權利要求8所述的方法，進一步包含根據已知網狀細胞的數量的一組訓練數據確定百分位和顏色偏移值。
10.如權利要求1所述的方法，其中該面積截止值基于紅血細胞的面積分布的百分位。
11.如權利要求10所述的方法，其中該百分位對應于紅血細胞的面積分布的20%。
12.如權利要求10所述的方法，其中該面積截止值對應于百分位與面積偏移值之和。
13.如權利要求12所述的方法，進一步包含根據已知網狀細胞的數量的一組訓練數據確定百分位和面積偏移值。
14.如權利要求1所述的方法，進一步包含如果與紅血細胞相聯系的像素在兩個波長之一上的光密度的標準偏差大于截止值，則從該代表組中排除該紅血細胞。
15.如權利要求1所述的方法，進一步包含如果與紅血細胞相聯系的像素在不同于該兩個波長的波長上的光密度的標準偏差大于截止值，則從該代表組中排除該紅血細胞。
16.如權利要求1所述的方法，進一步包含，對于識別為網狀細胞的每個紅血細胞，確定網狀細胞的體積。
17.如權利要求16所述的方法，進一步包含根據與多個照射波長相對應的網狀細胞的綜合光密度確定網狀細胞的體積。
18.如權利要求17所述的方法，進一步包含為樣品確定平均網狀細胞體積參數。
19.如權利要求1所述的方法，進一步包含，對于識別為網狀細胞的每個紅血細胞，確定網狀細胞的血紅蛋白含量。
20.如權利要求19所述的方法，進一步包含根據網狀細胞的面積、與多個照射波長相對應的網狀細胞的體積、和與多個照射波長相對應的網狀細胞的綜合光密度的加權組合，確定網狀細胞的血紅蛋白含量。
21.如權利要求19所述的方法，進一步包含為樣品確定平均網狀細胞血紅蛋白值。
22.一種識別沉積在襯底上的血液樣品中的網狀細胞的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含: 光源，配置成用在兩個不同波長上的入射光照射樣品； 檢測器，配置成獲取與第一個波長相對應的樣品的二維圖像和獲取與第二個波長相對應的樣品的二維圖像；以及`電子處理器，配置成: 分析圖像以識別一組代表性紅血細胞； 確定該組中的每個紅血細胞的面積； 確定該組中的每個紅血細胞的色值；以及 對于該組中的每個紅血細胞，如果紅血細胞的面積超過面積截止值以及紅血細胞的色值小于顏色截止值，則將該紅血細胞識別成網狀細胞， 其中該電子處理器被配置成根據紅血細胞在兩個照射波長上的光密度值之間的差值確定每個紅血細胞的色值。
23.如權利要求22所述的系統(tǒng)，其中第一波長在400nm與457nm之間，第二波長在575nm 與 600nm 之間。
24.如權利要求22所述的系統(tǒng)，其中對于該組中的每個紅血細胞，該電子處理器被配置成通過如下步驟確定該細胞的色值: 確定與該細胞相聯系的一組像素； 對于該組像素的每一個，確定與第一波長相對應的光密度； 對于該組像素的每一個，確定與第二波長相對應的光密度； 對于該組像素，確定與第一波長相對應的平均光密度； 對于該組像素，確定與第二波長相對應的平均光密度；以及 計算平均光密度之間的差值以確定該細胞的色值。
25.如權利要求22所述的系統(tǒng)，其中對于該組中的每個紅血細胞，該電子處理器被配置成通過如下步驟確定該細胞的面積: 確定與該細胞相聯系的一組像素；以及通過計數該組中的像素的數量確定該細胞的面積。
26.如權利要求22所述的系統(tǒng)，其中對于每個紅血細胞，該電子處理器被配置成通過如下步驟確定該細胞的面積: 確定與該細胞相聯系的一組像素； 確定圍繞該組像素的多邊形；以及 通過計算多邊形的面積確定該細胞的面積。
27.如權利要求22所述的系統(tǒng)，其中該電子處理器被配置成根據紅血細胞的色值分布的百分位確定顏色截止值。
28.如權利要求27所述的系統(tǒng)，其中該百分位對應于紅血細胞的色值分布內的70%。
29.如權利要求27所述的系統(tǒng)，其中該電子處理器被配置成將該顏色截止值確定為百分位與顏色偏移值之和。
30.如權利要求29所述的系統(tǒng)，其中該電子處理器被配置成根據已知網狀細胞的數量的一組訓練數據確定百分位和顏色偏移值。
31.如權利要求22所述的系統(tǒng)，其中該電子處理器被配置成根據紅血細胞的面積分布的百分位確定面積截止值。
32.如權利要求31所述的系統(tǒng)，其中該百分位對應于紅血細胞的面積分布的20%。
33.如權利要求31所述的系統(tǒng)，其中該電子處理器被配置成將該面積截止值確定為百分位與面積偏移值之和。`
34.如權利要求33所述的系統(tǒng)，其中該電子處理器被配置成根據已知網狀細胞的數量的一組訓練數據確定百分位和面積偏移值。
35.如權利要求22所述的系統(tǒng)，其中該電子處理器被配置成如果與紅血細胞相聯系的像素在兩個波長之一上的光密度的標準偏差大于截止值，則從該代表組中排除該紅血細胞。
36.如權利要求22所述的系統(tǒng)，其中該電子處理器被配置成如果與紅血細胞相聯系的像素在不同于該兩個波長的波長上的光密度的標準偏差大于截止值，則從該代表組中排除該紅血細胞。
37.如權利要求22所述的系統(tǒng)，其中對于識別為網狀細胞的每個紅血細胞，該電子處理器被配置成確定網狀細胞的體積。
38.如權利要求37所述的系統(tǒng)，其中該電子處理器被配置成根據與多個照射波長相對應的網狀細胞的綜合光密度確定網狀細胞的體積。
39.如權利要求38所述的系統(tǒng)，其中該電子處理器被配置成為樣品確定平均網狀細胞體積參數。
40.如權利要求22所述的系統(tǒng)，其中對于識別為網狀細胞的每個紅血細胞，該電子處理器被配置成確定網狀細胞的血紅蛋白含量。
41.如權利要求40所述的系統(tǒng)，其中該電子處理器被配置成根據網狀細胞的面積、與多個照射波長相對應的網狀細胞的體積、和與多個照射波長相對應的網狀細胞的綜合光密度的加權組合，確定網狀細胞的血紅蛋白含量。
42.如權利要求40所述的系統(tǒng)，其中該電子處理器被配置成為樣品確定平均網狀細胞血紅蛋白值。
【文檔編號】G06T7/00GK103827658SQ201280046523
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2012年7月13日 優(yōu)先權日:2011年7月22日
【發(fā)明者】M.扎尼瑟, R.扎尼瑟 申請人:羅氏血液診斷股份有限公司