本發(fā)明屬于制藥領(lǐng)域，具體涉及一種七葉皂苷A的制備方法。

背景技術(shù)：
七葉皂苷又稱七葉皂苷酸，為從七葉樹科屬植物種子提取得到的總皂苷、β-七葉皂苷或異七葉皂苷等的總稱，屬于三萜皂苷類。七葉皂苷的水溶解度較差，為增加其溶解度，常將其制成鈉鹽。七葉皂苷中含有很多種皂苷化合物，我國國家標(biāo)準(zhǔn)按液相出峰前后，依次命名為七葉皂苷A、七葉皂苷B、七葉皂苷C和七葉皂苷D。他們互為同分異構(gòu)體(見附圖1)，目前用于臨床上的七葉皂苷鈉是由七葉皂苷A、七葉皂苷B、七葉皂苷C和七葉皂苷D以及其它成分組成的鈉鹽混合物。七葉皂苷鈉長期使用過程中發(fā)現(xiàn)藥物對肌肉和粘膜具有強(qiáng)刺激作用，患者易出現(xiàn)靜脈炎等副作用。此外，部分皂苷類成分具有溶血作用。由于七葉皂苷鈉組合物的組分較多，七葉皂苷鈉中雜質(zhì)的定性和定量控制幾乎無法實(shí)現(xiàn)。這種不可控性會導(dǎo)致七葉皂苷鈉產(chǎn)品的質(zhì)量的均一性和安全性難以得到保證，特別是血管刺激性等不良反應(yīng)難以掌控。因此，對七葉皂苷的各單體的分離、藥理活性和毒理性質(zhì)的研究并篩選出最適合臨床用藥的更優(yōu)單體顯得尤為重要。藥理實(shí)驗(yàn)研究表明，與七葉皂苷鈉組合物相比，七葉皂苷A的藥理活性最強(qiáng)，因此嚴(yán)重腦水腫的臨床治療效果更優(yōu)。此外，高純度的七葉皂苷A可解決目前七葉皂苷鈉產(chǎn)品質(zhì)量的均一性和安全性難以得到保證，肌肉和血管刺激性等不良反應(yīng)難以掌控等問題。因此，七葉皂苷A的制備和開發(fā)具有重大的臨床意義。現(xiàn)有技術(shù)中，提取七葉皂苷A主要通過制備液相分離的方法來實(shí)現(xiàn)。CN102532242公開了一種制備七葉皂苷單體A的方法。它是以七葉皂苷為原料，用己烷-氯仿-甲醇-水溶液系統(tǒng)和己烷-乙酸乙酯-甲醇-磷酸水(pH1-3)溶液系統(tǒng)，采用高速逆流色譜方法兩次分離制得高純度七葉皂苷A。該方法生產(chǎn)成本高，生產(chǎn)效率低，且難以工業(yè)化生產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種高純度、高收率的七葉皂苷A的制備方法。該方法設(shè)備要求低、純化費(fèi)用低、毒性小、環(huán)境污染少，適合工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明提供的七葉皂苷A制備方法包括以下步驟：1)以娑羅子為原料，用乙醇提取，收集提取液并濃縮；2)將步驟1)得到的濃縮液調(diào)節(jié)pH至2～3，然后用水飽和的正丁醇萃取，分離有機(jī)層并濃縮；3)將步驟2)得到的濃縮液加入到2～5倍體積的丙酮/甲基叔丁基醚混合溶液中，攪拌下加熱回流，然后冷卻析晶并干燥；4)將干燥后的晶體溶解于熱水中，然后再次冷卻析晶并干燥；5)將二次析晶后的固體溶解到有機(jī)溶劑中，然后再向有機(jī)溶劑中加入占二次析晶后的固體重量的10-20％的L-脯氨酸，加熱回流10～60min后再冷卻到40-50℃，此時加入少量七葉皂苷B作為晶種，繼續(xù)攪拌冷卻至0-20℃析晶，直到白色晶體不再析出，抽濾或離心，將濾液減壓蒸餾去除有機(jī)溶劑得到濃縮液；6)將步驟5)得到的濃縮液加入至4-8倍體積的水/四氫呋喃混合溶劑中，調(diào)節(jié)pH至3-4，攪拌升溫至80-100℃并回流10-60min，然后將溶液緩慢冷卻析晶，抽濾或離心，將固體烘干，得七葉皂苷A。優(yōu)選地，步驟1)中的乙醇為質(zhì)量濃度為30-70％的乙醇水溶液。優(yōu)選地，步驟3)中的丙酮/甲基叔丁基醚混合溶液中，丙酮與甲基叔丁基醚的體積比為2-8∶1。優(yōu)選地，步驟5)中的有機(jī)溶劑為乙醇/正己烷混合溶劑，所述乙醇與正己烷的體積比為10-30∶1。優(yōu)選地，步驟5)中，所述L-脯氨酸占二次析晶后的固體重量的15％。優(yōu)選地，步驟6)中，所述水/四氫呋喃混合溶劑，水與四氫呋喃的體積比為3-5∶1。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明針對七葉皂苷A單體制備存在的問題，首次采用了手性氨基酸——L-脯氨酸誘導(dǎo)重結(jié)晶，先從β-七葉皂苷中分離除去七葉皂苷B，再從濃縮液中析晶獲得高純度、高收率的七葉皂苷A，本發(fā)明避免了使用柱層析、離子交換樹脂等方法，具有操作簡便、設(shè)備要求低、純化費(fèi)用低、毒性小、環(huán)境污染少，可執(zhí)行性好、適合工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。與七葉皂苷相比，七葉皂苷A的藥理活性最強(qiáng)，因此嚴(yán)重腦水腫的臨床治療效果更優(yōu)。此外，高純度的七葉皂苷A作為單一有效組分，能夠從根本上解決目前七葉皂苷鈉組合物產(chǎn)品質(zhì)量的均一性和安全性等問題。附圖說明圖1是七葉皂苷A、B、C、D的結(jié)構(gòu)式。具體實(shí)施方式以下通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地說明。實(shí)施例11)提取：取娑羅子粉末1kg提取兩次，每次用10L質(zhì)量濃度為70％的乙醇水溶液，45℃攪拌提取2h，過濾，將兩次過濾的濾液合并，在減壓條件下旋轉(zhuǎn)回收溶劑并濃縮至2L；2)萃?。簩⒉襟E1)中得到的濃縮液用1mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH至2，用2L的水飽和的正丁醇萃取3次，合并有機(jī)層并濃縮至400mL；3)第一次析晶：將步驟2)得到的濃縮液加入到960mL丙酮和240mL甲基叔丁基醚混合溶劑中，攪拌下加熱回流，然后冷卻至20℃析出白色沉淀，過濾、45℃干燥得白色晶體49g；4)第二次析晶：將步驟3)得到的49g晶體溶解于200mL的100℃的熱水中，攪拌20min，然后將溶液冷卻至0℃，析出白色固體，抽濾，將固體在45℃條件下烘干，得β-七葉皂苷32g；5)七葉皂苷B的去除：將步驟4)得到的32gβ-七葉皂苷溶解于300mL乙醇和15mL正己烷混合溶劑中，向上述體系加入4.8gL-脯氨酸，加熱回流30min，將體系冷卻到50℃，此時加入0.2g純度達(dá)98％的七葉皂苷B作為晶種，繼續(xù)攪拌冷卻至20℃，析晶，直到白色晶體不再析出，抽濾，將濾液減壓蒸餾去除有機(jī)溶劑得到濃縮液60ml；6)七葉皂苷A的分離：將步驟5)得到的60ml濃縮液加入至240ml水和60ml四氫呋喃混合溶劑中，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至3，攪拌升溫至100℃并回流30min，然后將溶液緩慢冷卻至0℃析晶，抽濾，將固體烘干，得七葉皂苷A13.4g。本實(shí)施例中，步驟1)的目的是將七葉總皂苷從娑羅子中提取分離出來，這是娑羅子總皂苷提取的常規(guī)工藝，提取方法可以采用本領(lǐng)域常用的回流、浸泡、滲漏等方法。其中，乙醇的濃度會對七葉總皂苷的純度、收率產(chǎn)生重要影響，乙醇濃度過低會導(dǎo)致產(chǎn)物提取不充分，乙醇濃度過高會導(dǎo)致雜質(zhì)含量增加。步驟2)的萃取和步驟3)、4)的兩次析晶目的都是純化提取物，得到高純度的β-七葉皂苷。其中，調(diào)節(jié)pH的目的是提高七葉皂苷的穩(wěn)定性和萃取效率，pH過高會導(dǎo)致七葉皂苷的水溶性增加，正丁醇萃取效率降低；pH過低會降低七葉皂苷的穩(wěn)定性。步驟(3)中丙酮與甲基叔丁基醚的比例會影響七葉皂苷晶體的析出速度和收率。步驟5)中的有機(jī)溶劑還可以選擇甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮、四氫呋喃、甲基叔丁基醚、正己烷、正庚烷等中的一種或者多種的任意混合，目的是使β-七葉皂苷能很好的溶解，同時又能在誘導(dǎo)重結(jié)晶中能更好地析出七葉皂苷B。L-脯氨酸的用量直接影響了七葉皂苷B的分離和析出，本實(shí)施例七葉皂苷B不僅能夠選擇性地順利析出晶體，并且收率和純度都較高，晶體形態(tài)好。步驟6)中，選擇水/四氫呋喃混合溶劑，能使七葉皂苷A較好地析出，從而將七葉皂苷A與L-脯氨酸和其它七葉皂苷組分分離。調(diào)節(jié)pH的目的一是減少L-脯氨酸的殘余量，二是防止七葉皂苷A降解和轉(zhuǎn)化。采用高效液相法對產(chǎn)物中的七葉皂苷A進(jìn)行檢測，結(jié)果產(chǎn)物中七葉皂苷A的含量為96.4％，收率(產(chǎn)物中七葉皂苷A的總量占投料娑羅子中七葉皂苷A的總量的百分比)為53％。實(shí)施例21)提?。喝℃读_子粉末1kg回流提取三次，每次用6L質(zhì)量濃度為30％的乙醇水溶液，過濾，將濾液合并，在減壓條件下旋轉(zhuǎn)回收溶劑并濃縮至2L；2)萃取：將步驟1)中得到的濃縮液用3mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH至3，用水飽和的正丁醇萃取3次，合并有機(jī)層并濃縮至200mL；3)第一次析晶：將步驟2)得到的濃縮液加入到300mL丙酮和100mL甲基叔丁基醚混合溶劑中，攪拌下加熱回流，然后冷卻至析出白色沉淀，過濾、干燥得白色晶體38g；4)第二次析晶：將步驟3)得到的38g七葉皂苷晶體溶解于100ml80℃的熱水中，攪拌60min，然后將溶液冷卻析出白色固體，抽濾，將固體烘干，得β-七葉皂苷27g；5)七葉皂苷B的去除：將步驟4)得到的27gβ-七葉皂苷溶解于150mL乙醇和15mL正己烷混合溶劑中，向上述體系加入2.7gL-脯氨酸，加熱回流10min，將反應(yīng)體系冷卻到45℃，此時加入0.1g七葉皂苷B作為晶種，繼續(xù)攪拌冷卻至20℃，析晶，直到白色晶體不再析出，抽濾，將濾液減壓蒸餾去除有機(jī)溶劑得到濃縮液50ml；6)七葉皂苷A的分離：將步驟5)得到的50ml濃縮液加入至300ml水和100ml四氫呋喃混合溶劑中，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至3，攪拌升溫至80℃并回流60min，然后將溶液緩慢冷卻至0℃析晶，抽濾，將固體烘干，得七葉皂苷A12.1g。產(chǎn)物中七葉皂苷A的含量為96.1％，收率為47.7％。實(shí)施例31)提?。喝℃读_子粉末1kg回流提取二次，每次用15L質(zhì)量濃度為50％的乙醇水溶液，過濾，將濾液合并，在減壓條件下旋轉(zhuǎn)回收溶劑并濃縮至3L；2)萃取：將步驟1)中得到的濃縮液用0.5mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH至3，用水飽和的正丁醇萃取5次，合并有機(jī)層并濃縮至300mL；3)第一次析晶：將步驟2)得到的濃縮液加入到1200mL丙酮和150mL甲基叔丁基醚混合溶劑中，攪拌下加熱回流，然后冷卻至析出白色沉淀，過濾、干燥得白色晶體43g；4)第二次析晶：將步驟3)得到的43g七葉皂苷晶體溶解于215mL的沸水中，攪拌30min，然后將溶液冷卻析出白色固體，離心，將固體烘干，得β-七葉皂苷29g；5)七葉皂苷成品的制備：將步驟4)得到的29gβ-七葉皂苷溶解于300mL乙醇和10mL正己烷混合溶劑中，向上述體系加入5.8gL-脯氨酸，加熱回流60min，將反應(yīng)體系冷卻到40℃，此時加入少量七葉皂苷B作為晶種，繼續(xù)攪拌冷卻至0℃析晶，直到白色晶體不再析出，離心，將濾液減壓蒸餾去除有機(jī)溶劑得到濃縮液30ml；6)七葉皂苷A的分離：將步驟5)得到的30ml濃縮液加入至100ml水和20ml四氫呋喃混合溶劑中，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至4，攪拌升溫至100℃并回流10min，然后將溶液緩慢冷卻析晶，抽濾，將固體烘干，得七葉皂苷A12.7g。產(chǎn)物中七葉皂苷B的含量為95.4％，收率為49.7％。